שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

ניסוי זה נועד לזהות חלבונים נקשרי-ליפידים ולנתח אינטראקציית חלבון-ליפיד בסביבת ממברנה מוגדרת של ליפידים. חלבונים מתוך הומוגנאט של תאים מדגרו עם וסיקולות ליפידיות שהוכנו טריים מפירוספטדין וסרמיד. לאחר מכן, לתערובת התגובה מוסיפים חרוזי מגנט מצומדים ל-Xin V כדי לעגן את החלבונים הקשורים לוסיקולות הליפידיות לחרוזי המגנט. בשלב הבא, וסיקולות ליפידיות-חלבון מופקות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית.

כדי לזהות את התוצאות המודגמות של חלבון קשור ලිפיד, השתמשו ב-SDS page Western blotting כדי להראות ניקוי של PKC אטיפיקלי אנדוגני ורקומביננטי ושל דומיין ספציפי לקשירת קרמיד שהובעו בתאי MDCK. היתרון המרכזי של טכניקה חדשנית זו על פני שיטות קיימות כמו ELISA או ספקטרוסקופיה של תהודה פלזמנית כגון קישור פני, הוא שהאינטראקציה בין הליפיד לחלבון מושגת בסביבה דמוית ממבנה, וכי ניתן לנקות ולנתח את החלבונים הקושרים. ההשלכות של טכניקה זו פועלות לעבר טיפול ואבחון של מחלות המערבות ליפידים, מכיוון שבמחלות אלו, האינטראקציה הפיזיולוגית בין הליפיד לחלבון פגומה.

עבור חלק מהמחלות הללו, יעדי החלבון אינם ידועים כלל ויש לזהותם. כדי לתכנן טיפול מבוסס ליפידים, התחל עם SLEs של ליפידים שהוכנו מתערובת מיובשת של כמויות שוות (equimolar) של phosphatidyl serine ו-C 16 ceramide ב-100 µL של sical buffer. בצע סוניקציה למשך שעה לאחר הוספה של 300 µL של sical buffer, מועשר ב-0.1 mM manganese chloride. סנטריפוג את הדגימות ב-12,000 G למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן השהה מחדש את משקע שלב הבועות הליפידיות הגדולות ב-100 µL של sical buffer. הוסף 1 nM של צבע פלואורסצנטי vibrant cm DII והדגר ב-37 °C למשך שעה כדי להקל על הוויזואליזציה של פראקציית ה-SLE לאחר הפרדה מקסימלית. אסוף משקע ורוד של phosphatidyl serine ו-ceramide SLEs שצבעו vibrant cm dai באמצעות סנטריפוגה, והשהה מחדש ב-100 µL של tris buffer.

בשלב הבא, כדי להכין ליזט תאים נטול דטרגנט, בצעו סוניקציה לתאים ב-300 µL של באפר היפרטוני המכיל 10 mM tris, hydrogen chloride, ומעכבי פרוטאז ופוספטאז, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה. כדי להסיר שיירי ממברנות, הוסיפו כעת את ליזט התאים הצלול לסספנזיה הפיזית של הליפידים והדגירו את התערובת למשך שעתיים ב-4 °C. מכיוון שליזט תאים עשוי להכיל ממברנות אנדוגניות עם phosphate aerin, מומלץ לנקות את הליזט מממברנות אלו באמצעות שלבי צנטריפוגה נוספים.

הוסיפו לתערובת התגובה 20 µL של בופר קישור XNV ו-50 µL של תמיסה המכילה חרוזי מגנט המצומדים ל-XNV, דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C, ובצעו מיון תאים מופעל מגנטית (MACS) בהתאם לפרוטוקול המלץ של היצרן. לאחר מכן, נתרו את פלואורסצנציית ה-CM DII בפרקציות השטיפה (flow through) והאלוציה באמצעות קורא פלואורסצנציה של מיקרו-פלטה, כדי לקבוע את נוכחותם וכמותם של הליפידים במבחן תחרות נוגדנים. כדי לאמת את סגוליות תגובת הקישור של A PKC לוזיקולות ceramide phospho Seine, דגרו 1 µg של נוגדן פוליקלונלי לארנב נגד P KC Zeta עם ליזט תאים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן דגרו עם וזיקולות הליפידים.

המשיכו עם ניתוח SDS page ו-immuno blotting של קישור החלבון לשקיעי ceramide phosphate serine בשטיפה המקסימלית עבור השחזור in vitro של קומפלקס קוטביות של חלבון-ליפיד. התחילו עם הכנת משקוע ורוד של וסיקולות ceramide phosphate serine שצבעו vibrant CM DII כפי שהודגם קודם לכן, השעיקו שוב את הוסיקולות ב-100 µL של tri buffer, בתוספת 100 µM של gamma S GTP, 1 mM של GDP, ושילוב של חלבונים רקומביננטיים רלוונטיים. לאחר מכן, דגרו את התגובה בטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש שעות. השלב הבא הוא הוספת 5 µL של תמיסת מלאי 20x של an X in V buffer ו-50 µL של חרוזי מגנט המשוערים ל-an X in V.

דגרו את התערובת תחת ערבוב עדין למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. המשיכו לבצע מיון תאים מגנטי מופעל (NX NV magnetic activated cell sorting) בהתאם להנחיות של פרוטוקול היצרן כדי להקל על השקיעה. הוסיפו לפרקיית האלוציה (elution fraction) תוספת של 10 micrograms של e albumin טהור.

רכז את החלבונים באמצעות שיקוע weyl flue. הפאזה התחתונה מורכבת מכלורופורם מתנול עם vibrant cm dii מועשר. האינטרפאזה החומית מכילה את החרוזיים המגנטיים ואת החלבון המשוקק.

כמת את וסיקולות הליפידים על ידי זיהוי של cm dii ורוד ותוסס בשלב הכלורופורם-מתנול האורגני של תגובת weyl flu. השתמש בכמויות שוות של וסיקולות ליפידים כדי לנרמל את כמויות החלבון בין הדגימות ובצע ניתוח באמצעות SDS page ו-Immuno blotting.

ליזט נטול דטרגנט של תאי MDCK המבטאים PKC Zetta באורכו המלא, המקושר לקצה C עם חלבון פלואורסצנטי ירוק או עם דומיין קושר סרמיד. הקצה C של PKC Zetta הושרה עם phospho serine.

לאחר שטיפת וסינון של וזיקולות צרמיד מעמודת ה-max, נותחו החלבונים באמצעות אימונו-בלוטינג (immuno blotting). מקטע הקישור לצרמיד C 20 Zeta, EGFP ו-PKC Zeta באורכו המלא התגלו ב-EIT של עמודת ה-max, ממצא העולה בקנה אחד עם הספציפיות והיעילות של פרוצדורת ה-lyx. הביקורת השלילית EGFP, שלא נקשרה לוזיקולות הצרמיד הסורי של הפוספט, לא הייתה ניתנת לזיהוי ב-eit.

כאשר משלבים את Linx עם שיטות נוספות כגון SDS page, western blotting או אנליזת פרוטאומיקה, ניתן לקבל תשובות לשאלות נוספות, כגון אילו חלבונים מרכיבים את קומפלקס החלבונים הקושרים ליפידים. לאחר פיתוחו, LabX סלל את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקר הליפידים הבודדים (S single lipid) לחקור אפופטוזיס המושרה על ידי סרמיד וקיטוב תאים בתאי גזע עצביים ובתאים אפיתליאליים.