Β-glucuronidase (גאס) נייד מבוסס מוות Assay

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשתמש במערכת דשיין Gus כדי לנתח את תכונות המוות הפוטנציאליות של גנים ספציפיים. גנים רלוונטיים משתבטים לתוך קסטת Gus ומגודלים בווקטורים מתאימים של agrobacterium תחת פרומוטור 35 s. ווקטורים אלו מותמרים לאחר מכן למערב Agrobacterium, LBA 44 0 4, ומעורבבים עם תרבית המכילה קסטת ביטוי Gus כדי להחדירם לעלים של Nick Oceana Hamana.

ניתן להעריך את פעילות ה-Gus באופן חזותי באמצעות צביעה היסטוכימית, או באופן כמותי באמצעות בדיקת Fluor metric mug. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו DNA laddering או בדיקת tunnel, הנפוצות במערכות יונקיים אך קשות לשחזור בצמחים, הוא שמדובר בבדיקה זמנית רגישה ומהירה מבוססת צמחים, המנצלת את העובדה הפשוטה שנדרשים תאים חיים כדי שתתרחש ביטוי של gas. את הפרוצדורה ידגים היום Hua RAOs.

עמית פוסט-דוקטורט במעבדתנו. עבור חדירה (Infiltration), נדרשים עלים בריאים ומורחבים במלואם של צמחי nicotiana hamana בני שלושה עד שישה שבועות, שגודלו בטמפרטורה של 25 °C. תכננו לבצע פרוטוקול זה לאורך שמונה ימים. ביום הראשון, בצעו מריחה על פלטות עם מאגרי גליצרול של agrobacterium tumor fassan המכילים את הווקטורים לבדיקת מוות תאי ואת הווקטור עם קסטת הביטוי של Gus; תמיד כללו וקטור ריק כשלילה או כ-stuffer כאשר נבחנות שילובים מרובים של תרביות.

דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 28 °C למשך יומיים. ביום השלישי, זרעו מושבה בודדת מכל פלטה לתוך 2 mL של מצע LB סלקטיבי. דגרו כל תרבית תחת ניעור בטמפרטורה של 28 °C למשך 24 שעות במהירות של 200 RPM, עד להשגת צפיפות גידול מקסימלית.

לאחר 24 שעות של דגירה, השהו מחדש באופן מלא את התרבית באמצעות פיפוט במידה וקיימים גושים, והגדילו את הנפח הכולל של כל תרבית ל-10 milliliters באמצעות LB סלקטיבי טרי כדי להשרות את גני הוירולנציה של ה-agrobacterium. הוסיפו אצטון עד לריכוז של 25 micromolar ודגרו כל תרבית תחת ניעור בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך 16 שעות נוספות. השלב הבא הוא סנטריפוגציה של כל תרבית ב-4, 000 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, והשהה מחדש של המשקע ב-10 milliliters של מצע חדירה (infiltration medium).

אין להוסיף אצטון; סנטריפוז את התרביות פעם נוספת, אך כעת בצעו רסוסיפנסיה (Resus). השעו כל משקע בחמישה מיליליטרים של מדיום אינפילטרציה המכיל 100 micromolar אצטון. כעת מדדו את ה-OD ב-600 nanometers.

ריכוזים נמוכים עד 0.1 הם קבילים, אך אם הריכוז גבוה מ-0.9, יש לדלל ל-0.9 באמצעות תמיסת חדירה, מצע ואצטון לפני החדירה. דגרו את התרביות פעם נוספת בטמפרטורה של 28 degrees Celsius עם ניעור למשך שלוש שעות לאחר הדגירה. ערבבו את תרביות הניסוי ואת תרביות הביקורת ביחס של אחד לאחד עם התרבית המכילה את קסטת ה-Gus.

עבור כל תרבית, השתמש במזרק ללא מחט של מיליליטר אחד כדי להחדיר את ה-ABA לאטב ה-ABA או לצד התחתון של עלים שזה עתה בצמחו. נפח ההחדרה אינו קריטי. כאשר נוצר אזור של ספיגת מים, סימן שנוסף מספיק חומר; החדר הן את הביקורת השלילית והן את הגן לבדיקה על עלים מנוגדים באותו צמח, ולאחר מכן החדר לשני צמחים נוספים באופן דומה.

לפיכך, ישנם צמחים בשלוש חזרות לכל תרבית. שלושה ימים לאחר האינפילטרציה, הגיע הזמן לאסוף את העלים ולבחון את ביטוי חלבון ה-gust. התחילו את הניתוח ההיסטוכימי באמצעות אינפילטרציה בוואקום של העלה כולו בתשתית xlu עד שיהיה ספוג לחלוטין.

כעת, דגרו את העלים בחשיכה בטמפרטורת החדר למשך לילה, או עד להופעת צביעה כחולה ברורה. שטפו את העלים במים מזוקקים ודגרו אותם ב-70% ethanol למשך לילה עד להסרת הכלורופיל. למחרת, שטפו את העלים במים מזוקקים והעריכו את רמות ביטוי ה-GUS.

כדי לכמת את ביטוי ה-Gus, סובסטרט mug מומר למוצר פלואורסצנטי mu, אשר ניתן למדידה. התחל בגריסת דיסקיות עלה שהוחדרו בתוך מכתש באמצעות חנקן נוזלי. לאחר מכן, הוסף 100 µL של באפר מיצוי GUS תוך שמירת הדגימה על קרח. כעת, סבב את התוך במצב צנטריפוגה ב-14,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C, ואסוף את העילאי המכיל את כל החלבונים המסיסים, הכולל את ה-Gus.

מדוד את ריכוז החלבון המומס הכולל באמצעות NanoDrop והתאם את הריכוז ל-100 micrograms של חלבון כולל עבור כל דגימה בבופר איצורה של Gus. כעת, הוסף תסבסב mug בבופר איצורה של Gus לכל דגימה עד לריכוז סופי של 2 millimolar של mug. נפח כולל של 100 µL לכל דגימה אמור להספיק; ערבב באמצעות פיפטינג והדגה את התגובה למשך שעה בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר שעה, עצרו את התגובה על ידי הוספת 800 µl של גוּס (GUS) stop buffer. כדי לכמת את הפעילות, העבירו 100 µl מכל דגימה ללוחית מיקרוטיטר, אשר תנותח באמצעות קורא לוחות פלואורסצנציה; מדידה תתבצע באורכי גל של 365 nm עבור עירור ו-455 nm עבור פליטה, והתוצאות יושוו לעקומת סטנדרט. ניתן להדווח על פעילות ה-GUS כיחידות של µmol של mu לכל µg של חלבון מסיס כולל לדקה של תגובה. רמות GUS שונות מזוהות בהתאם לקונסטרוקט שנעשה בו שימוש, כאשר קסטת הביטוי של GUS מוחדרת (co-infiltrated) יחד עם רגולטור שלילי של מוות תאי או גן נוגד-מוות.

בהשוואה זו נצפים רמות גבוהות של Gus. רמות ה-Gus בביקורת הווקטור הריק נמוכות בהרבה. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש בווסת חיובי של מוות תאי או בגן פרו-מוות (pro-death gene), נצפית ירידה משמעותית בביטוי ה-Gus בהשוואה לביקורת הווקטור הריק.

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בערך תוך שבוע אחד. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי טכניקה זו משמשת כשלב ראשוני לקביעת הפוטנציאל של גנים ספציפיים. יש לבצע עבודה נוספת כדי לאשר תוצאות ראשוניות אלו ולקבוע את סוג התא המעורב.