Immunocytochemistry: אדם בתאי גזע עצביים

היי, אני סטיב. אני עובדת במעבדה של ד"ר פלנגן במחלקה לפתולוגיה באוניברסיטת קליפורניה, אירווין. והיום אני הולך להראות לכם כיצד לבצע אימונוכימיה של תאי קודמן עצביים אנושיים.

פרוטוקול זה כולל הנחת תאים על החלקות כיסוי מצופות וחסימה ודגירה של תאים בנוגדנים ראשוניים למשך הלילה, ולאחר מכן ביצוע מספר פעמים והנחת נוגדן משני ובטמפרטורת החדר. ולבסוף, הרכבת הכיסוי מחליקה על טיסות מיקרוסקופים. בואו נתחיל.

אז ראשית אני הולך להניח שלושה פתקי כיסוי זכוכית גרמניים סטריליים ברוחב 12 מילימטרים לתוך צלחת של 24 בארות על מנת לצפות אותם במינציה. אז עכשיו יש לי את החלקות הכיסוי שלי בצלחת, וראשית אני הולך להוסיף תמיסה של PDL poly lysine, ואני הולך לדגור את תת הכיסוי ב-PDL למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. אז עכשיו בתום חמש דקות, אני הולך להסיר PDL ולשים למינין, ואני הולך לדגור את החלקות הכיסוי בלמינציה למשך ארבע שעות לפחות או יותר טוב למשך הלילה.

אז דגרתי את הצלחת למשך הלילה במינציה, ועכשיו אני הולך לשטוף את פתקי הכיסוי עם PBS ולצלחת תאי קודמן עצביים אנושיים שכבר ספרתי. אז פשוט הסרתי את תמיסות הלמינציה ועכשיו אני הולך לרסן את פתקי הכיסוי עם PBS. אז עכשיו אני הולך להסיר את PBS ולשים את פתרון המדיה.

ולבסוף, אני מוכן לראות את התאים. אז אני הולך לראות את התאים במאה אלף תאים לטחנה, מה שאומר שעבור צלחת של 24 בארות אני הולך להוסיף 50,000 תאים לבאר, כי כי כל באר מכילה חצי מיליליטר. אז אני הולך להטות את הצלחת מצד לצד כדי לוודא שהתאים מתפשטים באופן שווה על פני השטח של החלקת הכיסוי.

ועכשיו אני הולך לשים אותם באינקובטור למשך 24 שעות לפחות כדי לאפשר להם להתיישב ולהתפשט לאימונוכימיה. אז התאים גדלו במשך 24 שעות והסתכלתי עליהם והם מחוברים ומפוזרים יפה. אז עכשיו אני הולך לתקן אותם בגובה של 4% לחמש דקות.

אבל קודם אני הולך להסיר את המדיה ואני לא רוצה לתת לתאים להתייבש. אז אני הולך להסיר את המדיה ולהוסיף מקבע בו זמנית. אז זה נקרא טכניקת שתי ידיים.

אז עכשיו אני הולך לדגור על התאים בקיבוע במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. אז עברו חמש דקות. אני הולך להסיר PFA ולהניח אותו במיכל הפסולת של PFA ולהוסיף PBS במקביל אני מסיר PFA כדי שהתאים לא יתייבשו.

אז אני הולך להשתמש באחת מפיפטות היניקה הפלסטיות האלה כדי למשוך PFA ואני הולך לכוון את הטיימר לחמש דקות. אז בזמן שהתאים שלי נמצאים בשטיפת PBS, אני הולך להכין פתרון הדמיה של סלסול באמצעות Triton X 100. זה חומר ניקוי לא יוני והוא מאוד מאוד צמיג.

לכן חשוב להמתין עד שכל התמיסה תיכנס ונכנסת לפיפטה. אז אני הולך להכין פתרון של 0.3% ב-PBS, אני הולך להוסיף 10 מיל של PBS. ול-10 מיל של PBS האלה, אני הולך להוסיף 30 מיקרוליטר של tri 100 הבא.

אז אני הולך להוסיף 30 מיקרוליטר של טרי הבא 100 עד 10 מיל של PBS. אז אני הולך להוסיף בערך 10 שניות כדי לתת לכל הפתרון להיכנס לקצה. אז אני, יש לי כאן את פתרון ניצול הפרם שלי.

הנחתי אותו על המסובב למשך 10 דקות, ואז אני מערבל אותו כדי לוודא שהטריטון הצמיג נמס לחלוטין. אז עכשיו אני מוכן לעשות את שלב ההדמיה של סלסול. וכך אני הולך לחמש דקות בטמפרטורת החדר.

אז עברו חמש דקות. אני הולך לעשות עכשיו שלוש שטיפות PBS של חמש דקות כדי לוודא שאני שוטף את כל הטריטון. אז שוב, אני הולך לכוון את השעון לחמש דקות.

אז אני, בדיוק סיימתי את כל שלבי הכביסה שלי, אז אני מוכן לעשות את שלב החסימה. אז לשלב החסימה, הכנתי פתרון BSA של 5% ב-PBS. ובדיוק כמו עם כל השטיפות, אני הולך להסיר את ה-PBS ולהוסיף את פתרון החסימה בו זמנית.

ושלב החסימה הולך להימשך שעה בטמפרטורת החדר. אז בזמן שהתאים שלי נחסמים, אני הולך להכין את הצלחת לדגירת נוגדנים ראשונית. אז אני אתחיל עם צלחת הזכוכית הזו, ואני הולך לחתוך פיסת סרט פרה בגודל הזה.

ומה שאני הולך לעשות זה שאני הולך לעטוף את זה ואני צריך קצת סרט, אז אני הולך להזדקק לארבע חתיכות של סרט. אז אני פשוט הולך להכין את כולם. אז אני הולך לקחת את פיסת הסרט הזו ואני הולך ליישר אותה כך שהמשטח יהיה יפה וחלק.

ואז אני הולך לקחת כל קצה ולהדביק אותו לחלק האחורי של צלחת הזכוכית. אז עכשיו אני הולך למשוך את זה בקצה השני כדי לוודא שהמשטחים ישרים, ואני הולך להדביק את הקצה השני לאחור. אז עכשיו אני צריך עוד חתיכת סרט זוגי בגודל זהה לראשון.

ובעיקרון אני הולך לעשות את אותו הדבר. אז הדבקתי חתיכה שנייה של סרט פרה על גבי הראשונה, בדיוק כמו הראשונה, חוץ מזה שהשארתי קצה אחד של חתיכת הפרפיל השנייה רופף כי אני הולך להניח את תמיסת הנוגדן ואז להחליק כוח על החלק הראשון. ואז אני הולך להניח עליו את החתיכה השנייה שמכינה כריך.

אבל כרגע, אני הולך לסמן את המקום שבו אני הולך לשים את תמיסת הנוגדנים ולכסות. אז, אז התאים נמצאים בתמיסת החסימה כבר שעה, ואני הולך לשים את החלקות הכיסוי על טיפות של נוגדנים ראשוניים לדגירה של לילה. אז אני הולך לשים טיפה של 35 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני, ואני הולך להיזהר מאוד לא להוציא את כל הנוזל כי זה עלול ליצור בועות ובועות עלולות להפריע לקשירת הנוגדן לאנטיגן.

אז אני רוצה לנסות להימנע מבועות בטיפה, כל שלוש הטיפות של הנוגדנים הראשוניים, ואני מוכן, כדי להניח כיסוי, לכסות את ההחלקות עם תאים על הטיפות האלה. אז מה שאני הולך לעשות עכשיו זה להרים פתק כיסוי. אז ראשית אני הולך להזיז את החלקת הכיסוי הצידה ולנסות להרים אותה בעדינות כשהפינצטה פתוחה.

ברגע שאני מרגיש שהשגתי את האחיזה של החלקת הכיסוי, אני הולך לסגור כדי לסגור לאט את הפינצטה ולהרים בעדינות את החלקה מהבאר. אז התאים כרגע נמצאים על גבי פתק הכיסוי. אז מה שאני הולך לעשות זה להפוך הפוך ולגעת בעדינות בטיפה ולהניח אותה לאט לאט על גבי הטיפה מבלי ליצור בועות.

ולכן אני הולך לחזור על אותו הליך עם החלקות הכריכה השנייה והשלישית. והשלב האחרון הוא להניח את החלק השני של סרט הפרה למעלה. והדרך שבה אני הולך לעשות את זה היא שאני הולך להניח את זה בתנועה אחת כזו.

אני רוצה לנסות להימנע מלזוז, להזיז אותו מצד לצד. ולבסוף אני הולך לאבטח אותו לתחתית הצלחת עם פיסת סרט נוספת. ועכשיו סוף סוף, התאים מוכנים לדגירה בארבע מעלות בן לילה, וזה סוף היום הראשון של האימונוכימיה.

זה היום השני של הכימיה החיסונית, ואני הולך לשטוף את פתקי הכיסוי ב-PB S3 פעמים במשך חמש דקות. ואז אני הולך לדגור בנוגדנים משניים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. ראשית, אני הולך לחתוך את סרט הפרה ככה כדי שאוכל להסיר את פתקי הכיסוי.

ואני הולך להרים את החלק העליון של סרט הפרה לאט כך שהחלקות הכיסוי יישארו על החלק התחתון של סרט הטיפול. אז הסרתי את החתיכה הראשונה ויש לי צלחת עם תמיסת כביסה PBS מוכנה. אז אני הולך להרים כל מרק כיסוי ולהניח אותו לתוך הבאר כדי לשטוף את כל הנוגדן הראשוני שנותר שלא נצמד לאפיטופ.

אז כדי להרים את פתק הכיסוי, אני הולך קודם להחזיק אותו ככה עם סכין גילוח ופשוט לנסות בעדינות להרים אותו. ומכיוון שהתאים נמצאים מול תמיסת הנוגדנים, אני הולך להפוך אותם כך שהם יהיו למעלה עכשיו ולגרום להחלקה לתוך הבאר כך שעדיין יישארו למעלה. ואני הולך לחזור על ההליך עבור תלושי החשמל הנותרים.

וכך הם הולכים להישטף במשך חמש דקות. אז עברו חמש דקות. אני הולך להחליף את הפתרון של PBS.

אני הולך להוסיף את הווים למות. עכשיו אני הולך לדגור אותו במשך חמש דקות. אז הדגירה של הווים הסתיימה, ועכשיו אני מוכן להרכיב כיסוי sos ולהסתכל עליהם.

אז ראשית אני הולך לאלקט מגן וקטורי מרובע, שעוזר לשמור על המטבעות הפלואורסצנטיים להלבנה. אני הולך, ובכן, קודם אני הולך לתייג את השקופית עם מספרי פתקי הכיסוי, ואז אני הולך למקם 10 מיקרוליטר של מגן וקטורי. מגן וקטור הוא, הוא שמן והוא ממש צמיג, אז זהו, חשוב גם לחכות קצת עד שהכל ייכנס לקצה.

אז הנחתי מגן וקטורי על שקופית המיקרוסקופ, ועכשיו אני מוכן להניח את החלקות הכיסוי, על שקופית המיקרוסקופ. אז מה שאני הולך לעשות קודם כל זה להרים פתק כיסוי ואני הולך לשטוף את החלק האחורי של פתק הכיסוי במים נטולי יונים, כי אם לא אעשה זאת, כשהוא יתייבש, המלח שהיה ב-PBS יתגבש וזה יפריע לתכונות האופטיות של קוביות פלואורסצנטיות. אז אני הולך, יש לי את המים נטולי היונים שלי מוכנים.

אז אני הולך להרים את פתק הכיסוי ואני הולך לשטוף את החלק האחורי שלו במים נטולי יונים. ואז אני הולך לגעת במגבון פח כדי לייבש אותו. ואז אני הולך להפוך אותו שוב כך שצד התא יהיה הפוך ויורד אל שקופית המיקרוסקופ.

ובדיוק כמו קודם, אני הולך לגעת בטיפת המגן הווקטורי ולהוריד אותה לאט לאט מבלי ללכוד בועות. ואני הולך לחזור על אותו הדבר, אותו נוהל, עבור כל היפוכי המטען. ועכשיו בואו נסתכל.

זו דוגמה למה שאתה עשוי לקבל לאחר שעשית כימיה חיסונית והשגת התמונות שלך והכנת שכבות-על וכדומה. אז בתמונה הזו, זו, זו תמונה של תאי גזע עצביים בהיפוקמפוס שבודדו מ-dent gys בעכברים לאחר לידה. היום הראיתי לכם כיצד לבצע כימיה חיסונית של תאי קודמן עצביים אנושיים.

ואם תשימו לב, טכניקה זו מאפשרת לכם לשמור את מגיב הנוגדנים הרחב. השתמשנו בנפח קטן מאוד של נוגדנים ראשוניים ומשניים על ידי הנחת טיפה קטנה על פרפיל והיפוך החלקה עם התאים מעליה. אז תמשיכו, תעשו כימיה אימונותרפית, ותודה שצפיתם בי.