Name: Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: למד שיטת ניתוח והדמיית אזורי פעילות סינפטית בזבובית Drosophila melanogaster. פרוטוקול זה מאפשר חקר מבנה ותפקוד מפרקי עצב-שריר ומחלות נוירולוגיות קשורות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר Nael עלמי וד&quot;ר נאם צ&#39;ול קים על הערותיו המועילות שלהם על כתב היד הזה.

1. הכנה immunofluorescence: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור משטח לנתח, לשפוך Sylgard 184 אלסטומר בסיס סיליקון לתוך צלחת קטנה רקמת תרבות. הקפד לא למלא את הצלחת לחלוטין כך שאזור לנתיחה נמוך יותר שולי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך סיכות לנתיחה לאורך של כ 3.5 מ"מ על מנת להקל מוגברת של מניפולציה, וודא שיש לפחות 6 פינים לכל זחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יהיה עליך מלקחיים בוטה שיאפשרו לך לתפוס את הפינים לנתיחה. </li></ol> 2. Dissection של הזחלים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נדודים third הזחלים instar כי הם זוחלים סביב צדי הבקבוקון ולא החלו pupate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצב זחל על פני דיסקציה תחת stereomicroscope. וויק משם moister עודף באמצעות Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדר כל זחל כך את הצד הגבי הוא פונה כלפי מעלה. תוכל לראות שני קנה הנשימה, קווים לבנים בצד הגבי של הזחלים. נסו מרכז אלה באמצע ככל האפשר כי זה מסמן את קו האמצע הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להצמיד # 1 בדיוק מעל הפה ווים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להצמיד # 2 בזנב בדיוק מעל spiracles בין tracheae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כמות קטנה של PBS על הזחלים כדי למנוע התייבשות לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים לעיל עם זחלים כל, לוודא כי גנוטיפים מופרדים מרחבית על ידי הצבת סיכה בין גנוטיפ אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנו ימינה קטן חתך רוחבי מעל סיכה מס '2 על פני שניהם וקנה הנשימה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מספריים שלך לחתוך את החתך הראשון לאורך קו האמצע הגבי בין וקנה הנשימה כל הדרך עד פינים בעבר # 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יהיה עליך לבצע חתכים קטנים אחרים בתחתית הדף מאוד של כל צד של לציפורן, כך הצדדים על ימין ועל שמאל יפתח המאפשר לך להצמיד אותם ללא משיכת לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להצמיד # של 3, 4, 5, ו -6 בכל פינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את המדגם עם PFA 4% עבור 20-25 דקות בטמפרטורת החדר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג PFA ולשטוף עם 3-4 פעמים PBS, decanting בכל פעם. </li></ol> 3. הסרה של רקמה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי הסרת רקמות בקצה האחורי כי בדרך כלל אתה רוצה להגן על האזור שבו נמצא המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שימוש steromicroscope עם הזחלים תחת ירידה של PBS, הראשון לתפוס את הקצה האחורי של אחד קנה הנשימה ולשלוף אותו החוצה אשר עשוי להסיר חלק של הגוף את השומן עם זה. חזור על קנה הנשימה עבור השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס כמה שומן הגוף המעי האחורי או למשוך אותם מתוך הכנה. לאחר שרוב רקמת האחורי הוסר, להתמקד בהסרת רקמות קטנות סביב המוח. אם אתה מעוניין רק את השרירים, או המורפולוגיה של NMJ ניתן להסיר את המוח גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של המוח מאפשר ראיה טובה יותר של 31 שרירים, אשר מהווה סמן מועיל אוריינטציה קטע הבטן. </li></ol> 4. Immunofluorescence עבור אזורי פעילות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את סוכן חוסם (5% סרום עיזים רגיל ב PBS) ל preps גזור בצלחת לנתיחה. חסום במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. אם אתה רוצה לעשות רק פתרון אחד עבור חסימת נוגדן דילולים, כולל 0.1% TritonX-100 לסוכן חסימת שלך permeabilization רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את הנוגדן ראשי מדולל חסימת מגיב עם 0.1% TritonX-100. הנוגדן אזור פעיל ניתנת להשגה דרך התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). השתמש נוגדן התייחסות (למשל חזרת peroxidase-Cy3 המצומד) לתווית קרום NMJ וגם אקסונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדנים העיקרי ב 4 ° C למשך הלילה. אז זה היובש של המקרר לא יתאדה הפתרון נוגדן, ליצור תא לחות על ידי הצבת קצת מים בחלק התחתון של תיבת בשימוש קצה פיפטה. מכסים את מכסה שקוף עם רדיד אלומיניום כדי להפחית את הניאון הלבנה. מניחים את השקופית לנתיחה בתא לחות לשים את הקופסה כולה ב 4 ° C חממה לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לשטוף עם PBST (PBS עם 0.2% Triton-X-100) 50-10 פעמים למשך 5-10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן המשני (למשל עיזים Invitrogen אלקסה אנטי Mouse-488) מדולל חסימת מגיב עם 0.1% TritonX-100 בטמפרטורת החדר למשך 2-4 שעות בחדר מכוסה לחות. כלול כתם גרעיני (למשל DAPI) ב המשני, אם אתה רוצה לזהות את המיקום של גרעין בשרירים או המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBST (PBS עם 0.02% Triton-X-100) 50-10 פעמים למשך 5-10 דקות כל אחד. </li></ol> 5. הרכבה דוגמאות הזחל על שקופיות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג ואת הפתיל את לשטוף PBST האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה גליצרול 80% 1mL כ לכסות את פרוות הזחל מרותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 5 מתוך 6 סיכות הזחלים כל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתה מוכן לשים את גנוטיפ הראשון בשקופית להסיר את הסיכה האחרונה הזחלים כל genoty כיPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופית "לשטוף" על ידי הצבת שתי טיפות בינוני הרכבה שלך בשקופית נקי. שלב זה חשוב לשטוף את הפתרון מים את הזחלים עבור הרכבה וברורה הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את אחד הזחל בזנב עם מלקחיים הבוטה שלך, גרור את הזחל סביב גליצרול ולאחר מכן בשולי יבש מנה דיסקציה שלך, להסיר את רוב גליצרול. מניחים את הזחלים לירידה בינונית הראשון גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 6 עבור כל הזחלים של גנוטיפ זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל הזחלים נמצאים ירידה בינונית הראשון גובר, לתפוס את הזחל הראשון הזנב ולמשוך אותו דרך ירידה, ואז בשולי יבש הצלחת להסיר רוב של המדיום. אז במקום הזחלים לירידה בינוני השני גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 8 עבור הזחלים כל עם גנוטיפ זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השקופית הסופי שלך על ידי תיוג זה הצבת קטן בצורת "T" של המדיום הרכבה בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו בשלב 5.8, לתפוס את הזחל בזנבו; למשוך את העור באמצעות ירידה בינונית השני גובר ולאחר מכן בצדי יבש של השקופית "לשטוף". לאחר שרוב בינוני הגיע משם, במקום לזרוק הזחל בשקופית האחרונה המדיום גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לכל פרוות הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי כל פרוות הזחל מסודרים לפי הצורך לוודא שהצד לציפורן הוא מטה את השריר חשוף הוא פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת לכסות בשקופית כדי לכסות את הזחלים גזור, עם קצה ההתחלה בשורה העליונה של "טי" </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים משקל קטן (למשל 9 וולט סוללה) על להחליק את המכסה, ולוודא כי המדיום הרכבה מתפשט לחלוטין תחת להחליק את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית מרווה פלורסנט האפשר, במקום להחליק במגירה או מקום חשוך עד בינוני הרכבה ריפא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את המדיום הזה גובר על גדותיו קצוות של להחליק את המכסה. נקה את עודפי בינוני הרכבה יבש על להחליק את מכסה או שקופיות עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור חותם סופי, חותם עם לציפורניים. </li></ol> 6. נציג תוצאות: שקופית דוגמה הזחלים גזור ו immunostained מוצג באיור 2. כאשר והניתוחים זחלים, כתמים, הרכבה מתבצעים כראוי, המשתמש יכול לזהות את שריר זחלים של עניין (איור 3) במגזרי A2-A6. הואנג et al. מספק תיאור מפורט של עמדת שרירים, כמו גם אפיון של boutons סינפטי ספציפי (Hoang ו צ'יבה, 2001). שימוש למטרה מתח גבוה המשתמש יכול להתמקד סינפסה אחת ולקחת Z-מחסנית התמונה. מקסימום נציג הקרנת תמונה של חלק סינפסה 6 / 7 מוצג (איור 4). לאחר מכן באמצעות תוכנת הדמיה, אזורים פעילה ניתן להעריך כמותית עבור המאפיינים כי הם במיוחד פנוטיפ מוטנטי שלך. דוגמאות של תכונות שעשויות להשתנות פנוטיפ מוטנט מסוים לכלול את המספר הכולל, עוצמת flourescence, ואת המרווח בין אזורי פעיל. פוטנציאל החסרונות: הערכה immunofluorescence לצומת neuromuscular הזחל היא מערכת יקר שיכול לספק תובנה חשובה בביולוגיה הסינפטי, אם כי יש בעיות פוטנציאליות שיכולות להגביל את השירות של מערכת זו. לדוגמה, לעתים קרובות רצוי התמונה דפוס מכתים של שניים או יותר נוגדנים העיקרי מדגם זהה. הבחירה העיקרית של נוגדנים מתאימים, fluorophores המתאים, בקרות שליליות מתאימות חיונית להצלחה. אם הדמיה two אנטיגנים בניסוי שלך, להיות בטוח כי נוגדנים העיקריים הם ממינים שונים, כך שכל חלבון של עניין ניתן לזהות באופן ייחודי עם נוגדן משנית שכותרתו fluorescently. הדרך המומלצת כדי להפחית את הרקע היא להשתמש סוכן חסימת המכיל את בסרום נורמלי של המין שממנו נגזרו משני נוגדנים (למשל להשתמש בסרום עז נורמלי כסוכן חסימת בעת השימוש עז נגד ארנב או עכבר אנטי נוגדנים משני). לאחר תכנון נוגדנים ראשוניים ומשניים כי תשתמש בניסוי שלך, עליך לשקול גם כולל בקרות מכתים שלך קובע כדי להבטיח את האות ניאון שאתם רואים הוא אמיתי ולא רק רקע. במידת האפשר, כולל דגימות בקרה שלילית שאינם מכילים את החלבון של עניין. זה נעשה בקלות על ידי בעל חיים, כולל סוג בר במחקרים של overexpression transgene אקסוגניים, אך במקרים מסוימים ניתן לבצע באמצעות מוטציה הומוזיגוטים של חלבון העניין שלך. עוד לשלוט שלילי חיוני, שימושי למדידת רמות הרקע של האות ניאון שלך, היא להשתמש נוגדנים משני ללא לרבות הראשי. כאשר preps הדמיה וכתוצאה שלך, חשוב להבין כי כל אות ניאון שאתם רואים לא יכול להיות אמיתי, יכול להיות הרקע יונוגדנים משני ur או מרקע רקמות אנדוגני. ייתכן שיהיה עליך לנרמל את התמונות שלך לשקול הקרינה רקע כאשר assaying לשינויים בין עוצמת הקרינה. בחירת fluorophore חייב להיות גם עם טיפול. בחינת עירור לבין ספקטרום הפליטה fluorophore כל יכולת ייחודית לזהות כל אות היא חיונית כדי למנוע דימום דרך הערוץ. אם יש חוסר ודאות, דרך פשוטה לקבוע אם היקף לדמם דרך היא immunostain עם נוגדן fluorophore שכותרתו אחד בכל פעם, לבדוק את התמונה עם כל ערוץ כי תשתמש בניסוי הסופי. זה צריך לגלות אם לדמם דרך מתרחש עם סט מיקרוסקופ מסנן שלך. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים זרימה של חיתוך לציפורן והמיקום של סיכות 1-6. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/2676/2676fig1_large.jpg">לחץ כאן כדי להציג תמונה מוגדלת</a> <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. המיקום של הזחלים בשקופית האחרונה. ודא preps הזחלים נחשפים לצד שריר מעלה מטה בצד לציפורן. השאירו לפחות רוחב גוף הזחל שביניהם מדגם זה. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. כאשר הדמיה, לאתר את השרירים קטעים של עניין. בצמתים neuromuscular נפוצות מאופיין השרירים innervate 6 / 7, 13 שרירים, 12 שרירים, או שריר 4. בצד השני של קו האמצע הגחון, יש תמונת ראי שריר המבנה של קטע, חמי המוצג. השתמש שרירים 31 כסמן לזהות איזה קטע שאתה הדמיה. תמונה הסינפסות אותו וקטעי לשארית דגימות שלך, איסוף תמונות סינפטיים רבים לכל גנוטיפ שניתן להשתמש בהם עבור כימות. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. המרבי נציג הקרנת תמונה של חלק של שריר NMJ innervating 6 / 7 מוצג. NC82 (Bruchpilot) מכתים מוצג ירוק. HRP מראש הסינפטי כתם מוצג באדום. שים לב punctae אזור פעיל כי ניתן לכמת עוד יותר על ידי תוכנת הדמיה.

<ol><li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li>
<li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li>
<li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li>
<li>Keshishian, H., Kim, Y. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+development+and+function%3A+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li>
<li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly%2C+Ca2%2B+Channel+Clustering%2C+and+Vesicle+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li>
<li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+neuromuscular+junction%3A+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
<li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+ALS%3A+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li>
<li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., Dürrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot%2C+a+Protein+with+Homology+to+ELKS%2FCAST%2C+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li>
<li>Zweier, C., Jong, E. K. de, Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

עבור נוירונים, אזור מסוף סינפטי היא בעלת חשיבות קריטית, הוא הגשר תקשורת נאותה בין הפוסט לבין מראש הסינפטי התאים. דרך רבת עוצמה כדי לחקור את בריאותם של הנוירון במודלים של המחלה היא לנתח חלבונים של המסוף הסינפטי ידי immunofluorescence. השיטה המוצגת כאן immunofluorescence מאפשרת לחוקר לבחון זחלים רבים בו זמנית תוך צמצום הבדלים סביבתיים בין הקבוצות. מערכת העצבים המרכזית של הזחלים שלישי instar תסיסנית יש יתרונות רבים כולל סינפסות glutamatergic, ממופה וחזר מסופי הסינפטי, הנגישו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Sylgard 184 אלסטומר בסיס סיליקון </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> לאחר ערבוב לאפשר לבועות לעלות באיטיות על ידי לשים על הכתף או איטי המאפשר לשבת במשך 30 דקות או יותר. </td></tr><tr><td> נירוסטה Minutien סיכות </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 26002-10 </td><td> Trim כדי כ. 3-4 מ&quot;מ באורך קבוע עם מספריים </td></tr><tr><td> Laminectomy מלקחיים (בלאנט, משמש אחיזה סיכות) </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11223-20 </td><td> השתמש כמו מלקחיים בוטה עבור אחיזה סיכות </td></tr><tr><td> Dissection מלקחיים </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas עדין מאוד מספריים, 8cm רב </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר אנטי Brp נוגדן </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> השתמש 1:50 דילול </td></tr><tr><td> Cy3 Affinipure נגד חזרת עיזים peroxidase </td><td> ג&#39;קסון Immunoresearch </td><td> 123-165-021 </td><td> השתמש ב דילול 1:200 </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר עיזים IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> השתמש כ. דילול 1:200 </td></tr></tbody></table>

dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית neuromuscular צומת

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Neuromuscular הזחלים תסיסנית צומת (NMJ) הוא מודל מצוין לחקר מבנה ותפקוד הסינפטי ו. תסיסנית ידועה הקלות של מניפולציות גנטיות חזק ומערכת העצבים הזחל הוכיחה שימושי במיוחד ללמוד לא רק על התפקוד התקין אלא גם הפרעות המלווים כמה מחלות נוירולוגיות (לויד טיילור, 2010). רבים מולקולות הסינפטי המפתח נמצא תסיסנית מצויים גם יונקים כמו רוב CNS סינפסות מעוררות אצל יונקים, NMJ תסיסנית הוא glutamatergic ומדגים פעילות תלויי שיפוץ (Koh et al., 2000). בנוסף, נוירונים תסיסנית ניתן לזהות בנפרד כי דפוסי העצבוב שלהם סטריאוטיפי וחוזר על עצמו כך שניתן ללמוד המסופים הסינפטיים מזוהה, כגון אלה בין הנוירונים המוטוריים בגוף קיר סיבי השריר שהם innervate (Keshishian וקים, 2004). קיומם של מרכיבים סינפסה שמור באבולוציה, יחד עם הקלות של מניפולציה גנטית ופיזית הדגם תסיסנית אידיאלי לחקור את המנגנונים פונקציה הסינפטי (Budnik, 1996). אזורי הפעילות במסופים הסינפטי הם בעלי עניין מיוחד, כי אלה הם האתרים של שחרור הנוירוטרנסמיטר. NC82 היא נוגדן חד שבטי המזהה את החלבון תסיסנית Bruchpilot (Brp), חבר משפחה CAST1/ERC כי היא מרכיב חשוב של אזור פעיל (Wagh et al. 2006). Brp הוצגה ישירות לעצב את אזור פעיל T-בר אחראי ביעילות באשכולות Ca 2 + ערוצי מתחת צפיפות T-בר (פוקה et al. 2009). מוטציות של Brp צמצמו Ca 2 + צפיפות הערוץ, שלפוחית ​​מדוכא שחרור עורר, ואת הפלסטיות שינה לטווח קצר (קיטל et al. 2006). שינויים לאזורי פעיל נצפו דגמים תסיסנית המחלה. לדוגמה, immunofluorescence באמצעות נוגדן NC82 הראו כי צפיפות אזור פעיל צומצם במודלים של טרשת לרוחב amyotrophic ופיט-הופקינס תסמונת (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. לפיכך, ההערכה של אזורי פעילות, או חלבונים סינפטיים אחרים, מודלים תסיסנית זחלים של המחלה עשויה לספק רמז ראשוני ערך לנוכחות של פגם הסינפטי. הכנת כל הר גזור הזחלים תסיסנית לניתוח immunofluorescence של NMJ דורש מיומנות מסוימת, אך ניתן להשיג על ידי רוב המדענים עם קצת תרגול. מוגש היא שיטה המספק עבור הזחלים מרובים כדי להיות גזור ו immunostained בצלחת לנתיחה אותו, הגבלת הבדלים סביבתיים בין גנוטיפ כל ומתן חיות מספיק אמון שחזור וניתוח סטטיסטי.

צומת neuromuscular (NMJ) של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; היא מערכת מודל חשוב ללימוד פונקציה הסינפטי נורמלי, כמו גם הפרעות לתפקוד סינפטי נמצא מחלות נוירולוגיות מסוימות. אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; הזחל מנוע מערכת immunostaining עבור חלבונים אזור פעיל בתוך NMJ.

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

החיבור העצבי-שרירי (NMJ) של זחלי ה-Drosophila הוא מודל מצוין לחקר המבנה והתפקוד הסינפטי. ה-Drosophila ידועה בזכות...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע צביעה אימונופלואורסצנטית לחלבוני אזור פעיל (active zone proteins) בזחלי דרוזופילה בשלבים השלישי והכוכבי (third and star larvae). זאת על ידי בחירה ראשונית של הזחלים והקיבוע שלהם באמצעות סיכות על צלחת הדיסקציה. השלב השני של הפרוצדורה הוא דיסקציה של הזחלים, תוך הסרת רקמה עודפת כדי לחשוף את השרירים ואת הצמתים העצביים-שריריים.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע צביעה אימונוהיסטוכימית של עור הזחלים שהופשט ישירות בתוך צלח הדיסקציה. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא העמדת עור הזחלים על זכוכית מיקרוסקופ. לבסוף, ניתן להפיק תוצאות לגבי המורפולוגיה של אזור הפעילות בצומת העצבי-שרירי של תאי CHO באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אימונוגנית.שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הנוירולוגיה, כגון ויסות של חלבונים בצומת העצבי-שרירי, כגון אלו המעורבים במורפולוגיה של האזור הפעיל. כדי ליצור משטח לניתוח, שפכו בסיס אלסטומר סיליקון 180 4 cigar לתוך פלטת תרבית רקמה קטנה. ודאו כי אינכם ממלאים את הפלטה לחלוטין, כך ששטח הניתוח יהיה נמוך מהשפה. קצצ את סיכות הניתוח לאורך של כ-שלושה עד חמישה מילימטרים כדי להקל על המניפולציה, וודאו שיש לפחות שש סיכות לכל זחל מזן הפרא ומזנים מוטנטיים. זהו ובחרו זחלי גיל שלישי נודדים הזוחלים באופן פעיל על דופן המבחנה וטרם החלו בתהליך הבבואה.הוציאו שתי זחלים מכל גנוטיפ מהמבחנות והניחו אותם בצלחת שטיפה מלאה ב-PBS כדי להסיר שיירי רקמה תחת מיקרוסקופ סטריאו. ספגו לחות עודפת ממשטח ההשחיתה באמצעות נייר Kimwipe. סדרו את הזחלים כך שהצד הגבי פונה כלפי מעלה ושתי קשקשי הנשימה (trachea) הלבנים נראים לאורך מרכז הצד הגבי של הזחלים.מיקום הקשקשים (tracheas) במרכז הזחלים מסמן את קו האמצע הגבי. מקמו את סיכה מספר אחת מעל לוויי הפי (mouth hooks), ולאחר מכן מקמו את סיכה מספר שתיים במיקום הזנב, מעל לספירות (sphericals) ובין הקשקשים. הוסיפו כמות קטנה של PBS לזחלים כדי למנוע התייבשות של הקוטיקולה.הקפידו להפריד בין גנוטיפים שונים על ידי הנחת סיכה בין כל קבוצה. לאחר שהזחלים קובעו בסיכות, בצעו חתך רוחבי דרך הקנה (tracheas) מעל סיכה מספר שתיים. הכניסו את המספריים לתוך חתך זה וגזרו כלפי מעלה לאורך קו האמצע הגבי בין הקנאות, עד למעבר סיכה מספר אחת במידת הצורך.בצעו ארבעה חיתוכים קטנים נוספים בחלקים העליונים והתחתונים ביותר של כל צד של הקוטיקולה, כך שהצדדים השמאלי והימני ייפתחו, מה שיאפשר להקבעים אותם מבלי למתוח את הקוטיקולה. לאחר שכל פינה של הקוטיקולה מקובעת בצורה שטוחה אל מול משטח הנתיחה, קבעו את ה-filet larvae ב-4%para formaldehyde למשך 20 עד 25 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר זמן קיבוע של כ-25 דקות, שפכו את ה-paraform aldehyde ושטפו עם PBS 3 פעמים, תוך שפיכה בכל פעם. כאשר ה-larvae נמצאות בטיפה של PBS תחת מיקרוסקופ סטריאומטרי, תפסו את הקצה האחורי של אחת הקשקשיות (trachea) בעזרת פינצטת נתיחה ומשכו אותה החוצה.חזרו על הפעולה עבור הקנה השני. תפסו חלק מגוף השומן האחורי או מרקמת המעי ומשכו אותם אל מחוץ לאזור הניתוח. לאחר שרוב הרקמה האחורית הוסרה, התמקדו בהסרת הרקמות הקטנות שסביב המוח.לאחר שהעור של הזחל נקי מרקמות עודפות, ניתן לצבוע אותו ישירות על פד הנתיחה באמצעות נוגדן ראשוני לזיהוי האזור הפעיל (active zone), ולאחריו נוגדן משני פלואורסצנטי. לאחר הצביעה האימונו-פלואורסצנטית של האזור הפעיל, השלב הבא הוא קיבוע עור הזחלים הצבוע. התחילו בניקוז וספיגה של השטיפה האחרונה שלאחר דגירה עם הנוגדן המשני, והעבירו בפיפט כ-1 מיליליטר של 80% glycerol. כדי לכסות את עורי הזחלים המקובעים בסיכות, הסירו את כל הסיכות מכל זחל למעט סיכה אחת, ולאחר מכן טפטפו שתי טיפות של מדיום קיבוע על סרטית מיקרוסקופ.הסיר את המסמר האחרון ואחז בזחלים בזנב בעזרת פינצטה קהה. גרור את הזחלים בתוך הגליצרול ולאחר מכן הנח את הזחלים בטיפה הראשונה של חומר הקיבוע, ובצע את הפעולה גם עם שאר הזחלים מאותו הגנוטיפ. לאחר שכל הזחלים נמצאים בטיפה הראשונה של חומר הקיבוע, אחז בכל זחל בנפרד וגרור אותו דרך הטיפה ולאחר מכן לאורך השוליים היבשים של העששית כדי להסיר את רוב חומר הקיבוע.לאחר מכן, הניחו את ה larvae בטיפת מדיום הקיבוע השנייה. הכינו את העגילה הסופית על ידי סימון שלה והנחת כמות קטנה של מדיום קיבוע בצורת T על העגילה. חזרו על תהליך הגרירה והייבוש עם ה larvae בטיפת מדיום הקיבוע השנייה, ולאחר מכן סדרו את ה larvae כך שצד הקוטיקולה (cuticle) יפנה כלפי מטה בתוך מדיום הקיבוע.בזכוכית העצם האחרונה, הנח זכוכית כיסוי על העצם כדי לכסות את הזחלים המנותחים, כאשר הקצה ההתחלתי נמצא בקו העליון של ה-tee. הנח משקולת קטנה על זכוכית הכיסוי למשך כחמש דקות כדי להבטיח שחומר ההטמעה יתפשט באופן מלא, ולאחר מכן השאר את הדגימה בחושך עד שהחומר התקשח. כדי להכין את זכוכית העצם למיקרוסקופיה, נגב כל שארית של חומר הטמעה ואטום את זכוכית הכיסוי בעזרת לק לציפורניים. האוריינטציה הנכונה של עורי הזחלים המוטמעים מוצגת כאן.שימו לב שהעורות מונחים בצורה שטוחה כאשר צד הקוטיקולה פונה כלפי מטה, ושקיים מרווח של לפחות רוחב גוף של זחל בין עור לעור. לאחר סיום הדיסקציה של הזחלים, הצביעה וההטמעה, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה כדי לזהות את שרירי הזחל הרלוונטיים הממוקמים בסגמנטים a2 עד a6.בעזרת עדשה אובייקטיבית בעוצמה גבוהה, ניתן להתמקד בסינפסה בודדת ולבצע צילום במצב ZS stack באמצעות מיקרוסקופ. מוצגת כאן תמונת מקסימום-פרוג'קציה (maximum projection) מייצגת של חלק מסינפסה עם צביעת NC 82 בירוק וצביעת HRP פרה-סינפטית באדום. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע צביעה אימונוהיסטוכימית לחלבונים חשובים בצומת העצבי-שרירי, כגון חלבונים המעורבים במורפולוגיה של האזור הפעיל (active zone).

dissection-imaging-active-zones-drosophila-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מדגים כיצד...

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה על הזחל תסיסנית גזור.

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

הצומת העצבי-שרירי (NMJ) משתנה במגוון מצבים שיכולים לפעמים להגיע לשיאם בכשל סינפטי. דוח זה מתאר שיטות מבוססות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לכימות שינויים מבניים כאלה.

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

היכולת לזהות במדויק רכיבי צומת נוירו-שרירית חיונית להערכת שינויים בארכיטקטורה שלה בגלל תהליכים פתולוגיים או התפתחותיים. כאן אנו מציגים תיאור מלא של שיטה פשוטה כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה של צמתים neuromuscular הר כולו שניתן להשתמש בהם כדי לבצע מדידות כמותיות.

ניתוח של סיבי שריר שלד יחיד עבור ניתוחים אימונופלואורסצנטיים ומורפומטריים של צמתים נוירו-שריריים בהר שלם

אנו מתארים טכניקת ניתוח המשמרת את הארכיטקטורה של הצומת הנוירו-שרירי ומאפשרת מחקר אימונוציטוכימי מפורט של נוירונים מוטוריים ברגלו הבוגרת של דרוסופילה .

ניתוח ואימונוהיסטוכימיה של הרגל הבוגרת של דרוסופילה לזיהוי שינויים בצומת הנוירו-שרירי עבור נוירון מוטורי מזוהה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח מורפומטרי של צמתים עצביים-שריריים על ידי מיקרוסקופיה משולבת של קונפוקל ו-STED המשמשת לכימות שינויים פתולוגיים במודלים של עכברים של SMA ו-CMS הקשורים ל-ColQ.

אפיון צמתים עצביים-שריריים בעכברים על ידי מיקרוסקופיה משולבת קונפוקלית וסופר-רזולוציה

דוח זה מספק הליך הכנת מדגם חדש להדמיית צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה . שיטה זו יעילה יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית והיא שימושית במיוחד עבור Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

אופטימיזציה של תהליך הכנת הדגימה להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים של צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

למד שיטת ניתוח והדמיית אזורי פעילות סינפטית בזבובית Drosophila melanogaster. פרוטוקול זה מאפשר חקר מבנה ותפקוד מפרקי עצב-שריר ומחלות נוירולוגיות קשורות.

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

גלה סרטונים נוספים