שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

ניסוי זה נועד לזהות חלבונים קושרי שומנים ולנתח אינטראקציה של חלבון שומנים בסביבת ממברנה מוגדרת של חלבוני שומנים של תאים הומוגניים מודגרים עם שלפוחיות השומן הטריות שהוכנו מפוספט סיין וסרמיד. לאחר מכן משלימים את תערובת התגובה עם חרוזים מגנטיים מצומדים של Xin V כדי לעגן את החלבון הקשור לשלפוחיות השומנים לחרוזים המגנטיים. לאחר מכן, שלפוחיות שומן החלבון מטוהרות על ידי מיון תאים מופעלים מגנטיים.

כדי לזהות את התוצאות המודגמות של החלבון הקשור לשומן, השתמש בדף SDS Western Blotting כדי להראות טיהור ליקס של PKC לא טיפוסי אנדוגני ורקומביננטי ותחום קשירת סרמיד ספציפי המתבטא בתאי MDCK. היתרון העיקרי של טכניקה חדשנית זו על פני שיטות קיימות כמו אלייזה או ספקטרוסקופיה של תהודה פלזמה כמו קשירת פני השטח, הוא שהאינטראקציה של חלבון השומנים מושגת בסביבה דמוית ממברנה וכי ניתן לטהר ולנתח את חלבוני הקשר. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול ואבחון של מחלות הכוללות שומנים מכיוון שבמחלות אלה, האינטראקציה הפיזיולוגית של חלבון השומנים נפגעת.

עבור חלק מהמחלות הללו, מטרות החלבון אפילו אינן ידועות ויש לזהות אותן כדי לתכנן טיפול מבוסס שומנים, התחילו עם סולות שומנים שהוכנו מתערובת מיובשת של שווי שוויון, כמויות של פוספטידיל סיין וסרמיד C 16 ב-100 מיקרוליטר של בופר סיקלי. סוניקט למשך שעה אחת לאחר הוספת 300 מיקרוליטר של מאגר iCal, בתוספת צנטריפוגה של 0.1 מילי-מולרית מנגן כלוריד הדגימות ב-12,000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז השהה מחדש את הגלולה של שלפוחיות שומנים גדולות ב-100 מיקרוליטר של מאגר סיקלי. הוסף ננו-מולרית אחת של צבע פלואורסצנטי ס"מ DII תוסס ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להקל על הדמיה של שבר הזאבת לאחר הפרדה מקסימלית, שחזר גלולה ורודה של פוספט מוכתם ס"מ תוסס, סרמיד סורי על ידי צנטריפוגה ו-Resus מוציאים ב-100 מיקרוליטר של טריס בופר.

לאחר מכן, להכין תאי סוניקט ללא חומר ניקוי ליזאט ב-300 מיקרוליטר של מאגר היפרטוני של 10 מילי-מולארי טריס, מימן כלורי המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז וצנטריפוגה. כדי להסיר פסולת קרומית, הוסיפו כעת את ליזאט התא השקוף לתרחיף הפיזי השומני ודגרו על התערובת למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. מכיוון שליזטים של תאים עשויים להכיל ממברנות אנדוגניות עם ארין פוספט, מומלץ לנקות את הליזאט מהממברנות הללו על ידי שלבי צנטריפוגה נוספים.

השלם את תערובת התגובה עם 20 מיקרוליטר של מאגר מחייב XNV ו-50 מיקרוליטר של תמיסה המכילה חרוזים מגנטיים מצומדים לדגירה XNV למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס, בצע את מיון התאים המופעלים המגנטיים כפי שהומלץ על ידי פרוטוקול היצרן. לאחר מכן, עקוב אחר הקרינה התוססת של CM DII בשברי הזרימה והפליטה באמצעות קורא פלואורסצנטי מיקרו-פלייט כדי לקבוע את הנוכחות והכמות של ליפידים בבדיקת תחרות נוגדנים. כדי לאמת את הספציפיות של תגובת הקישור של A PKC לסרמיד פוספו, שלפוחיות Seine דוגרות על מיקרוגרם אחד של נוגדן רב-שבטי נגד P KC Zeta עם ליזאט תאים למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן דגירה עם שלפוחיות השומנים.

המשך עם דף SDS וניתוח ספיגה חיסונית של החלבון הקשור לסרמיד פוספט סרין ב-max eluate לבנייה מחדש במבחנה של קומפלקס קוטביות חלבון שומני התחל בהכנת גלולה ורודה של שלפוחיות סרמיד סרמיד פוספט סריאן מוכתמות CM DII תוססות כפי שהוצג קודם לכן, ראוס משהה את השלפוחיות ב-100 מיקרוליטר של tri buffer, בתוספת 100 מיקרו-מולרית גמא S GT P מילי-מולר אחד, תמ"ג ושילוב של חלבונים רקומביננטיים מעניינים. לאחר מכן דגרו על התגובה בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטר של תמיסת מלאי של 20 x של מאגר X ב-V ו-50 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצומדים X ב-V.

דוגרים את התערובת בערבוב עדין למשך 30 דקות נוספות בחום של ארבע מעלות צלזיוס. המשך לבצע את מיון התאים המופעלים המגנטיים NX NV כפי שהומלץ על ידי פרוטוקול היצרן כדי להקל על המשקעים. תוספת של שבר הפליטה עם 10 מיקרוגרם של אלבומין e טהור.

רכז את החלבונים על ידי משקעי ארובה ווייל. השלב התחתון מורכב ממתנול כלורופורם עם ס"מ dii תוסס מועשר. האינטרפאזה החומה מכילה את החרוזים המגנטיים והחלבון המשקע.

כמת את שלפוחיות השומנים על ידי זיהוי של ס"מ dii ורוד ותוסס בשלב המתנול הכלורופורם האורגני של תגובת שפעת הווייל. השתמש בכמויות שוות של שלפוחיות שומנים כדי לנרמל את כמויות החלבון בין הדגימות ולנתח לפי דף SDS. סתם חיסוני.

ליזאט נטול דטרגנטים של תאי MDCK המבטא PKC Zetta C באורך מלא המקושר באופן סופי לחלבון פלואורסצנטי ירוק או לתחום קשירת סרמיד. בקצה C של pkc. זטה הודגרה עם פוספו סיין.

שלפוחיות סרמיד לאחר אלוציאן של העמודה המקסימלית, חלבונים נותחו על ידי כתמים חיסוניים. שבר קשירת הסרמיד C 20 Zeta, EGFP ו-P KC Zeta באורך מלא נמצאו מה-EIT של עמודת המקסימום, בהתאם לספציפיות וליעילות של הליך הליקס. הבקרה השלילית EGFP, שלא נקשרה לפוספט, שלפוחיות הסרמיד הסורי שלנו לא הייתה ניתנת לזיהוי ב-EIT.

כאשר משלימים את Linx עם שיטות אחרות כמו דף SDS וניתוח Western Blotting או פרוטאומיקה, ניתן לענות על שאלות נוספות כמו אילו חלבונים נמצאים בקומפלקס החלבון קושר השומנים. לאחר פיתוחו, LabX סלל את הדרך לחוקרים בתחום המחקר של שומנים בודדים S לחקור אפופטוזיס המושרה על ידי סרמיד וקוטביות תאים בתאי גזע עצבי ואפיתל.