Name: תפוקה גבוהה מדידה סיווג P אורגני דגימות סביבתיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: למד סיווג פוספור אורגני בדגימות קרקע ודשן באמצעות הידרוליזה אנזימטית בנפח גבוה. שיטה זו מסייעת לחוקרים בתחום הכימיה הסביבתית להעריך פוריות קרקע וניהול מזון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים USGS לבין משאבי מים ורמונט אגם המרכז ללימודי למתן מימון.

1. זרחן Extraction <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1 ליטר של הידרוקסיד M 0.25 נתרן (NaOH, 40.00 g / mol) + 0.05 M חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA, 292.24 g / mol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 מ"ל של EDTA פתרון + NaOH עד 2 גרם של אדמה רטובה או יבשה / לדוגמה צינור חרוטי 50 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בהתרגשות עבור 16 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 3000 XG במשך 3 דקות. </li></ol> 2. תמצית לדוגמה pH התאמת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת aliquot 0.1 מ"ל על צינור 1.5 מיקרו צנטריפוגות מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.017 מ"ל של חומצה אצטית M 2.5, 0.144 מ"ל של חיץ M 0.4 אצטט (70.5% של נתרן אצטט [CH 3 COONa, 82.03 g / mol] ו 29.5% של חומצה אצטית, pH 5.0), ו 0.739 מ"ל מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח סופי של תמצית מותאם יהיה 1 מ"ל ו pH הסופי יהיה 5.0. </li></ol> 3. מלאי אנזימים פתרון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של אצטט M 0.1 נתרן (CH 3 COONa, 82.03 g / mol) פתרון, pH 5.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 x 10 phosphatase מ"ל חומצה פתרונות המניות למאגר נתרן אצטט מוכן בשלב 3.1 כך ריכוזי הסופי כל 0.5 יחידות / מ"ל. Phosphatase חומצה Type I מ Triticum aestivum (נבט חיטה, GP, בדרך כלל 0.5 מ"ג U-1 מוצק, EC 3.1.3.2) Acid phosphatase סוג IV-S מ Solanum tuberosum (תפוחי אדמה, PP, בדרך כלל 4.6 מ"ג U-1 מוצק, EC 3.1.3.2) * יחידות הפעילות שצוינו על ידי הספק שבו 1 יחידות מוגדר לשחרור micromole 1 של orthophosphate לפתרון לשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש lyophilized nuclease P1 (EC 3.1.30.1) מ Penicillium citrinum (פטריות; NP1, בדרך כלל 500 מ"ג U -1 מוצק) ב מ"ל אחד deionized מים זה כעת ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה NP1 לתוך אחד הצינורות 10 מ"ל מוכן בשלב 3.2 כזה ריכוז הסופי הוא 2.5 יחידות / מ"ל ​​NP1: לערבב בעדינות מספר פעמים על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שני פתרונות 10 מ"ל אנזים 3000 XG במשך 30 דקות. </li></ol> 4. P עקומת כיול שולטת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של פוספט אשלגן 1 מ"מ (K2HPO4, 174.18 g / mol) פתרון המניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ"ל של 1 mM אשלגן פתרון מניות פוספט צינור 1.5 צנטריפוגות מ"ל ולבצע seven 0.5 דילולים סדרתי מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הצינור הראשון אז יש לך 7 דילולים הנעים בין 20 nmol-nmol 0.625 פ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 80 μL מהצינור כל כפולים שורות ב - H צלחת 96-היטב סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 μL של חיץ נתרן אצטט (סעיף 3.1) עד שורת עמודים 11 ו -12, זה הוא 0 nmol נקודה P כיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל עמודה 11 ו 12 מכיל כעת 8 דגימות התייחסות nmol מ 0 עד 20 פוספטים אנאורגניים nmol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טור 10 יכיל את הפקדים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40μL PP + פתרון GP אנזים + 40 נתרן אצטט μL חיץ (סעיף 3.1) את שלושת הבארות הראשון בעמודה 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μL PP + + GP NP1 פתרון אנזים + 40 נתרן אצטט μL חיץ לשלוש בארות הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 נתרן אצטט μL תמיסה המכילה 10 glucose-6 nmol פוספט (C 6 H 11 O 2 Na 9 P &amp;bullet; xH 2 O, 304.1 g / mol) + 40 μL PP + פתרון GP אנזים אחד היטב היטב את הגמר ב 10 טור פתרון להוסיף נתרן אצטט במקום פתרון האנזים. </li></ol></li></ol> 5. לדוגמה + אנזימים דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל נבדק מדגם יתפוס הראשון 9 בארות בשורה 1 צלחת 96-היטב סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ 40 μL של ה-pH המותאמת תמציות מדגם מתוך סעיף 2 לבארות 1-9 של עד 8 שורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל דגימות הופצו * להשתמש פיפטה רב להפיץ PP + פתרון GP אנזים לעמודות 1-3, PP + + GP NP1 לעמודות 4-6 ו נתרן אצטט חיץ (מוכן בסעיף 3.1) לעמודות 7-9. * שלב זה חייב להתבצע במהירות כדי להבטיח כל הדגימות לקבל זמן הדגירה המקבילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את צלחת 96-היטב עם מכסה דגימות דגירה + פתרונות האנזים, בקרות עקומת כיול בדיוק 1 שעות בשעה 37 ° C. </li></ol> 6. מדידה של Colorimetric פורסם ו-P רקע אורגניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ"ל של כל אחד מן הפתרונות הבאים במים deionized: פתרון: * 0.1 חומצה אסקורבית M (C6H8O6, 176.12 g / mol) + חומצה Trichloroacetic 0.5m (Cl3CCOOH, 163.39 g / mol) פתרון ב ': 0.01 molybdate M אמוניום ((NH4) 2MoO4, 196.01 g / mol) פתרון ג': 0.1 M ציטרט הנתרן (הוק (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294.10 g / mol) + 0.2 arsenate M נתרן (NaAsO2, 129.91 g / mol) + 5% חומצה אצטית קרחונית (CH3CO2H, 60.05 g / mol) * הפתרון חייב להיות מוכן מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μL הפתרון SDS, 100 μL של פתרון, 20 μL של B פתרון ו 50 μL של C פתרון לכל בארות 96-pl טובאכלו. עשה זאת במהירות עם טפטפת רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת דגירה 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ספיגת ב 850 ננומטר כל קורא מיקרו צלחת מתכונן. </li></ol> 7. סיווג של תרכובות P <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבוא ​​נתונים גולמיים לתוך יישום גיליונות אלקטרוניים (כגון Microsoft Excel). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש זרחן אורגני עקומת כיול: 0-40 nmol P על ציר ה-x לבין הממוצע של מדידות ספיגת לשכפל על ציר ה-Y. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע רגרסיה ליניארית ולמצוא את המשוואה של קו בכושר הטוב ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טורים 1-3: ישירות להחיל את עקומת כיול, זה הרקע אורגניים פ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טורים 4-6: ממוצע מדגם ערכים בשלושה עותקים ולחסר את שולטת (פתרון אנזים + אורגניים P רקע) מ ברוטו ספיגת-P זו נגזרת מן hydrolysable monoesters P. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טורים 7-9: כמו 7.5 פרט לחסר ספיגת ערכים מעמודות 4-6 - זה P מ hydrolysable diesters P. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת נתונים כדי ספיגת nmol P שפורסמו על ידי יישום משוואת כיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> nmol P פרסמה יכול להיות קשור בחזרה P מ"ג / ק"ג של אדמה המקורי. לחלופין, בהערכת הפרופורציות של כל שיעור P יכול להיות גם שימושי גישה לניתוח נתונים. </li></ol> 8. נציג תוצאות: בדיקה חזותית מהירה של צלחת 96-היטב לאחר הכימיה colorimetric יציע רמזים אם ההליך בוצע כראוי. הדבר הראשון שיש לבדוק הוא את רמת הנוזל היטב על ידי סריקת כל פרופיל בצד הצלחת. לא צריך להיות בדיוק 275 μL של ריאגנטים בבארות כל. בשלב הבא, לבדוק ויזואלית את הצבע של בארות מדגם בשלושה עותקים ולשכפל בארות כיול. אלה לשכפל טכני צריך להיות באותו גוון של כחול. לאחר מכן להחיל את עקומת כיול על שתי בארות המכילה גלוקוז -6 פוספט ואמת הם שחררו את כל 10 nmol של פ אורגניים אחרי P חילוץ בסך הכל כבר נמדד באמצעות ICP-OES או שיטה חלופית, ודא P הכולל ערכים מחושבים באמצעות פרוטוקול לא יעלה על סכום P זה היה חילוץ. הערה: ניהול נתונים זהירות בגיליון האלקטרוני יעזור להישמר מפני טעויות כמותי. אתה תהיה התמודדות עם הרבה מספרים בבת אחת, כך יוצר תבנית יהיה זמן טוב בילו. <img src="/files/ftp_upload/2660/2660fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. צלחת 96-היטב מציג תוצאות עבור 8 דגימות (שורות א.ה.) לבין עקומת כיול (עמודות 11 ו 12). פקדים הם בעמודה 10. עוצמת צבע להגדיל בין עמודות 1-3 ו 4-6 בשל תרכובות monoester הידרוליזה P, בין עמודות 4-6 ו 7-9 בשל תרכובות P הידרוליזה diester. <img src="/files/ftp_upload/2660/2660fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. התפלגות כיתות P ב 0.25-M לחלץ NaOH 0.05 M EDTA מדגם אדמה ורמונט באמצעות תפוקה גבוהה הידרוליזה אנזימטית. ברים שגיאה מצביעים סטיית תקן, n = 3.

<ol><li>Turner, B. L., Frossard, E., Baldwin, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurner%2C+BL+%22Organic+phosphorus+in+the+environment%22">Organic phosphorus in the environment</a>. , Cabi Publishing. Wallingford. (2005).</li>
<li>Murphy, J., Riley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+single+solution+method+for+determination+of+phosphate+in+natural+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters.</a> Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).</li>
<li>Dick, W. A., Tabatabai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+orthophosphate+in+aqueous+solutions+containing+labile+organic+and+inorganic+phosphorus+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Qual%22%5BJournal%5D)">Determination of orthophosphate in aqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphorus compounds.</a> J. Environ. Qual. 6, 82-85 (1977).</li>
<li>He, Z., Toor, G. S., Honeycutt, C. W., Sims, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+hydrolysis+approach+for+characterizing+labile+phosphorus+forms+in+dairy+manure+under+mild+assay+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic hydrolysis approach for characterizing labile phosphorus forms in dairy manure under mild assay conditions.</a> Bioresour. Technol. 97, 1660-1668 (2006).</li>
<li>He, Z., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Soil+Sci.+Plant+Anal%22%5BJournal%5D)">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Commun. Soil Sci. Plant Anal. 36, 1373-1383 (2005).</li>
<li>Cade-Menun, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+phosphorus+in+environmental+and+agricultural+samples+by+31P+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Talanta. 66, 359-371 (2005).</li>
<li>Johnson, N. R., Hill, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorus+species+composition+of+poultry+manure-amended+soil+using+high-throughput+enzymatic+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Sci.+Soc.+Am.+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis.</a> Soil Sci. Soc. Am. J. 74, 1786-1791 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מעצם טבעו, שיטה מהירה באמצעות בנפחים קטנים דורש טיפול רב. לכן השלבים הקריטיים ביותר הם אלה הכוללים פתרונות pipetting לצלחת. מדויק, והכי חשוב, הטכניקה פיפטה עקביים הם חיוניים להצלחה של assay זה. מיצוי NaOH-EDTA יאפשר ביותר P בדגימות רבות להתאפיין לשלושה סוגים: orthophosphate, monoester P ו diester קרקעות פ, וזבלים, משקעים או כל מדגם סביבתיים אחרים המכילה NaOH-EDTA לחילוץ-P ניתן לאפיין . צורות P בדגימות איכות הסביבה אינם יציבים בהכרח טכניקה זו תבטיח דגימות מאופיינים לפני דגימות נפגמו ללא צורך להעסיק צבא של חוקרים. Assay זו מתאימה במיוחד כאשר מספר גדול של דגימות הן להיות מעובד. הצרכים מגיב ועל דרישות השטח כבר scaled למטה לרמה סבירה (למשל 1.5 microcentrifuge מ&quot;ל צינורות במקום 50 מ&quot;ל צלוחיות זכוכית). הסתגלות זו גם מגבלות ייצור פסולת.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> NaOH </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S8045 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> EDS </td></tr><tr><td> חומצה אצטית קרחונית </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 242853 </td></tr><tr><td> נתרן אצטט </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S2889 </td></tr><tr><td> חיטה phosphatase חומצה </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P3627 </td></tr><tr><td> חומצה תפו&quot;א phosphatase </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P1146 </td></tr><tr><td> Nuclease P1 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> N8630 </td></tr><tr><td> אשלגן פוספט </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P2222 </td></tr><tr><td></td><td> סיגמא אולדריץ </td><td></td></tr><tr><td></td><td> סיגמא אולדריץ </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז -6 פוספט </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G7250 </td></tr><tr><td> SDS </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> L4390 </td></tr><tr><td> חומצה אסקורבית </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A5960 </td></tr><tr><td> TCA </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T9159 </td></tr><tr><td> אמוניום Molybdate </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A1343 </td></tr><tr><td> סודיום ציטראט </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S1804 </td></tr><tr><td> נתרן Arsenate </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S9663 </td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה מדידה סיווג p אורגני דגימות סביבתיות

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

סוגים רבים של (P) מולקולות אורגניות זרחן קיימות דגימות סביבתיות 1. מסורתית מדידות P אינם מזהים אלה תרכובות אורגניות P מאז הם לא מגיבים עם ריאגנטים colorimetric 2,3. הידרוליזה אנזימתי (EH) היא שיטה המתעוררים מדויק באפיון צורות P אורגני דגימות סביבתיות 4,5. שיטה זו היא ניצחה רק על ידי זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית (31 P-NMR), שיטה כי זה יקר ודורש training6 טכני המתמחה דיוק. יש לנו להתאים שיטה הידרוליזה אנזימטית מסוגל למדוד שלוש כיתות של זרחן (monoester P, P ו-P diester אורגניים) למערכת microplate קורא 7. שיטה זו מספקת לחוקרים עם אמצעי מהיר, מדויק, סביר ידידותי למשתמש למדוד מינים P בקרקע, משקעים, וזבלים, ואם מרוכז, דגימות מים. זוהי השיטה היחידה תפוקה גבוהה למדידת טפסים אנזימים לביליות של P אורגני שניתן לבצע במעבדה סטנדרטית. את הנתונים המתקבלים מספק תובנה למדענים ללמוד תוכן מערכת מזין ואת הפוטנציאל eutrophication.

פרוטוקול זה מתאר שיטת תפוקה גבוהה של הידרוליזה אנזימטית אשר מנצל קורא microplate למדוד ולסווג זרחן אדמה כמו P monoesters, diesters P ו פ אורגניים עד 96 דגימות ניתן למדוד בו זמנית במעבדה סטנדרטית.

תפוקה גבוהה מדידה סיווג P אורגני דגימות סביבתיות

סוגים רבים של מולקולות זרחן (P) אורגני קיימים בדגימות סביבתיות1. מדידות P מסורתיות אינן מזהות תרכובות P אורגניות אלו מכיוון ש...

המטרה הכללית של הליך זה היא לסווג זרחן אורגני שעבר הידרוליזה אנזימטית בתמריות של דגימות קרקע או דשן. זאת מושגים תחילה על ידי מיצוי דגימות באמצעות תמיסת sodium hydroxide EDTA וכיוון ה-pH של התמריות. לאחר מכן, מדגגות תמריות מותאמות אלו עם שני תמיסות אנזימים שונות.בפלטה בעלת 96 בארות, השלב הסופי הוא מדידת אורטופוספט ששוחרר על ידי האנזים באמצעות קולורימטריית מוליבדן כחול. בסופו של דבר, ניתן לסווג את מרבית צורות הפספורוס של מונו-אסטר ואסתר-דו-פוספט טבעיים בדגימות קרקע או דשן על בסיס שחרור דיפרנציאלי של אורטופוספט באמצעות שיטת הידרוליזה אנזימטית. ניתן לבצע שיטה זו בעלות נמוכה בכל מעבדה סטנדרטית.היתרון המרכזי של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית של זרחן 31, הוא היכולת למדוד את הפוטנציאל של אנזימי קרקע טבעיים לשחרר אורתופוספט מתרכובות אפונה אורגניות בעתיד. לפיכך, נתונים המתקבלים בשיטה זו יכולים לסייע בחיזוי פוריות הקרקע או הפוטנציאל של הקרקע לשחרר כמויות מזיקות של אורתופוספט הזמין לאצות. הוסף 30 milliliters של תמיסת נתרן הידרוקסיד 0.25 molar לשני גרמים של דגימה רטובה או מיובשת בתוך מבחנה קונית של 50 milliliters.דגרו עם ערבוב למשך 16 שעות בטמפרטורת החדר. סובבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-3000 ×g למשך 30 דקות, ולאחר מכן העבירו 100 µL לפקת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL המכילה כבר באפר אצטט. לדגימה המותאמת נפח כולל של 1 mL ו-pH של 5.0.הכינו שני תמיסות סטוק המכילות 0.5 יחידות למיליליטר של acid phosphatase ב-10 מיליליטר של sodium acetate 0.1 מולארי pH 5 שהוכן טרי. כעת הוסיפו nuclease NP1 ליופיליז פתוח מ-Penicillium Citron לאחד ממבחנות ה-10 מיליליטר של תמיסות הסטוק של acid phosphatase עד לריכוז סופי של 2.5 יחידות NP1 למיליליטר, וערבבו בעדינות על ידי הפיכה מספר פעמים; סנטריפוגו את שני תמיסות האנזים ב-3000 ×g למשך 30 דקות. כדי לבנות עקומת כיול, התחילו בהוספת 1 מיליליטר של תמיסות סטוק של potassium phosphate 1 מילימולארי למבחנת סנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ובצעו שבע דילוליות סדרתיות של 0.5 מיליליטר; השליכו את המבחנה הראשונה כך שטווח הדילול הסופי יהיה בין 20 nmol ל-0.625 nmol של זרחן.כעת העבירו את תמיסות הסטנדרט של ORTHOPHOSPHATE לשתי העמודות האחרונות בלוחית, החל מ-0 NM orthophosphate בשורה A ועד 20 nm orthophosphate בשורה H לשלוש הבארות הראשונות של עמודה 10. הוסיפו 40 µL של תמיסת אנזימי PP פלוס GP לשלוש הבארות הבאות בעמודה 10. הוסיפו 40 µL של תמיסת אנזימי PP פלוס GP פלוס NP.לבסוף, הוסיפו 40 µL של בופר אצטט 100 mM לכל שש הבארות. כעת, כל אחת משש הבארות הראשונות בעמודה 10 צריכה להכיל 80 µL של תמיסה בשתי הבארות הבאות. הוסיפו 40 µL של תמיסת סודיום אצטט המכילה 10 M גלוקוז, שישה פוספט, ו-40 µL של תמיסת אנזימי PP פלוס GP.עבור כל דגימה שנבדקת, חלק 40 µL של תמציות דגימה עם pH מותאם לבארות אחת עד תשע בעד שמונה שורות, לאחר שכל הדגימות חולקו. השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי לחלק תמיסס אנזימים של PP פלוס GP לעמודות אחת עד שלוש, PP פלוס GP פלוס NP 1 לעמודות ארבע עד שש, ובאפר נתרקיס אצטט 0.1 M לעמודות שבע עד תשע. בצע שלב זה במהירות כדי להבטיח שכל הדגימות יקבלו זמן דגירה שווה.כסו את פלטת 96 הבארים במכסה והדגרו את הדגימות, תמיסות האנזים, הבקרות ועקומת הכיול במשך שעה אחת בדיוק בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך מים דה-יוניזים. הכינו 50 milliliters מכל אחת מארבע תמיסות הסטוק. תמיסה A חייבת להיות מוכנה מדי יום במהירות באמצעות פפיט רב-ערוצי.הוסיפו 25 µL של SDS, 100 µL של תמיסה a, 20 µL של תמיסה B ו-50 µL של תמיסה C לכל הבארים בלוחית 96 בארים. כסו את הלוחית והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, מדדו את הבליעה ב-850 nm באמצעות קורא לוחות מיקרו עם אורך גל ניתן לכיוונון (tuneable microplate reader) ובסיוע אפליקציית גיליון נתונים.ראשית, שרטטו את עקומת כיול הפספורס האנורגני עם 0 עד 20 nanomoles פספורס בציר ה-x וממוצע של מדידות בליעה (absorbance) כפולות בציר ה-Y, בצעו רגרסיה ליניארית ומצאו את משוואת קו המגמה הטוב ביותר. לאחר מכן, חשבו את רקע הפספורס האנורגני על ידי חישוב ממוצע הערכים בעמודות אחת עד שלוש, ואז החילו את עקומת הכיול על מערך הנתונים. כדי לקבוע את כמות הפספורס שנגזרה ממונו-אסטרים של פספורס שעברו הידרוליזה, חשבו את ממוצע ערכי הדגימה המשולשים מעמודות ארבע עד שש והפחיתו מהם את תמיסת אנזים הבקרה בתוספת רקע הפספורס האנורגני.לאחר מכן, כדי לחשב את תכולת הפספורס מהפספורס שעבר הידרוליזה, DERs מחשבים את הממוצע של ערכי הדגימות המשולשות מעמודות שבע עד תשע ומחסירים מהם את תמיסת אנזים הבקרה פלוס הפספורס anorganic ברקע פלוס פספורס מונו-אסטר שעבר הידרוליזה מעמודות ארבע עד שש. פלטת 96 בארות טיפוסית מציגה תוצאות עבור שמונה דגימות ועקומת כיול. הבקרות נמצאות בעמודה 10.העלייה בעוצמת הצבע בין עמודות אחת עד שלוש ובין עמודות ארבע עד שש נובעת מתרכובות זרחן מונו-אסטר שעברו הידרוליזה; בין עמודות ארבע עד שש ושבע עד תשע העלייה נובעת מתרכובות זרחן די-אסטר שעברו הידרוליזה. כאן נעשה שימוש בשיטה של הידרוליזה אנזימטית בקיבולת גבוהה כדי לנתח בהצלחה את התפלגות מחלקות הזרחן בתמציות של 0.25 molar sodium hydroxide ו-0.05 molar EDTA מדגימת קרקע מוורמונט. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד למדוד אורתופספט נטיבי, וכן תרכובות זרחן מונו-אסטר ודי-אסטר בתמציות קרקע או דשן באמצעות הידרוליזה אנזימטית.טכניקה זו עשויה לסייע בסלילת הדרך עבור חוקרים בתחומי הכימיה הסביבתית וניהול חומרי הזנה לבחון את התנהגות ה-P האורגני במערכות קרקע או דשן אורגני.

high-throughput-measurement-classification-organic-p-environmental

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

Assay bioreporter התא שלם עם sartisoli Burkholderia RP037-mChe פותח כדי לזהות שברים של מזהמים אורגניים (כלומר, fluorene) זמינים לשפלת חיידקים לאחר תחבורה פעילה על ידי mycelia גישור נקבוביות אוויר מלא במערכת מודל בלתי רוויה מים.

גישת Bioreporter תא כל להערכת תחבורה וזמינות ביולוגית של מזהמים אורגניים במערכות לא רוויים מים

מבנה דופן התא של הצמח ותכונות הכימיה מוערכים כדי לזהות חומרי גלם אידיאליים לדלקים ביולוגיים וביו-חומרים. לשיטות סטנדרטיות יש מגבלות כאשר הן מיושמות על ערכות נתונים גדולות. שיטות טיפול מקדים בתפוקה גבוהה, סכריזציה של אנזימים וספקטרומטריית מסה של קרן פירוליזה-מולקולרית משוות מספר רב של דגימות ביומסה עם ירידה בזמן הניסוי ובעלות.

הקרנת תפוקה גבוהה של וריאציות סרבנות בlignocellulosic יומסה: סה&quot;כ ליגנין, מונומרים ליגנין, ואנזימתי שחרור סוכר

מוצג פרוטוקול העוסק באפיון ויישום של חמישה התקני דגימה פסיביים שונים.

אפיון ויישום של דוגמים פסיביים עבור ניטור של דברה במים

זמן תגובה להעברת פרוטונים של ספקטרומטריית מסה של טיסה מאפשרת ניתוח רגיש גבוה, מהיר ולא פולשני של תרכובות אורגניות נדיפות. כדי להדגים את הפוטנציאל שלו, אנו נותנים שלוש דוגמאות: תסיסה של חומצת חלב של יוגורט (ניטור ביולוגי מקוון), גנוטיפים שונים של תפוחים (סינון בקנה מידה גדול) וחלל רטרו-אף לאחר שתיית קפה (ניתוח חלל האף).

PTR-ToF-MS יחד עם מערכת הדגימה אוטומטית וניתוח נתונים מותאמים למחקרים על מזון: ניטור Bioprocess, הקרנה וניתוח שטח האף

מאמר זה מתאר מבצע הליכים כדי להפוך את הרווארד סביבתיים קאמרית (HEC) קשורים אינסטרומנטציה עבור מדידת גז ומינים של חלקיקים. תא סביבתיים משמש כדי לייצר וללמוד משני מינים אורגני המופק את סימנים מקדימים אורגני, במיוחד הקשורים אטמוספרי חלקיקים אורגניים.

ייצור, מדידה של חלקיקים אורגניים בבית הבליעה סביבתיים הרווארד

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

אנו מציגים פרוטוקול להקרנה מהירה של דגימות סביבתי עבור siderophore פוטנציאל לתרום הזמינות הביולוגית micronutrient והמסירה במערכות יבשתי.

תפוקה גבוהה Siderophore הקרנה מדגימות סביבתי: צמח רקמות תפזורת קרקעות, Rhizosphere קרקעות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה להובלה למרחקים ארוכים של חומצות פרפלואורואלקיל בחיטה.

חקירת הובלה למרחקים ארוכים של חומצות פרפלואורואלקיל בחיטה באמצעות טכניקת חשיפה לשורש מפוצל

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בפורמט אמוניום לחלוקת פאזה ב- QuEChERS, יחד עם ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה של גז, כדי לקבוע בהצלחה שאריות חומרי הדברה אורגנוכלורין בדגימת קרקע.

ניתוח של חומרי הדברה אורגנוכלורין בדגימת קרקע על ידי גישת QuEChERS שונה באמצעות פורמט אמוניום

למד סיווג פוספור אורגני בדגימות קרקע ודשן באמצעות הידרוליזה אנזימטית בנפח גבוה. שיטה זו מסייעת לחוקרים בתחום הכימיה הסביבתית להעריך פוריות קרקע וניהול מזון.

תפוקה גבוהה מדידה סיווג P אורגני דגימות סביבתיות

גלה סרטונים נוספים