Β-glucuronidase (גאס) נייד מבוסס מוות Assay

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במערכת מדווח גאס כדי לנתח את תכונות המוות הפוטנציאליות של גנים ספציפיים. גנים מעניינים משובטים לקלטת גאס וגדלים בווקטורי אגרובקטריום המתאימים תחת מקדם 35 שניות. וקטורים אלה הופכים לאחר מכן לזן Agrobacterium, LBA 44 0 4, ומעורבבים עם תרבית המכילה קלטת ביטוי גאס כדי לחדור לעלי ניק אושיאנה המאנה.

ניתן להעריך את פעילות גאס באופן ויזואלי על ידי צביעה היסטוכימית, או כמותית על ידי בדיקת ספל מטרי פלואור. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו סולם DNA או בדיקת מנהרה נמצא בשימוש נפוץ במערכות יונקים, אך קשה להתרבות בצמחים, הוא שמדובר בבדיקה חולפת רגישה ומהירה מבוססת צמחים המנצלת את העובדה הפשוטה שתאים חיים נדרשים להתרחשות ביטוי גז. הדגמת ההליך היום תהיה Hua RAOs.

עמית מחקר פוסט-דוקטורט במעבדה שלנו Infiltration דורש עלים בריאים מורחבים לחלוטין של צמחי ניקוטיאנה המאנה בני שלושה עד שישה שבועות הגדלים ב-25 מעלות צלזיוס. תכנן לבצע פרוטוקול זה במשך שמונה ימים. ביום הראשון, רצף מגרדים עם גליצרול, מלאי של גידול אגרובקטריום פאסאן המכיל את הווקטורים לבדיקת מוות התאים, והוקטור עם קלטת הביטוי של גאס כוללים תמיד וקטור ריק כבקרה שלילית או ממלא כאשר נבדקים שילובי תרביות מרובים.

דגרו על הצלחות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך יומיים. ביום השלישי יש לחסן שני מיליליטר של LB סלקטיבי עם מושבה אחת מכל צלחת. דגרו כל תרבית על ידי ניעור ב-28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ב-200 סל"ד עד להגעה לצפיפות גידול מקסימלית.

לאחר 24 שעות של דגירה, השעו לחלוטין את התרבית על ידי פיפטינג אם יש גושים, והגדל את הנפח הכולל לכל תרבית ל-10 מיליליטר עם LB סלקטיבי טרי כדי לגרום לגנים אלימים של אגרובקטריום. הוסף אצטון ל -25 מיקרוטולר ודגר כל תרבית בניעור ב -28 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות נוספות. השלב הבא הוא צנטריפוגה של כל תרבית ב -4, 000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ו- Resus, להשעות את הגלולה ב -10 מיליליטר של מדיום הסתננות.

אל תוסיף אצטון, צנטריפוגה שוב את התרבויות, אבל עכשיו Resus. תלו כל כדור בחמישה מיליליטר של מדיום חדירה המכיל 100 אצטון מיקרו-מולרי. כעת מדוד את ה-OD ב-600 ננומטר.

ריכוזים נמוכים עד 0.1 מקובלים, אך אם גדולים מ-0.9, יש לדלל ל-0.9 עם הסתננות, בינוני ואצטון לפני החדירה. דגרו את התרביות פעם נוספת בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עם ניעור במשך שלוש שעות לאחר הדגירה. ערבבו את תרביות הניסוי ותרבויות הביקורת ביחס של אחד לאחד עם התרבית המכילה את קלטת גאס.

עבור כל תרבית, השתמש במזרק ללא מחט של מיליליטר אחד כדי לחדור לחותם ABA או לחלק התחתון של עלים חדשים שצצו. נפח החדירה אינו חשוב. כאשר נוצר מספיק אזור השריית מים, הסתנן גם לבקרה השלילית וגם לגן כדי להיבדק על עלים מנוגדים באותו צמח, ואז הסתנן לשני צמחים נוספים באותו אופן.

אז יש צמחים משולשים לכל תרבות. שלושה ימים לאחר ההסתננות, הגיע הזמן לאסוף את העלים ולבדוק את ביטוי חלבון המשב. התחל את הניתוח ההיסטוכימי על ידי חדירת ואקום לכל העלה עם מצע xlu עד שהוא ספוג לחלוטין.

כעת, דגרו את העלים בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה או עד להופעת כתמים כחולים מובהקים כאשר ניכר כתמים כחולים. שטפו את העלים במים מזוקקים ודגרו אותם באתנול 70% למשך הלילה עד להסרת הכלורופיל שלהם. למחרת, שטפו את העלים והמים המזוקקים והעריכו את רמות הביטוי של GUS.

כדי לכמת את ביטוי גאס, ספל מצע מומר למוצר פלואורסצנטי mu, אותו ניתן למדוד החל מטחינת דיסקיות עלים שחדרו במכתש באמצעות חנקן נוזלי. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר מיצוי GUS תוך שמירה על הדגימה על קרח. כעת צנטריפוגה את התרחיף ב-14,000 GS לחמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואספו את הסופרנטנט המכיל את סך החלבונים המסיסים, הכולל את גאס.

מדוד את ריכוז החלבון המסיס הכולל באמצעות NanoDrop והתאם את הריכוז ל-100 מיקרוגרם של חלבון כולל עבור כל דגימה במאגר מיצוי גאס. כעת, הוסף מצע ספל במאגר מיצוי גאס לכל דגימה לריכוז סופי של ספל שני מילי-מולארי. נפח כולל של 100 מיקרוליטר לדגימה אמור להספיק, לערבב על ידי פיפטינג ולדגור את התגובה למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר שעה, עצור את התגובה על ידי הוספת 800 מיקרוליטר של משבי רוח לעצור את המאגר. כדי לכמת את ה-mu 100 מיקרוליטר של כל דגימה נטענת על צלחת מיקרוטיטר, אשר מנותחת בפלואורסצנציה של קורא צלחת בעירור של 365 ננומטר נמדדת אורכי גל פליטה של 455 ננומטר ובהשוואה לעקומה סטנדרטית, ניתן לדווח על פעילות גאס כ-M של mu לכל מיקרוגרם של חלבון מסיס כולל לתגובת דקה. רמות משב שונות מתגלות בהתאם למבנה המשמש כאשר קלטת הביטוי של GUS חודרת יחד עם מווסת שלילי של מוות תאי או גן נגד מוות.

רמות משב רוח גבוהות נצפות בהשוואה. רמות גאס בבקרת הווקטור הריק נמוכות בהרבה. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש בווסת חיובי של מוות תאי או בגן מעודד מוות, נצפית ירידה בשוק בביטוי גאס בהשוואה לבקרת הווקטור הריק.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשבוע. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שטכניקה זו משמשת כצעד ראשוני לקביעת הפוטנציאל של גנים ספציפיים. יש לבצע עבודה נוספת כדי לאשר את התוצאות הראשוניות הללו ולקבוע את סוג התא המעורב.