Name: Β-glucuronidase (גאס) נייד מבוסס מוות Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: חקור מוות תאי מתוכנת בצמחים באמצעות מערכת דיווח GUS ב-Nicotiana benthamiana. השיטה המהירה והרגישה מספקת הערכה חזותית וכמותית של פעילות גנים הגורמים למוות תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ניקוטיאנה benthamiana צמחים גדלים בחדר בקרת טמפרטורה צמיחה של 25 מעלות צלזיוס. עלים בריא לגמרי מורחבת של 3-6 צמחים בשבוע הישן משמשים. טיפ: תוצאות טובות יותר מתקבלים באמצעות עלים המתהווה 1. Agrobacterium פרוטוקול חדירה חולף: יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LB Streak / ריפמפיצין (25 מיקרוגרם / מ"ל) / Kanamycin (100 מיקרוגרם / מ"ל) צלחות אגר עם מניות של גליצרול Agrobacterium tumefaciens (זן LBA4404) המכיל את הווקטורים המתאימים עם הגן (ים) להיות assayed למוות התא המכיל את וקטור את הקלטת גאס תחת מקדם מכוננת. תמיד כוללים בקרת וקטור ריק כביקורת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 28 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. </li></ol> יום 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 2 מ"ל של LB המכיל ריפמפיצין (25 מיקרוגרם / מ"ל) ו Kanamycin (100 מיקרוגרם / מ"ל) עם מושבת יחיד מתוך כל LB / ריפמפיצין / Kanamycin צלחת מפוספס בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל תרבות על ידי רועדת על 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עד 200 סל"ד צפיפות הגידול המרבי. </li></ol> טיפ: clumping הוא ציין לפעמים, שבו תרבויות מקרה צריך להיות resuspended ביסודיות (כלומר pipetting למעלה ולמטה) לפני שתמשיך. יום 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להגביר את עוצמת הקול הכולל 10 מ"ל עם LB טרי (המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה) acetosyringone (25 מיקרומטר הסופי ריכוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל תרבות על ידי רועדת על 28 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. </li></ol> יום 5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת לשטוף כל תרבות פעמיים על ידי הוספת 10 מ"ל (לא מוסיפים acetosyringone) בינוני הסתננות (10 mM MgSO 4 0.7 H 2 O, 9 מ"מ MES, pH 5.6) ו צנטריפוגות XG ב 4000 ל 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב הסופי צנטריפוגה, resuspend כל התרבות בינוני 5 מ"ל חדירה המכילה acetosyringone (100 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600nm, מדידות בין 0.1 ו 0.9 קבילים. טיפ: OD 600nm של נמוך כמו 0.1 שימשו ללא בעיה, לעומת זאת, גבוה מכנסי הש"כ עשוי להניב תוצאות יותר עקביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התרבויות במשך 3 יותר שעות כדי להכין את התרבויות Agrobacterium לזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים תרבויות המכיל את הגן (ים) להיות מנותח שליטה שלילית (Agrobacterium המכיל את וקטור ריק) ביחס של 1:1 עם התרבות המכיל את הקלטת גאס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדור את הצד abaxial (תחת) של עלים חדשים המתעוררים באמצעות מ"ל 1 מחט המזרק פחות (איור 1). טיפ: חדור הן תערובת בקרה שלילית (וקטור ריק + קלטת גאס) ואת תערובת המכילה את הגן להיות assayed (גן x + קלטת גאס) על העלים מנוגדים של אותו צמח. שימוש בצמחים בשלושה עותקים עבור כל טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 ימים לאחר חדירת הבלו הסתננו עלים assay ביטוי חלבון גאס. </li></ol> 2. Assay Histochemical גאס יום 8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק לחדור בינוני X-gluc המצע לתוך העלים נכרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה או עד כתמים כחולים ברורים מופיע. </li></ol> יום 9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים distillated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה באתנול 70% עד כלורופיל מוסר, ואז להעביר מים מזוקקים שוב. ראייה להעריך רמות גאס הביטוי. </li></ol> 3. ספל Fluorometric assay: יום 8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד חלבון הכולל ידי שחיקה דיסקים עלה הסתננו במכתש באמצעות חנקן נוזלי. הוספת 100 UL של חיץ מיצוי גאס (50 mM NaPi pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% N-lauroylsarcosine מלח נתרן, β-mercaptoethanol (0.7 μl / ml), תוך שמירה על מדגם על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה ב g 14,000 עבור 5 דקות ב 4 ° C ולקחת supernatant כמו חלבון מסיס מוחלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת ריכוז באמצעות nanodrop בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ריכוז החלבון 100 מיקרוגרם של חלבון מסיס סך כל דגימה באמצעות חיץ גאס החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף המצע ספל (4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide הידראט) שהוכנו חיץ מיצוי גאס לריכוז סופי של 2 מ"מ. נפח כולל של 100 μL לדגימה (חלבון + המצע ספל) צריך להספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובות עבור שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור תגובות על ידי הוספת 800 μl של גאס להפסיק חיץ (0.2 M Na 2 CO 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת הקרינה באמצעות קורא צלחת באורך גל 365 ננומטר עירור של אורך הגל פליטה של ​​455 ננומטר ולהשוות ערכים עקומת תקן MU. דווח על רמות של פעילות גאס כסך MU / מיקרוגרם חלבון מסיס nmol / min. </li></ol> 4. מניות פתרונות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Acetosyringone (1 ז) מניות (FW = 196.2 גרם) תת&gt; - 0.981 גרם ב 5 מ"ל של DMSO </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Kanamycin (100 מ"ג / מ"ל) מניות - להכין ב DH 2 0 - מסנן לעקר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריפאמפיצין (25 מ"ג / מ"ל) מניות - להכין DMSO </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוריא-Bertani (LB) צמיחה נוזלי התקשורת: (1 ליטר) 1% (w / v) bacto-tryptone, 10 גרם 0.5% (w / v) bacto, תמצית שמרים, 5 גרם 170 נתרן כלוריד mM 10 גרם pH - 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Acetosyringone (25 מיקרומטר) = 25 μl של מניות 1 M בנפח סופי של 1 מ"ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני הסתננות: (1 ליטר) 10 mM MgSO 4 0.7 DH 2 0 (FW = 246.48 גרם), 2.4648 גרם 9 מ"מ MES (FW = 213.25 גרם), 1.91925 גרם pH - 5.6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Acetosyringone (100 מיקרומטר) = 100 μl מלאי 1M בנפח סופי של 1 מ"ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גאס הפקת הצפת 50 מ"מ NaPi pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% N-lauroylsarcosine מלח נתרן, β-mercaptoethanol (0.7 μl / ml) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2x חיץ פוספט לאא 0.2M 2 PO 4 ו - 0.2 M Na 2 HPO 4 pH 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> X-Gluc המצע פתרון ממיסים 1 מ"ג של 5-bromo-4-כלורו-3-BD-indolyl glucuronide (X-Gluc) ב 0.1 מ"ל מתנול. הוסף 1 מ"ל חיץ 2x פוספט, אשלגן 20 μl 0.1M ferricyanide, 10μl טריטון X-100 10% ו 850 μl מים distillated. </li></ol> 5. נציג התוצאות: בעקבות פרוטוקול זה, אובדן ביטוי גאס צפוי כאשר מתרחש מוות של תאים. אנחנו הבענו את הגן בעת ובעונה אחת הכתב, β-glucuronidase (גאס) עם חבר של ארבידופסיס Cyto-המגן Bcl-2 Associated athanoGene (שקית) משפחה. אנו שיתוף הסתננו נ benthamiana עלים עם קלטת BAG 35S מונע הביטוי וקטור גאס pCAMBIA 2301 באמצעות LBA4404 Agrobacterium זן. כפי שמוצג בתרשים 2, עלייה גלוי מכתים גאס נצפתה בעקבות חדירה זו. לעומת זאת, כאשר ידוע הפרו אפופטוטיים ממשפחת Bcl-2 BAX היה בשימוש, הפחתה ניכרת של מכתים גאס נצפתה (איור 2). בשני המקרים הללו, הביטוי גאס היה שונה בעליל לעומת שליטה. עם זאת, כאשר ההבדל ביטוי בולט פחות, מבחני ספל fluorometric יכול להתבצע על quanitate ביטוי גאס. <img src="/files/ftp_upload/2680/2680fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. דוגמה חדירה תערובת Agrobacterium של הצד abaxial נ benthamiana עלים 1 מ"ל באמצעות מחט המזרק פחות. <img src="/files/ftp_upload/2680/2680fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. וקטור גאס היה שותף לידי ביטוי נ benthamiana עלים עם הגן מוות אנטי, לבין inducer ידוע של מוות של תאים. רמות גאס הושוו לשלוט וקטור ריק (גאס שליטה).

<ol><li>Jefferson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUS+fusions%3A+%2C+%CE%B2-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).</li>
<li>Nishihara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+%CE%B2-Glucuronidase+Gene+in+Pollen+of+Lily+%28Lilium+longiflorum%29%2C+Tobacco+%28Nicotiana+tabacum%29%2C+Nicotiana+rustica%2C+and+Peony+%28Paeonia+lactiflora%29+by+Particle+Bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment.</a> Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).</li>
<li>Hodal, L. Plant Science. 87, 115-115 (1992).</li>
<li>Kabbage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BAG+proteins%3A+a+ubiquitous+family+of+chaperone+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci.+%22%5BJournal%5D)">The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators.</a> Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).</li>
<li>Kang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtBAG6%2C+a+novel+calmodulin-binding+protein%2C+induces+programmed+cell+death+in+yeast+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants.</a> Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).</li>
<li>Yan, J. Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).</li>
<li>Takayama, S., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperone+targeting+and+regulation+by+BAG+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins.</a> Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).</li>
<li>Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+analysis+of+BAG-1%3A+a+novel+Bcl-2-binding+protein+with+anti-cell+death+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity.</a> Cell. 80 (2), 279-279 (1995).</li>
<li>Vitha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+%CE%B2-glucuronidase+assay+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants.</a> Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).</li>
<li>Otha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+Expression+in+Tobacco+of+a+%CE%B2-Glucuronidase+%28GUS%29+Reporter+Gene+Containing+an+Intron+Within+the+Coding+Sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence.</a> Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<p class="jove_content"&gt; לעיתים קרובות קשה להשתמש מוות של תאים שיטות לזיהוי בצמחים נפוצים במערכות יונקים. בשילוב עם מערכת הכתב גאס, אנו מציגים צמח מבוסס, שיטה רגישה לאיתור וניתוח של שחקנים מוות של תאים. שיטה זו מנצלת את העובדה הפשוטה כי תאים חיים נדרשים עבור הביטוי גאס להתרחש. על מנת להבטיח תוצאות משמעותיות ואת הדירות, זה קריטי, כי התרבויות מחסה את הקלטת גאס ואת הגן להיות assayed הם הסתננו על יחס שווה. יחסים אלה צריכים להישמר כאשר משווים נוספים פוטנציאל למוות שחקנים התא. כפי שהראינו, השתמשנו בשיטה זו בהצלחה במעבדה שלנו כדי לחקור את תפקוד מוו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> ריפמפיצין </td><td> VWR </td><td> IC19549001 </td><td> 25mg/mL המניות DMSO </td></tr><tr><td> 4&#39;-hydroxy-3 &quot;, 5&#39;-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) </td><td> VWR </td><td> TCD2666 </td><td> 0.981 גרם / מ&quot;ל ​​DMSO (1M המלאי) </td></tr><tr><td> 2 - (4-morpholino) ethanesulfonic monohydrate חומצה (MES) </td><td> VWR </td><td> EM-6110 </td><td> 1.92 גר &#39;/ ליטר מים להכנת 1 ליטר של מדיה הסתננות </td></tr><tr><td> Bacto-tryptone </td><td> דיג </td><td> BP1421-2 </td><td> 10g / L במים להכנת 1 ליטר של מדיום LB </td></tr><tr><td> Bacto-תמצית שמרים </td><td> VWR </td><td> EM1.03753.0500 </td><td> 5 גרם / L במים להכנת 1 ליטר של מדיום LB </td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> VWR </td><td> EM-7710 </td><td> 10g / L במים להכנת 1 ליטר של מדיום LB </td></tr><tr><td> סודיום פוספט monobasic monohydrate </td><td> VWR </td><td> MK-7868-12 </td><td> 2.5G / L במים להכנת 50mm של חיץ NaPi </td></tr><tr><td> סודיום פוספט dibasic heptahydrate </td><td> VWR </td><td> EMD-SX0715-1 </td><td> 5 גרם / L במים להכנת 50mm של חיץ NaPi </td></tr><tr><td> מגנזיום סולפט heptahydrate </td><td> VWR </td><td> EM-MX0070-1 </td><td> 2.5 גר &#39;/ ליטר מים להכנת 1 ליטר של מדיה הסתננות </td></tr><tr><td> N-Lauroylsarcosine </td><td> VWR </td><td> TCL0151-500 גרם </td><td> 0.1% v / v ב גאס חיץ </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-כלורו-3-indoxyl-beta-D-glucuronide מלח cyclohexylammonium (X-gluc) </td><td> זהב ביוטכנולוגיה </td><td> G1281C </td><td> 1mg/100uL מתנול ב 100% </td></tr><tr><td> 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide מימה (ספל) </td><td> סיגמא </td><td> M5664 </td><td> 2 מ&quot;מ UL 100 של חיץ מיצוי גאס </td></tr><tr><td> הידראט פרוציאני אשלגן </td><td> VWR </td><td> EM-PX1460-1 </td><td> מניות 100mm פתרון ה-X gluc המצע </td></tr><tr><td> β-Methylumbelliferone (MU) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M1381 </td><td> במשך MU חיץ תקן להשתמש עקומת מיצוי גאס </td></tr><tr><td> סודיום קרבונט </td><td> VWR </td><td> EM-SX0395-11 </td><td> 0.2 מ &#39;במים להכנת חיץ גאס להפסיק </td></tr></tbody></table>

Β-glucuronidase (גאס) נייד מבוסס מוות assay

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

פיתחנו ביטוי רומן חולף צמח המערכת בו זמנית מבטא את הגן הכתב, β-glucuronidase (גאס), עם הרגולטורים חיובי או שלילי המשוערת של מוות של תאים. במערכת זו, נ עלים benthamiana הם שיתוף הסתננו עם קלטת ביטוי 35S מונע המכיל את הגן כדי להיות מנותח, ואת וקטור גאס pCAMBIA 2301 באמצעות LBA4404 Agrobacterium זן ככלי. מכיוון תאים חיים נדרשים עבור הביטוי גאס להתרחש, אובדן פעילות גאס צפוי כאשר הגן הזה הוא סמן שיתוף הביע עם הרגולטורים חיובי של מוות של תאים. באותה מידה, פעילות מוגברת גאס הוא ציין מתי אנטי אפופטוטיים גנים המשמשים לעומת שליטה וקטור. כפי שנראה להלן, השתמשנו בהצלחה את המערכת במעבדה שלנו לנתח את שניהם שחקנים בעד ונגד המוות. אלה כוללים את צמח אנטי אפופטוטיים Bcl-2 Associated athanoGene (שקית) משפחה, וכן, ידוע מעוררים יונקים של מוות של תאים, כגון BAX. בנוסף, יש לנו בשימוש במערכת זו כדי לנתח את הפונקציה מותו של truncations ספציפיים בתוך חלבונים, אשר יכול לספק רמזים על שינוי שלאחר translational ההפעלה אפשרי / של החלבונים האלה. כאן, אנו מציגים שיטה צמח מהיר ורגיש מבוסס, כצעד ראשוני בחקירת פונקציה מותו של גנים ספציפיים.

מוות של תאים מתוכנת מבחני נפוץ במערכות יונקים כגון laddering דנ&quot;א או מבחני TUNEL, לעיתים קרובות קשה לשחזר בצמחים. בשילוב עם מערכת הכתב גאס, אנו מציעים מהיר, assay המבוסס צמח חולף לנתח את המאפיינים מוות הפוטנציאל של גנים ספציפיים.

Β-glucuronidase (גאס) נייד מבוסס מוות Assay

פיתחנו מערכת ביטוי זמנית חדשנית בצמחים, המבטאת בו-זמנית את הגן המדווח, &beta;-glucuronidase (GUS), יחד עם...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש במערכת דגימה של Gus כדי לנתח את תכונות המוות הפוטנציאליות של גנים ספציפיים. גנים רלוונטיים משוכפלים לתוך קסטת Gus ומגודלים בווקטורים מתאימים של Agrobacterium תחת פרומוטור 35 s. ווקטורים אלה מועברים לאחר מכן לשבט Agrobacterium, LBA 44 0 4, ומעורבבים עם תרבית המכילה קסטת ביטוי Gus כדי להחדירם לעלי Nick Oceana Hamana.ניתן להעריך את פעילות ה-Gus באופן ויזואלי באמצעות צביעה היסטוכימית, או באופן כמותי באמצעות בדיקת Fluor metric mug. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון DNA laddering או tunnel assay, הנפוצות במערכות של יונקים אך קשות לשחזור בצמחים, הוא שמדובר בבדיקה זמנית רגישה ומהירה המבוססת על צמחים, המנצלת את העובדה הפשוטה כי תאים חיים נדרשים כדי שביטוי gas יתרחש. הדגמת ההליך היום תתבצע על ידי Hua RAOs.חוקר פוסט-דוקטורנט במעבדה שלנו. עבור חדירה (Infiltration) נדרשים עלים בריאים ומפותחים במלואם של צמחי nicotiana hamana בני שלושה עד שישה שבועות, שגודלו בטמפרטורה של 25 °C. תכננו לבצע פרוטוקול זה לאורך שמונה ימים. ביום הראשון, בצעו מריחה של מצעים עם מאגרי גליצרול של agrobacterium tumor fassan המכילים את הווקטורים עבור בדיקת מוות התאים ואת הווקטור עם קסטת הביטוי של Gus; כללו תמיד ווקטור ריק כביקורת שלילית או כ-stuffer כאשר נבדקים שילובי תרביות מרובים.דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 28 °C למשך יומיים. ביום השלישי, זרעו 2 mL של מצע LB סלקטיבי באמצעות קולוניה בודדת מכל צלחית. דגרו כל תרבית בערבול בטמפרטורה של 28 °C למשך 24 שעות במהירות של 200 RPM, עד להגעה לצפיפות גידול מקסימלית.לאחר 24 שעות של דגירה, השהו מחדש את התרבית באופן מלא באמצעות פיפטור במידה וקיימת התגבשות, והגדילו את הנפח הכולל של כל תרבית ל-10 milliliters של LB סלקטיבי טרי כדי להשרות את הגנים של virulent agrobacterium. הוסיפו אצטון לריכוז של 25 micromolar ודגרו כל תרבית עם ניעור בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך 16 שעות נוספות. השלב הבא הוא סבוב של כל תרבית בצנטריפוגה במהירות של 4,000 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, והשהה מחדש של המשקע ב-10 milliliters של מדיום חדירה (infiltration medium).אל תוסיפו אצטון, סנטריפוגו את התרביות פעם נוספת, אך כעת בצעו Resus. השעיו כל משקע בחמישה מיליליטר של מדיום אינפילטרציה המכיל 100 micromolar אצטון. כעת מדדו את ה-OD ב-600 nanometers.ריכוזים נמוכים עד 0.1 הם קבילים, אך אם הריכוז גבוה מ-0.9, יש לדלל ל-0.9 עם מצע חדירה ואטון לפני החדירה. דגרו את התרביות פעם נוספת בטמפרטורה של 28 degrees Celsius עם ניעור למשך שלוש שעות לאחר הדגירה. ערבבו את תרביות הניסוי ואת תרביות הביקורת ביחס של אחד ለአחד עם התרבית המכילה את קסית ה-Gus.עבור כל תרבית, השתמש במזרק ללא מחט של מיליליטר אחד כדי להחדיר את חומר האיטום ABA או לצדיה התחתונים של עלים שצומחים כעת. נפח ההחדרה אינו קריטי. כאשר נוצר אזור של ספיגת מים, פירוש הדבר שנוסף מספיק חומר; החדר את ביקרת השלילה ואת הגן לבדיקה על עלים מנוגדים באותו צמח, ולאחר מכן החדר לשני צמחים נוספים באותה דרך.לפיכך, קיימים שלושה צמחים חוזרים עבור כל תרבית. שלושה ימים לאחר ההסננה, הגיעה העת לאסוף את העלים ולבצע בדיקה של ביטוי חלבוני הגוסט (gust protein). התחילו את הניתוח ההיסטוכימי על ידי הסננה בוואקום של העלה כולו בתסבכת xlu עד להספגה מלאה.כעת, הדגרו את העלים בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה או עד להופעת צביעה כחולה מובחנת. שטפו את העלים במים מזוקקים והדגרו אותם ב-70% ethanol למשך הלילה עד להסרת הכלורופיל. למחרת, שטפו את העלים במים מזוקקים והעריכו את רמות ביטוי ה-GUS.כדי לכמת את ביטוי ה-Gus, מומר תסבסב mug למוצר פלואורסצנטי mu, אותו ניתן למדוד. התחל בגריסה של דיסקיות עלים שהוחדרו בתוך מכתש באמצעות חנקן נוזלי. לאחר מכן, הוסף 100 µL של בופר מיצוי GUS תוך שמירת הדגימה על קרח. כעת סבב את התוך במהירות של 14,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C, ואסוף את העילאי המכיל את כל החלבונים המסיסים, כולל ה-Gus.מדוד את ריכוז החלבון המסיס הכולל באמצעות NanoDrop והתאם את הריכוז ל-100 micrograms של חלבון כולל עבור כל דגימה בבופר מיצוי Gus. כעת, הוסף סובסטרט mug בבופר מיצוי Gus לכל דגימה עד לריכוז סופי של two millimolar mug. נפח כולל של 100 microliters לדגימה אמור להספיק; ערבב באמצעות פיפטה והדגרה את התגובה למשך שעה ב-37 degrees Celsius.לאחר שעה, יש לעצור את התגובה על ידי הוספה של 800 µL של תמיסת עצירה ל-GUS. כדי לכמת את ה-GUS, טוענים 100 µL מכל דגימה לתוך פלטת מיקרוטיטר, אשר נסרקת בקורא פלטות פלואורסצנטי; נמדדים אורכי גל של עירור ב-365 nm ופליטה ב-455 nm והתוצאות מושוות לעקומת סטנדרט. ניתן לאחר מכן לדווח על פעילות ה-GUS כ-M של GUS למיקרוגרם של חלבון מסיס כולל לדקת תגובה. רמות GUS שונות מזוהות בהתאם לקונסטרקט שנעשה בו שימוש, כאשר קסטת הביטוי של GUS מוחדרת יחד עם רגולטור שלילי של מוות תאי או גן אנטי-מוות.בהשוואה זו נצפים רמות Gus גבוהות. רמות ה-Gus בבקרת הווקטור הריק נמוכות הרבה יותר. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש ברגולטור חיובי של מוות תאי או בגן מעודד מוות (pro-death gene), נצפית ירידה ניכרת בביטוי ה-Gus בהשוואה לבקרת הווקטור הריק.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בתוך כשבוע. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי טכניקה זו משמשת כשלב ראשוני לקביעת הפוטנציאל של גנים ספציפיים. יש לבצע עבודה נוספת כדי לאשר תוצאות ראשוניות אלו ולקבוע את סוג התא המעורב.

a-glucuronidase-gus-based-cell-death-assay

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה פשוטה וחזקה לקביעת הפוטנציאל ציטוטוקסי של תרופה טריפנוצידית נגד טפיל, טריפנוזומה קרוזי, המבטא את האנזים β-גלקטוזידאז. β-גלקטוזידאז משמש כאינדיקטור ליזה של התא, וניתן להשתמש בפעילותו כדי להעריך את השפעות התרופה.

β-בדיקת גלקטוזידאז להערכת ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות בטפילים

סרטון זה מדגים את בדיקת לקטט דהידרוגנאז לזיהוי מוות של מקרופאגים בתיווך דלקת. המקרופאגים נחשפים לליפופוליסכריד לצורך פרימה, ולאחר מכן חשיפה לניגריצין גורמת למוות תאי הנגרם על ידי דלקת, אשר נקבע על ידי בדיקת לקטט דהידרוגנאז.

בדיקת שחרור לקטט דהידרוגנאז לאיתור מוות מקרופאגים בעקבות חשיפה לניגריצין

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

מבחני זמנית יכולים לספק מידע מועיל למנגנונים תאיים בסיסיים ולמנוע בזבוז של חומרים כימיים וניסויים חוזרים מיותרים. אנו מתארים כאן assay פעילות זמנית caspase-3/7, תוך שימוש בשיטות ניאון ומבוסס זורח, כדי לקבוע כדאיות תא במודל ההיפותלמוס במבחנה הבאה אתגר חמצוני עם חומצה פלמיטית.

שימוש בcaspase ריבוב Assay לקביעת אפופטוזיס בדגם נייד ההיפותלמוס

אנו מתארים בדיקה קולורימטרית כמותית פשוטה המודדת באופן ספציפי את הפעילות הפרוטאוליטית של אדם, עכבר או חולדה Granzyme B (GzmB). ניתן להתאים פרוטוקול זה בקלות לקביעת פעילות הפרוטאז של פרוטאזות סרין גרגירים אחרות על ידי הידרוליזה של מצעי פפטידים סינתטיים אחרים עם רצף זיהוי מתאים.

Colorimetric Assay שמודד את הפעילות באופן ספציפי Granzyme B מפרקי חלבונים: הידרוליזה של הבוק-עלא-עלא-Asp-S-Bzl

יש דרישה לעשות ניסויים פרה-קליניים של בדיקות עבור מחלקה הרומן של תרופות היתום"בשם מלווים תרופתי לשחזור, מהיר ויעיל. פיתחנו assay המבוסס על תרבות של תאים פשוטים מאוד מתוקננת, תכליתי למסך המטופלים זכאים, כמו גם רומן המלווה תרופתי סמים.

במבחנה אנזים המדידה לנקודת מבחן תגובתיות המלווה תרופתי פאברי, מחלת הפומפה

הזדקנות תאית היא הגורם העיקרי בפיתוח של הפתווגיות הקשורות לגיל כרונית. זיהוי של הtherapeutics שתאי היעד מציגים הבטחה להרחבת הזדקנות בריאה. כאן, אנו מציגים את הבקשה הרומן על המסך לזיהוי של senotherapeutics מבוסס על מדידה של פעילות ביולוגית β-גלטוסידאז הקשורים בתאים בודדים.

א-β-גלטוסידאז-מבוסס על הקרנת ההקרנה לזיהוי תרופות הסאותרפיה

שיטה לא מתויגת, לא רדיו-איזוטופית כדי לבדוק פעילות גליקוסילאז uracil-DNA פותחה באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF לניתוח מוצר ישיר apurinic / apyrimidinic המכיל אתרים. הבדיקה הוכיחה להיות די פשוט, ספציפי, מהיר, וקל לשימוש עבור מדידת גליקוזילאאז DNA.

Uracil-DNA Glycosylase בדיקה על ידי טיהור לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ניתוח ספקטרומטריה מסה

כימות של צורות מחומצנות ומופחתות של גלוטתיון (GSSG ו-GSH, בהתאמה) הושג באמצעות שימוש באורתו-פתאלדהיד (OPA). OPA הופך להיות פלואורסצנטי מאוד ברגע שהוא מצומד ל-GSH אך אינו מסוגל להצמיד GSSG עד שהוא מופחת. כאן, אנו מתארים בדיקה רב-פרמטרית לכימות שניהם באמצעות כימות חלבונים לנורמליזציה.

כימות מהיר של צורות מחומצנות ומופחתות של גלוטתיון באמצעות אורתו-פתאלדהיד בתאי יונקים בתרבית במבחנה

חקור מוות תאי מתוכנת בצמחים באמצעות מערכת דיווח GUS ב-Nicotiana benthamiana. השיטה המהירה והרגישה מספקת הערכה חזותית וכמותית של פעילות גנים הגורמים למוות תאי.

Β-glucuronidase (גאס) נייד מבוסס מוות Assay

גלה סרטונים נוספים