תפוקה גבוהה מדידה סיווג P אורגני דגימות סביבתיות

המטרה הכללית של הליך זה היא לסווג זרחן אורגני שעבר הידרוליזה אנזימטית בתמציות של דגימות קרקע או זבל. דבר זה מושג תחילה על ידי מיצוי דגימות באמצעות תמיסת sodium hydroxide EDTA וכוונון ה-pH של התמציות. לאחר מכן, מדגירים תמציות מכוונות אלו עם שתי תמיסות אנזימים שונות.

בפלטה של 96 בארות, השלב הסופי הוא מדידת האורתופספט שהשתחרר על ידי האנזים באמצעות קולורימטריית מוליבדן כחול. בסופו של דבר, ניתן לסווג את מרבית צורות הפספורוס של מונו-אסטר ואסטר-די אורתופספט טבעיים בדגימות של קרקע או דשן על בסיס שחרור דיפרנציאלי של אורתופספט בשיטת הידרוליזה אנזימטית. ניתן לבצע שיטה זו בעלות נמוכה בכל מעבדה סטנדרטית.

היתרון המרכזי של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית של זרחן 31, הוא היכולת למדוד את הפוטנציאל של אנזימי קרקע טבעיים לשחרר אורתופספט מפסות אורגניות של אפונה בעתיד. לפיכרין, נתונים המתקבלים בשיטה זו יכולים לסייע בחיזוי פוריות הקרקע או הפוטנציאל של הקרקע לשחרר כמויות מזיקות של אורתופספט הזמין לאצות. הוסף 30 milliliters של תמיסת sodium hydroxide בריכוז 0.25 molar לשני גרם של דגימה רטובה או יבשה בתוך מבחנה קונית של 50 milliliters.

דגרו עם ערבוב למשך 16 שעות בטמפרטורת החדר. סובבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-3000 ×g למשך 30 דקות, ולאחר מכן העבירו 100 µL לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL המכילה כבר באפר אצטט. לדגימה המותאמת נפח כולל של 1 mL ו-pH של 5.0.

הכינו שני תמיסות סטוק המכילות 0.5 units למילילטר של acid phosphatase ב-10 milliliters של sodium acetate 0.1 molar pH five שהוכן טרי. כעת, הוסיפו nuclease NP1 lyophilized reconstituted מ-Penicillium Citron לאחד ממבחנות ה-10 milliliters של תמיסות הסטוק של acid phosphatase, עד לריכוז סופי של 2.5 units NP1 למילילטר; ערבבו בעדינות על ידי הפיכה מספר פעמים, וסובבו במצנטריפוגה את שתי תמיסות האנזימים במהירות של 3000 ×g למשך 30 דקות. כדי להכין עקומת כיול, התחילו בהוספה של 1 milliliter של תמיסת סטוק של potassium phosphate בריכוז 1 millimolar למבחנת צנטריפוגה של 1.5 milliliter, ובצעו שבעה דילולים סדרתיים של 0.5 milliliter; השליכו את המבחנה הראשונה כך שטווח הדילול הסופי יהיה בין 20 µL ל-0.625 nM זריחון.

כעת העבירו את סטנדרטים של ה-ORTHOPHOSPHATE לשתי העמודות האחרונות בלוחית, החל מ-0 nM orthophosphate בשורה A ועד 20 nm orthophosphate בשורה H לשלוש הבארות הראשונות של עמודה 10. הוסיפו 40 µL של תמיסת אנזימי PP פלוס GP לשלוש הבארות הבאות בעמודה 10. הוסיפו 40 µL של תמיסת אנזימי PP פלוס GP פלוס NP.

לבסוף, הוסיפו 40 µL של בופר אצטט 100 mM לכל שש הבארות. כעת, כל אחת משש הבארות הראשונות בעמודה 10 צריכה להכיל 80 µL של תמיסה לשתי הבארות הבאות. הוסיפו 40 µL של תמיסות נתרן אצטט המכילה 10 M גלוקוז, שישה פוספט, ו-40 µL של תמיסות אנזימי PP פלוס GP.

עבור כל דגימה הנבדקת, חלק 40 µL של תמריות דגימה עם pH מותאם לבארות אחת עד תשע בעד שמונה שורות, לאחר שכל הדגימות חולקו. השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי לחלק תמיסת אנזים PP plus GP לעמודות אחת עד שלוש, PP plus GP plus NP לעמודות ארבע עד שש, ובאפר סודיום אצטט 0.1 M לעמודות שבע עד תשע. בצע שלב זה במהירות כדי להבטיח שכל הדגימות יעברו זמן אינקובציה שווה.

כסו את פלטת 96 הבארים במכסה והדגירו את הדגימות, תמיסות האנזימים, הביקרים ועקומת הכיול למשך שעה אחת בדיוק בטמפרטורה של 37 °C בתוך מים דה-יוניים. הכינו 50 milliliters של כל אחד מארבעת תמיסות המלאי. יש להכין את תמיסה A מדי יום במהירות באמצעות פיפט רב-ערוצי.

הוסיפו 25 µL של SDS, 100 µL של תמיסה a, 20 µL של תמיסה B ו-50 µL של תמיסה C לכל הבארים בלוחית 96-בארים. כסו את הלוחית והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, מדדו את הבליעה באורך גל של 850 nm בכל קורא מיקרו-פלייטים עם אורך גל ניתן לכיוונון באמצעות יישום גיליון אלקטרוני.

ראשית, שרטטו את עקומת הכיול של זרחן אנאורגני עם 0 עד 20 nanomoles phosphorus בציר ה-x וממוצע של מדידות בליעת אור כפולות בציר ה-Y, בצעו רגרסיה ליניארית ומצאו את משוואת קו המגמה. לאחר מכן, חשבו את רקע הזרחן האנאורגני על ידי חישוב ממוצע הערכים בעמודות אחת עד שלוש, ולאחר מכן יישום עקומת הכיול על מערך הנתונים. כדי לקבוע את כמות הזרחן שנגזר ממונו-אסטרים של זרחן שעברו הידרוליזה, חשבו את ממוצע ערכי הדגימות המשולשות מעמודות ארבע עד שש והפחיתו מהם את תמיסת אנזים הביקורת בתוספת רקע הזרחן האנאורגני.

לאחר מכן, כדי לחשב את תכולת הפספורס מהפספורס שעבר הידרוליזה, DERs מחשבים את הממוצע של ערכי הדגימה המשולשים מעמודות שבע עד תשע, ומחסירים מהם את תמיסת האנזים של הביקורת, את הפספורס anorganic של הרקע ואת הפספורס של המונו-אסטר שעבר הידרוליזה מעמודות ארבע עד שש. פלטת 96 בארות טיפוסית מציגה תוצאות עבור שמונה דגימות ועקומת כיול. הביקורות נמצאות בעמודה 10.

העלייה בעוצמת הצבע בין עמודות אחת עד שלוש ובין עמודות ארבע עד שש נובעת מתרכובות זרחן מונו-אסטר שעברו הידרוליזה; בין עמודות ארבע עד שש ושבע עד תשע, העלייה נובעת מתרכובות זרחן די-אסטר שעברו הידרוליזה. כאן נעשה שימוש בשיטה של הידרוליזה אנזימטית בקיבולת גבוהה כדי לנתח בהצלחה את התהודה של סוגי הזרחן בתמציות של 0.25 molar sodium hydroxide ו-0.05 molar EDTA מדגימת קרקע מוורמונט. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד למדוד אורתופוספט נטיבי, מונו-אסטר ותרכובות די-אסטר של זרחן בתמציות קרקע או דשן באמצעות הידרוליזה אנזימטית.

טכניקה זו עשויה לסייע בהסלילת הדרך עבור חוקרים בתחומי הכימיה הסביבתית וניהול חומרים מזינים לבחון את התנהגות ה-P האורגני במערכות קרקע או דשן אורגני.