Name: Immunocytochemistry: אדם בתאי גזע עצביים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-24T00:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 41 s
Description: למד טכניקת אימונוציטוכימיה לניתוח תאי גזע עצביים אנושיים. פרוטוקול זה מדגים אופטימיזציה של שימוש בנוגדנים ויעילות צביעה לתוצאות ברות שחזור במחקר נוירו-ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר ד&quot;ר פיליפ שוורץ ח של המשאבים הלאומיים האדם עצבית לתאי גזע בבית החולים לילדים, אורנג&#39; קאונטי מכון המחקר למתן תרבויות hNSPC ד&quot;ר גארי Bassell באוניברסיטת אמורי להוראה הראשונית בטכניקת צביעה parafilm.

יום 1: הכנת תאים Coverslips זכוכית הגרמנית מתזמן הערה: coverslips זכוכית הגרמני לעיתים קרובות עדיף העיקרי culturing בתאי גזע עצביים ועל נוירונים. אנו משתמשים בפרוטוקול ניקוי הבאות כדי לשפר את הידבקות התא מתפשטת. מיקום coverslips במעמד קטן שיאפשר גישה נוזל על שני הצדדים של coverslip. ראשית, coverslips דגירה Liquinox ב 1% למשך 10 דקות, ואחריו 3 שוטף עם מים deionized. ודא כי אין בועות סבון להישאר. בשלב הבא, תלושי דגירה ב 1M HCl למשך 30 דקות, ואחריו 3 שוטף עם מים deionized. Coverslips יבש ב 65 ° C במשך הלילה. העברת coverslips על צלחת זכוכית החיטוי לעקר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף בתרבית רקמה, מקום סטרילי coverslips בצלחת גם בגודל הולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל עם coverslips laminin עבור הידבקות התא. דגירה coverslips ב 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פולי D-ליזין (PDL) במים סטריליים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר coverslips PDL ו דגירה של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​laminin EMEM במשך 4 שעות או לילה, בתוך 37 ° C רקמות התרבות בחממה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: עיין Passaging האדם מאמר בתאי גזע עצביים ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) ואת ספירת אדם בתאי גזע עצביים מאמר ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / ראשי / Details.stp? ID = 262</a> ) כדי ללמוד כיצד resuspend ולספור hNSPCs. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף laminin מצופה coverslips עם PBS ותאי הזרע לתוך coverslip המכילים כל טוב בצפיפות מסוים (לעתים קרובות אנו משתמשים צפיפות ציפוי ראשוני של 100,000-300,000 תאים / מ&quot;ל ​​עבור תאים שאנחנו ציפוי עבור immunostaining). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מקום 37 ° C רקמה תרבות החממה ולאפשר לתאים לדבוק coverslips (בדרך כלל מינימום של 4 שעות נדרש). </li></ol> יום 2: תיקון, Permeabilizing, חסימה, ואת הוספת נוגדן ראשוני לתאי הערה: אנו משתמשים מקבע הבאים paraformaldehyde 4% כדי לשמור על מורפולוגיה התא. המתכון כולל המעבר pH לאפשר paraformaldehyde להיכנס פתרון. אנחנו מעדיפים את השיטה ולא את השימוש של חום לפזר paraformaldehyde בגלל טמפרטורות גבוהות יותר יכול להוביל לדור של חומצה פורמית, אשר יכול להגביר מכתים הרקע בעת שימוש פלואורסצנטי. רכיבים מסוימים של מקבע לעזור לשמר את מבנה cytoskeletal (MgCl 2 ו EGTA), בעוד אחרים לעזור לשמור על המורפולוגיה הכללית (סוכרוז). Paraformaldehyde מקבע 4% עבור תאים <table style="border-collapse: collapse; border: medium none;text-align:right;direction:rtl" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> ריאגנטים את הפעולות הבאות: </td><td> עבור סכום של 100 מ&quot;ל מקבע: </td></tr><tr><td> MilliQ מים </td><td> 75 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (שוקל לצאת למכסה המנוע קטר) </td><td> 4 גרם </td></tr><tr><td> 10N NaOH, מערבבים ומוסיפים dropwise עד פתרון מנקה </td><td> לפי הצורך </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 0.5 מ EGTA </td><td> 2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 4 גרם </td></tr><tr><td> HCl 6N, לכיל ל-pH 7.4 </td><td> לפי הצורך </td></tr><tr><td> MilliQ מים </td><td> מביאים 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד שבוע 1. חם על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש </td></tr></tbody></table><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הספסל, הסר את המדיה להוסיף מקבע prewarmed. דגירה של 5-15 דקות (תלוי אנטיגן כדי להיות מזוהים, אנחנו בדרך כלל משתמשים 10 דקות). בצע זאת בשלבים הבאים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל מקבע לתוך מיכל מתאים, כמו מוסדות רבים להתמודד paraformaldehyde כמו פסולת מסוכנת. שטפו תאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם. בעת הסרת פתרונות מן התאים, להיזהר כי היניקה לא לייבש את התאים. כמו כן, תמיד יש את הפתרון הבא מצד להוסיף תאים לפני הסרת פתרון מעילים אותם כל כך התאים לא נותר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אנטיגן של הריבית בתוך התא, קרום התא חייב להיעשות חדיר כדי לאפשר כניסה של הנוגדן. כדי permeabilize תאים, השתמש טריים 0.3% Triton X-100 פתרון PBS. פיפטה לאט כי טריטון הוא צמיג, ולוודא דטרגנט הוא נמס לגמרי לפני שמוסיפים לתאים PBS. Permeabilize תאים במשך 5 דקות, ואחריו כביסה התאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים חייבים להיות מטופלים עם סוכן חסימה כדי למנוע אי - ספציפי המחייב של הנוגדן. אנו משתמשים אלבומין בסרום שור (BSA) כסוכן חסימה. הפתרון חוסם מיוצר על ידי המסת BSA 5% לתוך PBS (על כסא נדנדה או הכתף כי זה לוקח זמן לפרק) ואז סינון סולution עם מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. בלוק תאים פתרון BSA / PBS 5% למשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li></ol> לדלל את הנוגדן הראשוני (בתקווה שהוא ספציפי לחלבון ריבית) לריכוז שנקבע מראש 1% BSA / PBS (שהוכן על ידי דילול מ -5% BSA / PBS). המקום בדילול נוגדן ראשוני (30 μl לכל coverslip 25 מ&quot;מ, 20 μl לכל coverslip 18 מ&quot;מ, 15 μl לכל coverslip 12 מ&quot;מ) על צלחת זכוכית מכוסה parafilm. תרימי את coverslip עם תאים קבוע, להפוך כך התאים עם הפנים כלפי מטה, ולהניח אותה על הפתרון נוגדן כך התאים באים במגע עם הנוגדן. מניחים רצועה parafilm השני מעל לבנות את כולו. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. יום 3: כביסה, דגירה נוגדן משנית, כתמים גרעיני הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את רצועת parafilm העליון להרים את coverslip, להפוך אותו, לשים אותו בחזרה לתוך הצלחת עם PBS היטב כל אחד שוטף כך התאים כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נוגדנים משני יאתר את הנוגדן הראשוני, למשל, אם את הנוגדן הראשוני נעשה ארנב, את הנוגדן משני להכיר ארנב IgG. תשמרי על עצמך גם להתאים את אלוטיפ נוגדנים (IgG, IgM, וכו &#39;). אם באמצעות נוגדנים העיקרי מרובים, לוודא שהם ממינים או isotypes שונים, תוכנית לזהות עם סמנים שונים המחוברים נוגדנים משני. לדוגמה, תוכל להשתמש בשילוב נגד ארנב משנית fluorophore אדום בשילוב עם העכבר אנטי משנית fluorophore ירוק. דגירה תאים הפתרון נוגדנים משני מדולל לריכוז המתאים BSA 1% למשך 2 שעות בחושך בטמפרטורת החדר, תוך שימוש בטכניקה זהה הראשי (לא צעדים המוצג בסרטון). נפח נוגדנים משני הדרושים הדגירה עלול להיות מעט גדול יותר מזה של הנוגדן הראשוני אם המשני מאוחסן כפתרון גליצרול (40 μl לכל coverslip 25 מ&quot;מ, 30 μl לכל coverslip 18 מ&quot;מ, 25 μl לכל coverslip 12 מ&quot;מ) . <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: אם אתה משתמש מולקולות ניאון כדי להמחיש את הנוגדן משנית, המדגם צריך להיות מוגן מפני אור פעם את הנוגדן משני שנוסף לו. דגירה בחושך, או צלחת מכוסה בנייר כסף. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את coverslips מ parafilm כמתואר עבור נוגדן הראשוני. שטפו תאים 2 פעמים עם PBS, 5 דקות בכל פעם, ואחריו הדגירה 1 דקה 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Hoechst גרעיני כתם מדולל PBS (אם counterstain גרעינית היא המועדפת). אם הכתם הוא Hoechst ישנים האות חלש מדי, אתה יכול להגדיל את זמן הדגירה ו / או ריכוז. לאחר הדגרה עם Hoechst, לשטוף פעם 1 עם PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips צריך להיות מותקן על שקופית עם התקשורת הרכבה להדמיה על מיקרוסקופ. במקרים בהם מולקולה ניאון משמש להדמיה של נוגדן המשני, התקשורת הרכבה צריכה להכיל סוכני למזער photobleaching. אנו משתמשים Vectashield כאמצעי תקשורת הרכבה פלואורסצנטי. הצב ירידה בגודל המתאים של Vectashield בשקופית מיקרוסקופ (12 μl לכל coverslip 25 מ&quot;מ, 6 μl לכל coverslip 18 מ&quot;מ, 3 μl לכל coverslip 12 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להרים את coverslip ולשטוף האחורי עם מים deionized להסיר מלחים (מן PBS). טובלים את המים העודפים על kimwipe או מגבת נייר, ומניחים על ירידה של Vectashield עם תאים כלפי מטה. מניחים את coverslip על בזווית ולאפשר לרדת לאט, כדי למנוע בועות אוויר השמנה. לייבל את השקופית עם התאריך וכל מידע המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות עם coverslips להתייבש (בחושך) יניקה אז את Vectashield עודף מסביב לקצה coverslip. הקצוות coverslip כעת ניתן חתום עם לק, אם תרצה בכך (שימושי במיוחד אם coverslips יראו על מיקרוסקופ הפוך). אנחנו בדרך כלל לאחסן שקופיות שלנו למקפיא -20 מעלות צלזיוס. </li></ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamin+A%2C+the+Arp2%2F3+complex%2C+and+the+morphology+and+function+of+cortical+actin+filaments+in+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells.</a> J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).</li>
<li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of stem cells.</a> In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li>
</ol>

פרוטוקול זה מתאר את הליך immunostaining עבור hNSPCs זה ממזער את עוצמת הקול של נוגדן הכרחי ונותנת מכתים תא אמין. ההליך המתואר הוא הטוב ביותר עבור אנטיגנים תאיים, אך ניתן לשנות כתם פני התא מולקולות או כדי לשפר כתמים של cytoskeleton.

<table><tbody><tr><td>לוחיות כיסוי מזכוכית גרמנית (Deutsche Spiegelglas)</td><td>כלי</td><td>Carolina Biological</td><td>WW-63-3029</td><td>לוחיות כיסוי זמינות במידות 12,15,18, 22, 25 mm</td></tr><tr><td>חומר ניקוי Liquinox נטול פוספטים</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273279</td><td>צמיג מאוד</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, עכבר טבעי</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>ריאגנט</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>מופץ על ידי Fisher תחת מספר הקטלוג המצוין</td></tr><tr><td>פלטה של 24 בארות</td><td>כלי</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>צמיג מאוד</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>קרצינוגן פוטנציאלי, יש לנקוט זהירות בעת שימוש בצורה של אבקה או תמיסה</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, נטול IgG</td><td>ריאגנט</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-161</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>ריאגנט</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>צמיג</td></tr></tbody></table>

immunocytochemistry: אדם בתאי גזע עצביים

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry היא שיטה חזקה מאוד פשוטה למדי לקביעת נוכחות, לוקליזציה subcellular, והשפע היחסי של אנטיגן של עניין, בדרך כלל חלבון, בתאים בתרבית. פרוטוקול זה מציג קל לעקוב אחר שורה של צעדים שיאפשרו לחוקרים כדי לחסוך נוגדנים ראשוניים ומשניים תוך קבלת איכות גבוהה, איכותי לשחזור נתונים כמותיים מתוך מכתים שלהם. ישנם שני היבטים של פרוטוקול זה מסייע לשמר את עוצמת הקול של נוגדן הכרחי מכתים. ראשית, התאים גדלים על, coverslips קטן עגול ממוקמים בארות צלחת בתרבית רקמה. לאחר קיבוע, התאים על coverslips ניתן להסיר את הבארות של הצלחת. עבור מכתים נוגדן, coverslip עם תאים הוא הפוך על ירידה קטנה של פתרון נוגדן על parafilm והוא מכוסה בחתיכת השני של parafilm כדי למנוע התייבשות. באמצעות שיטה זו, רק ~ 25 μl של פתרון נוגדן דרוש coverslip כל (או מדגם) להיות מוכתם. פרוטוקול זה מתאר immunostaining של האדם גזע / מבשר תאים עצביים (hNSPCs), אך יכול לשמש הרבה סוגי תאים אחרים.

Immunocytochemistry היא שיטה חזקה כדי לקבוע את הנוכחות, לוקליזציה subcellular, והשפע היחסי של אנטיגן עניין תאים בתרבית. פרוטוקול זה מציג קל לעקוב אחר שורה של צעדים שיאפשרו אחד לשמר נוגדנים להפיק את המרב של מכתים אחד.

Immunocytochemistry: אדם בתאי גזע עצביים

אימונוציטוכימיה היא שיטה עוצמתית מאוד ופשוטה למדי לקביעת הנוכחות, הלוקליזציה התת-תאית והשפעות היחסית של...

היי, אני סטיב. אני עובדת במעבדה של ד"ר פלנגן במחלקה לפתולוגיה באוניברסיטת קליפורניה, אירווין. והיום אני הולך להראות לכם כיצד לבצע אימונוכימיה של תאי קודמן עצביים אנושיים.פרוטוקול זה כולל הנחת תאים על החלקות כיסוי מצופות וחסימה ודגירה של תאים בנוגדנים ראשוניים למשך הלילה, ולאחר מכן ביצוע מספר פעמים והנחת נוגדן משני ובטמפרטורת החדר. ולבסוף, הרכבת הכיסוי מחליקה על טיסות מיקרוסקופים. בואו נתחיל.אז ראשית אני הולך להניח שלושה פתקי כיסוי זכוכית גרמניים סטריליים ברוחב 12 מילימטרים לתוך צלחת של 24 בארות על מנת לצפות אותם במינציה. אז עכשיו יש לי את החלקות הכיסוי שלי בצלחת, וראשית אני הולך להוסיף תמיסה של PDL poly lysine, ואני הולך לדגור את תת הכיסוי ב-PDL למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. אז עכשיו בתום חמש דקות, אני הולך להסיר PDL ולשים למינין, ואני הולך לדגור את החלקות הכיסוי בלמינציה למשך ארבע שעות לפחות או יותר טוב למשך הלילה.אז דגרתי את הצלחת למשך הלילה במינציה, ועכשיו אני הולך לשטוף את פתקי הכיסוי עם PBS ולצלחת תאי קודמן עצביים אנושיים שכבר ספרתי. אז פשוט הסרתי את תמיסות הלמינציה ועכשיו אני הולך לרסן את פתקי הכיסוי עם PBS. אז עכשיו אני הולך להסיר את PBS ולשים את פתרון המדיה.ולבסוף, אני מוכן לראות את התאים. אז אני הולך לראות את התאים במאה אלף תאים לטחנה, מה שאומר שעבור צלחת של 24 בארות אני הולך להוסיף 50,000 תאים לבאר, כי כי כל באר מכילה חצי מיליליטר. אז אני הולך להטות את הצלחת מצד לצד כדי לוודא שהתאים מתפשטים באופן שווה על פני השטח של החלקת הכיסוי.ועכשיו אני הולך לשים אותם באינקובטור למשך 24 שעות לפחות כדי לאפשר להם להתיישב ולהתפשט לאימונוכימיה. אז התאים גדלו במשך 24 שעות והסתכלתי עליהם והם מחוברים ומפוזרים יפה. אז עכשיו אני הולך לתקן אותם בגובה של 4% לחמש דקות.אבל קודם אני הולך להסיר את המדיה ואני לא רוצה לתת לתאים להתייבש. אז אני הולך להסיר את המדיה ולהוסיף מקבע בו זמנית. אז זה נקרא טכניקת שתי ידיים.אז עכשיו אני הולך לדגור על התאים בקיבוע במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. אז עברו חמש דקות. אני הולך להסיר PFA ולהניח אותו במיכל הפסולת של PFA ולהוסיף PBS במקביל אני מסיר PFA כדי שהתאים לא יתייבשו.אז אני הולך להשתמש באחת מפיפטות היניקה הפלסטיות האלה כדי למשוך PFA ואני הולך לכוון את הטיימר לחמש דקות. אז בזמן שהתאים שלי נמצאים בשטיפת PBS, אני הולך להכין פתרון הדמיה של סלסול באמצעות Triton X 100. זה חומר ניקוי לא יוני והוא מאוד מאוד צמיג.לכן חשוב להמתין עד שכל התמיסה תיכנס ונכנסת לפיפטה. אז אני הולך להכין פתרון של 0.3% ב-PBS, אני הולך להוסיף 10 מיל של PBS. ול-10 מיל של PBS האלה, אני הולך להוסיף 30 מיקרוליטר של tri 100 הבא.אז אני הולך להוסיף 30 מיקרוליטר של טרי הבא 100 עד 10 מיל של PBS. אז אני הולך להוסיף בערך 10 שניות כדי לתת לכל הפתרון להיכנס לקצה. אז אני, יש לי כאן את פתרון ניצול הפרם שלי.הנחתי אותו על המסובב למשך 10 דקות, ואז אני מערבל אותו כדי לוודא שהטריטון הצמיג נמס לחלוטין. אז עכשיו אני מוכן לעשות את שלב ההדמיה של סלסול. וכך אני הולך לחמש דקות בטמפרטורת החדר.אז עברו חמש דקות. אני הולך לעשות עכשיו שלוש שטיפות PBS של חמש דקות כדי לוודא שאני שוטף את כל הטריטון. אז שוב, אני הולך לכוון את השעון לחמש דקות.אז אני, בדיוק סיימתי את כל שלבי הכביסה שלי, אז אני מוכן לעשות את שלב החסימה. אז לשלב החסימה, הכנתי פתרון BSA של 5% ב-PBS. ובדיוק כמו עם כל השטיפות, אני הולך להסיר את ה-PBS ולהוסיף את פתרון החסימה בו זמנית.ושלב החסימה הולך להימשך שעה בטמפרטורת החדר. אז בזמן שהתאים שלי נחסמים, אני הולך להכין את הצלחת לדגירת נוגדנים ראשונית. אז אני אתחיל עם צלחת הזכוכית הזו, ואני הולך לחתוך פיסת סרט פרה בגודל הזה.ומה שאני הולך לעשות זה שאני הולך לעטוף את זה ואני צריך קצת סרט, אז אני הולך להזדקק לארבע חתיכות של סרט. אז אני פשוט הולך להכין את כולם. אז אני הולך לקחת את פיסת הסרט הזו ואני הולך ליישר אותה כך שהמשטח יהיה יפה וחלק.ואז אני הולך לקחת כל קצה ולהדביק אותו לחלק האחורי של צלחת הזכוכית. אז עכשיו אני הולך למשוך את זה בקצה השני כדי לוודא שהמשטחים ישרים, ואני הולך להדביק את הקצה השני לאחור. אז עכשיו אני צריך עוד חתיכת סרט זוגי בגודל זהה לראשון.ובעיקרון אני הולך לעשות את אותו הדבר. אז הדבקתי חתיכה שנייה של סרט פרה על גבי הראשונה, בדיוק כמו הראשונה, חוץ מזה שהשארתי קצה אחד של חתיכת הפרפיל השנייה רופף כי אני הולך להניח את תמיסת הנוגדן ואז להחליק כוח על החלק הראשון. ואז אני הולך להניח עליו את החתיכה השנייה שמכינה כריך.אבל כרגע, אני הולך לסמן את המקום שבו אני הולך לשים את תמיסת הנוגדנים ולכסות. אז, אז התאים נמצאים בתמיסת החסימה כבר שעה, ואני הולך לשים את החלקות הכיסוי על טיפות של נוגדנים ראשוניים לדגירה של לילה. אז אני הולך לשים טיפה של 35 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני, ואני הולך להיזהר מאוד לא להוציא את כל הנוזל כי זה עלול ליצור בועות ובועות עלולות להפריע לקשירת הנוגדן לאנטיגן.אז אני רוצה לנסות להימנע מבועות בטיפה, כל שלוש הטיפות של הנוגדנים הראשוניים, ואני מוכן, כדי להניח כיסוי, לכסות את ההחלקות עם תאים על הטיפות האלה. אז מה שאני הולך לעשות עכשיו זה להרים פתק כיסוי. אז ראשית אני הולך להזיז את החלקת הכיסוי הצידה ולנסות להרים אותה בעדינות כשהפינצטה פתוחה.ברגע שאני מרגיש שהשגתי את האחיזה של החלקת הכיסוי, אני הולך לסגור כדי לסגור לאט את הפינצטה ולהרים בעדינות את החלקה מהבאר. אז התאים כרגע נמצאים על גבי פתק הכיסוי. אז מה שאני הולך לעשות זה להפוך הפוך ולגעת בעדינות בטיפה ולהניח אותה לאט לאט על גבי הטיפה מבלי ליצור בועות.ולכן אני הולך לחזור על אותו הליך עם החלקות הכריכה השנייה והשלישית. והשלב האחרון הוא להניח את החלק השני של סרט הפרה למעלה. והדרך שבה אני הולך לעשות את זה היא שאני הולך להניח את זה בתנועה אחת כזו.אני רוצה לנסות להימנע מלזוז, להזיז אותו מצד לצד. ולבסוף אני הולך לאבטח אותו לתחתית הצלחת עם פיסת סרט נוספת. ועכשיו סוף סוף, התאים מוכנים לדגירה בארבע מעלות בן לילה, וזה סוף היום הראשון של האימונוכימיה.זה היום השני של הכימיה החיסונית, ואני הולך לשטוף את פתקי הכיסוי ב-PB S3 פעמים במשך חמש דקות. ואז אני הולך לדגור בנוגדנים משניים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. ראשית, אני הולך לחתוך את סרט הפרה ככה כדי שאוכל להסיר את פתקי הכיסוי.ואני הולך להרים את החלק העליון של סרט הפרה לאט כך שהחלקות הכיסוי יישארו על החלק התחתון של סרט הטיפול. אז הסרתי את החתיכה הראשונה ויש לי צלחת עם תמיסת כביסה PBS מוכנה. אז אני הולך להרים כל מרק כיסוי ולהניח אותו לתוך הבאר כדי לשטוף את כל הנוגדן הראשוני שנותר שלא נצמד לאפיטופ.אז כדי להרים את פתק הכיסוי, אני הולך קודם להחזיק אותו ככה עם סכין גילוח ופשוט לנסות בעדינות להרים אותו. ומכיוון שהתאים נמצאים מול תמיסת הנוגדנים, אני הולך להפוך אותם כך שהם יהיו למעלה עכשיו ולגרום להחלקה לתוך הבאר כך שעדיין יישארו למעלה. ואני הולך לחזור על ההליך עבור תלושי החשמל הנותרים.וכך הם הולכים להישטף במשך חמש דקות. אז עברו חמש דקות. אני הולך להחליף את הפתרון של PBS.אני הולך להוסיף את הווים למות. עכשיו אני הולך לדגור אותו במשך חמש דקות. אז הדגירה של הווים הסתיימה, ועכשיו אני מוכן להרכיב כיסוי sos ולהסתכל עליהם.אז ראשית אני הולך לאלקט מגן וקטורי מרובע, שעוזר לשמור על המטבעות הפלואורסצנטיים להלבנה. אני הולך, ובכן, קודם אני הולך לתייג את השקופית עם מספרי פתקי הכיסוי, ואז אני הולך למקם 10 מיקרוליטר של מגן וקטורי. מגן וקטור הוא, הוא שמן והוא ממש צמיג, אז זהו, חשוב גם לחכות קצת עד שהכל ייכנס לקצה.אז הנחתי מגן וקטורי על שקופית המיקרוסקופ, ועכשיו אני מוכן להניח את החלקות הכיסוי, על שקופית המיקרוסקופ. אז מה שאני הולך לעשות קודם כל זה להרים פתק כיסוי ואני הולך לשטוף את החלק האחורי של פתק הכיסוי במים נטולי יונים, כי אם לא אעשה זאת, כשהוא יתייבש, המלח שהיה ב-PBS יתגבש וזה יפריע לתכונות האופטיות של קוביות פלואורסצנטיות. אז אני הולך, יש לי את המים נטולי היונים שלי מוכנים.אז אני הולך להרים את פתק הכיסוי ואני הולך לשטוף את החלק האחורי שלו במים נטולי יונים. ואז אני הולך לגעת במגבון פח כדי לייבש אותו. ואז אני הולך להפוך אותו שוב כך שצד התא יהיה הפוך ויורד אל שקופית המיקרוסקופ.ובדיוק כמו קודם, אני הולך לגעת בטיפת המגן הווקטורי ולהוריד אותה לאט לאט מבלי ללכוד בועות. ואני הולך לחזור על אותו הדבר, אותו נוהל, עבור כל היפוכי המטען. ועכשיו בואו נסתכל.זו דוגמה למה שאתה עשוי לקבל לאחר שעשית כימיה חיסונית והשגת התמונות שלך והכנת שכבות-על וכדומה. אז בתמונה הזו, זו, זו תמונה של תאי גזע עצביים בהיפוקמפוס שבודדו מ-dent gys בעכברים לאחר לידה. היום הראיתי לכם כיצד לבצע כימיה חיסונית של תאי קודמן עצביים אנושיים.ואם תשימו לב, טכניקה זו מאפשרת לכם לשמור את מגיב הנוגדנים הרחב. השתמשנו בנפח קטן מאוד של נוגדנים ראשוניים ומשניים על ידי הנחת טיפה קטנה על פרפיל והיפוך החלקה עם התאים מעליה. אז תמשיכו, תעשו כימיה אימונותרפית, ותודה שצפיתם בי.

immunocytochemistry-human-neural-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מכתים השעיה immunocytochemical בתאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) על פני קרום התא סמנים (SSEA-3/SSEA-4) הושג על בסיס השימוש במנגנון cytospin מתוצרת עצמית כדי ליצור monolayer של תאים להסתכלות וכימות.

ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin

זה פרוטוקול וידאו מדגים כיצד להפלות ו למנות בתום תאים בתום גזע עצביים באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר באמצעות assay עצביים המושבה יוצרי התא.

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

סרטון זה מדגים את ההליך להכתמת תאי גזע עצביים חדשים במקטעי רקמת מוח באמצעות שילוב EdU, ואחריו immunofluorescence כדי לדמיין חלבונים ספציפיים, שיפור ההבנה של דינמיקה התא והתפשטות.

צביעת אימונופלואורסצנטיות להדמיית תאי גזע עצביים מתרבים באזורי מוח עכבר

מקור: Becker-Kojić, Z. A., et. al., ייצור ללא GM של תאי עצב שמקורם בדם. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון מדגים פרוטוקול להכנת תאים עצביים שמקורם בתאי דם היקפיים מתוכנתים מחדש למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המציג סוגי תאים שונים ושלבי התפתחות באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית.

מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של תאים עצביים מובחנים מתאים שמקורם בדם היקפי 

תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

אנו מספקים תיאור מפורט של פרוטוקול לניתוח זרימה ציטומטרי של אנטיגנים פני השטח ו/או אנטיגנים תוך-תאיים בסוגי תאים עצביים. היבטים קריטיים של תכנון ניסויים, הליכים מתודולוגיים שלב אחר שלב ועקרונות בסיסיים של ציטומטריית זרימה מוסברים על מנת לאפשר לנוירוביולוגים לנצל טכנולוגיה רבת עוצמה זו.

ניתוח cytometry זרימת פרוטוקולים למשטח והתאי Antigen של סוגי תאים עצביים

שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

תאי גזע עצביים (NSCs) להתייחס לתאים אשר יכול עצמית לחדש ולבדל לשלוש השושלות עצביות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לקבוע תדירות המל"ל באוכלוסיית תא נתונה באמצעות neurosphere היווצרות והבחנה בתנאים משובטים.

ספירת בתאי גזע עצביים באמצעות מבחני המשובטים

פרוטוקול זה מדגים מתודולוגיות עבור מודל העכבר של פגיעה במוח הגולגולת טראומה טראומטית השתלת הגוף האנושי המושרה pluripotent שפעה התאים הנגזר לתוך האתר פציעה. מבחנים התנהגותיים והיסטולוגיים של תוצאות מהליכים אלה מתוארים גם בקצרה.

מבוקרת מודל השפעה בקליפת המוח של פגיעה במוחו של העכבר עם השתלת הטיפולית של האדם המושרה Pluripotent תא גזע תאים הנגזרים

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיות לזיהוי והעשרה של מצב התא בתרביות תאי גזע עצביים ראשוניים של עכברים בוגרים על ידי הדמיה אוטופלואורסצנטית באמצעות i) מיקרוסקופ קונפוקלי, ii) ממיין תאים מופעל פלואורסצנטי לביצוע דימות עוצמה, או iii) מיקרוסקופ מולטיפוטון לביצוע הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים.

סיווג מצב הפעלת תאי גזע עצביים במבחנה באמצעות אוטופלואורסנציה

למד טכניקת אימונוציטוכימיה לניתוח תאי גזע עצביים אנושיים. פרוטוקול זה מדגים אופטימיזציה של שימוש בנוגדנים ויעילות צביעה לתוצאות ברות שחזור במחקר נוירו-ביולוגי.

Immunocytochemistry: אדם בתאי גזע עצביים

גלה סרטונים נוספים