Name: הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: למד שיטה להפקת תאי גזע עצביים מרקמה קליפתית עוברית אנושית. השיטה מאפשרת הרחבה, אפיון והבדלה לתאי עצב וגליה לחקר מחלות מערכת העצבים ולבדיקת יעילות תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים: HD054347 ו NS063997-01 ל VLS. עבודה זו נתמכה גם על ידי קרן לתאי גזע אמפייר סטייט דרך מדינת ניו יורק מחלקת הבריאות חוזה # C024324 כדי VLS בחלקו. הדעות הביעו כאן הם אך ורק של המחבר ואינן משקפות בהכרח את עמדת מועצת לתאי גזע האמפייר סטייט, מדינת ניו יורק מחלקת הבריאות, או את מדינת ניו יורק. VLS היא דוריס דיוק קלינית התפתחותית המדען חתן פרס. אנחנו גם להודות לפרופסור טימותי Vartanian עבור מתנתו של Anti-O1, Anti-O4 נוגדנים.

1. ההכנה של פתרונות וחומרים לנתיחה ותחזוקה של תרבות גזע עצביים תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 מ"ל בינוני דיסקציה (בנוקאאוט DMEM/F12, Invitogen) מראש ושומרים במקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prepare100 מ"ל בינוני תרבות (גזע Pro NSC SFM, Invitrogen) ולשמור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא הקפאה בינוני (בנוקאאוט DMEM/F12 10% FBS + DMSO 5%) עבור cryopreservation ארוך טווח של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, להכין paraformaldehyde 4% (PFA) עבור קיבעון רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי, מלקחיים autoclaved ולהבי אזמל עם ידיות משמשים לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצד אקדח פיפטה, 10 מ"ל pipettes ההעברה, ו -40 מיקרומטר תא מסננת (BD פלקון 352340) על ניתוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצד כמה 10 ס"מ תרבות מנות (BD) לנתיחה, 50 מ"ל צנטריפוגות מבחנות (BD) עבור דיסוציאציה, 1.5 צינורות צנטריפוגה מ"ל לאחסון רקמות צלוחיות קפוא (BD) עבור תאים מקפיא. </li></ol> 2. בידוד אנושי בתאי גזע עצביים מהמוח עוברי אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר של רקמת קיימא מיד לאחר סיום של העובר היא חיונית להצלחת התהליך. עבור פרוצדורות אלקטיבי, העיתוי להשיג דגימות ניתן לתאם מראש כדי לצמצם את זמן לאחר מותו של העובר. המוצרים ההתעברות נקצרים בתוך הליך שעות 2 הודעה, אבל באופן אידיאלי ניתן להשיג על הליכי בחירה בתוך דקות. ברקמות העובר לעתים קרובות הם מקוטעים. עם זאת, באופן כללי חלק ניכר של המוח נשאר שלם לצורך זיהוי חזותי. מגבלות גיל ההריון (GA) נקבעים על פי חוק סטטוטורי, אך בוצעו תוך שימוש בפרוטוקול זה בין 18-22 שבועות GA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוח עוברית ממוקם צלחת פטרי 10 מ"ל המכיל קר כקרח DMEM/F12 פתרון בנוקאאוט. זיהוי חלקים שונים של קליפת המוח על ידי ציוני דרך אנטומיים. גבולות עבור הקורטקס פרונטלי parieto-העורפית מכוונים ידי הצטלבות אקסטרפולציה של מענית המרכזי סדק סילביוס. לנתח רקמה של הקליפה המצחית הקדמית של מענית המרכזי לאורך הגבול של הסדק סילביוס עם להבים כירורגית, והקפד לשמור על החדר בשלמות וללא נזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל שאריות הדם ואת קרומי המוח מהגוש מופרדים של קליפת המוח הקדמית. אם המדגם הוא באיכות מספקת, הוא אידיאלי לנתח את הבלוק לתוך כמה דוגמאות קטנות למטרות שונות: סעיפים (קבוע paraformaldehyde 4%, PFA) וחלבון / מבחני ה-mRNA (קפוא מהיר -80 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את גוש במוח שנבחרו צינור צנטריפוגה 50 מ"ל, ולהוסיף קר כקרח DMEM/F12 פתרון בנוקאאוט בערך 3 פעמים הנפח של רקמות. בעדינות לנתק את הרקמה על ידי pipetting מכני עם טפטפת להעביר עד 10 מ"ל כל הרקמות נעשית מקוטעת (בדרך כלל 20-30 פעמים), ואז לסנן את התאים באמצעות תא 40 מיקרומטר מסננת (BD פלקון 352340) להשיג תא בודד אחד או ליד ההשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא בסל"ד 2000 ו בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל טרי בינוני תרבות חמים (גזע Pro NSC SFM), וכן לספור את מספר הסלולרי עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ"ל תרבות מדיום חם לתוך כל 25 ס"מ 2 צלוחיות תרבות, ולהעביר 2x10 6 תאים בקבוק אחד. תרבויות נשמרות 37 ° C / 5% CO 2 באינקובטור במשך שבוע 1 לפני הניתוח. שינוי במחצית בינוני פעם בשבוע במשך תרבויות או ניסויים נוספים. </li></ol> 3. Manipulaton בתאי גזע עצביים לאפיון או experimentations נוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Neurospheres בדרך כלל הטופס 1-2 שבועות בתנאים תרבות מומלץ בקוטר NSC הנעים בין 200 ל 400 מיקרומטר. Neurospheres בשלב זה יכולה להיות מנותקת עם 0.2 g / L EDTA בסידן ומגנזיום חינם הנקס בינוני (הנקס) בשעה 37 ° C במשך 15 דקות כדי להשיג תאים בודדים. ההשעיה תאים הם הסתחררו ב 2000 סל"ד, ושטף הנקס טריים, replated במדיום חמים תת תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליזום בידול, הם תאים ניתק מצופה על poly-D-lysine/laminin 1 coverslips מצופה בצפיפות של 5 תאים לכל coverslip 1x10 (24mmX24mm). בידול Oligodendrocyte מושגת על ידי שמירה על תאים בנוקאאוט DMEM/F12 (Invitrogen, ראשי, MD) 2% B27 (50X, Invitrogen, ראשי, MD) 10 ng / ml bFGF 100 ng / ml ששש + 10ng/ml PDGF-AA ל 2days, ולאחר מכן מעבר המדיום זהה ללא גורמי גדילה לעוד 5 ימים. בידול העצבית מושגת על ידי תאים שמירה ב בנוקאאוט DMEM/F12 2% B27 (50X) למשך 7 ימים. בידול Astrocyte נעשית על ידי תאים culturing ב בנוקאאוט DMEM/F12 FBS 1% במשך שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection בתאי גזע עצביים עם גנים ניתן לעשות עם תאים ניתק מן preformed neurospheres. הנה, הראינו שתאי הגזע העצביים transfected עם EGFP-C1 ידי electroporation. Electroporation של EGFP-C1 לבנות נעשה באמצעות AMAXA ערכות Nucleofector עבור תאים עכבר גזע עצביים (VPG-1004) עם התקן Nucleofector AMAXA (Lonza AAD-1001), בעקבות הוראה של החברה. בקיצור, ה-DNA 5 מיקרוגרם עם 1 X 10 6 תאים היו מעורבים עם בינוני 100 transfection μl, ולאחר electroporation הדופק, התאים היו resuspended בתאי גזע עצביים שמירה בינוני לתרבות נוספת. התמיינות של תאים transfected עובדו עם ניתוק של ימים neurospheres 3-4 לאחר electroporation, בעקבות אותם הליכים המתוארים בשלב 3.2. </li></ol> 4. הקפאת בתאי גזע עצביים תת תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים התא ניתק הם centrifuged ו resuspended במדיום הקפאה עם ריכוז של 1x10 7 תאים / בקבוקון / ml. לאט לאט להקפיא את התאים -20 ° C, -80 ° C ואז להעביר חנקן נוזלי לאחסון זמן רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים הם הפשירו מהר עם 37 מעלות צלזיוס באמבט מים resuspended ב חימם DMEM/F12 10% נסיוב עבור לשטוף, centrifuged להסיר את הקפאת בינוני, ו resuspended במדיום תרבות התחמם. </li></ol> 5. נציג תוצאות: בתאי גזע עצביים של עובר נורמלי בגיל 18 שבועות גיל הריון היו בתרבית הבאים בשיטות המתוארות ו neurospheres ניתן לראות אחרי שבוע אחד עם סיבוב, גבולות חלקה בגודל אחיד למדי (Fig.2A). Neurospheres אלה יכולים להיות transfected עם EGFP-C1 או מבנים אחרים אחריו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Fig.2B,). Neurospheres הוקמה היו אז ניתק עם EDTA ו מצופה כמו תאים מפוזרים על coverslips מצופה. תאים מובחנים לפי הפרוטוקולים השונים נקבעו עם parafamaldehyde 4% ו מוכתם סמנים שונים סוג תא מסוים. Multipotentiality הוא ציין עם ביטוי של סמנים המעידים על נוירונים (Fig2C, D, rhodamine) האסטרוציטים (Fig2E, F, rhodamine) ו oligodendrocytes (Fig2G, H, rhodamine). התאים לא עברו electroporation של EGFP היו מובחנים גם לתוך תאים מסוגים שונים ומוכתמת עם סמנים ספציפיים תאים שונים. Multipotentiality הוא ציין עם ביטוי של סמנים המעידים על נוירונים (Fig3A, B, fluoroscein) האסטרוציטים (Fig3C, rhodamine ו Fig3D, fluoroscein) ו oligodendrocytes (Fig3E, F, rhodamine). <img src="/files/ftp_upload/2681/2681fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. סכמטי של תהליך הניסוי לבודד בתאי גזע עצביים מהמוח מושלך עוברי אדם <img src="/files/ftp_upload/2681/2681fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. מובחן הבדיל תאים עצביים propogated אדם במבחנה. (א) Neurospheres מוצגים תחת מיקרוסקופ לעומת שלב להדגים חלק, עגול גבולות הצמיחה המהירה אחרי התרבות למשך שבוע מעל 1. (ב) הכנסת פלסמידים ובונה שונים יכולה להיות מושגת באמצעות transfection. שלושה ימים לאחר transfection EGFP-C1, מספר תאים מראים ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק כפי שניתן לראות תחת immunostaining fluoroscein ו מיקרוסקופ פלואורסצנטי. EGFP-C1 neurospheres transfected הם ניתק הבדיל בתנאים שונים לתוך הנוירונים (C, D), האסטרוציטים (E, F) oligodendrocytes (G, H) וראה תחת הקרינה rhodamine. במקביל, transfected תאים EGFP חיובי מוצגים תחת fluoroscein פלואורסצנטי. תאים transfected (ראשי חץ לבן) הם נבדלים מתאי untransfected (חצים לבנים). גרעין התא מגואלות Hoechst33342. ברים הם סולם 200 מיקרומטר עבור, 100 מיקרומטר עבור B ו 25 מיקרומטר עבור CH. <img src="/files/ftp_upload/2681/2681fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Neurospheres ללא transfection הם ניתק הבדיל בתנאים שונים לתוך הנוירונים (A, B, fluoroscein), האסטרוציטים (C, rhodamine, D, fluoroscein) ו oligodendrocytes (E, F, rhodamine). גרעין התא מגואלות Hoechst33342. ברים סולם הם 25 מיקרומטר עבור AF.

<ol><li>Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+use+of+stem+cells+from+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS.</a> Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).</li>
<li>Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+properties+of+neural+stem+cell+clones%3A+plasticity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and in vivo.</a> Brain Pathol. 9, 569-598 (1999).</li>
<li>Schwartz, P., Bryant, P., Fuja, T., Su, H., O'Dowd, D., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).</li>
<li>Martinez-Serrano, A., Rubio, F. J., Navarro, B., Bueno, C., Villa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+and+progenitor+cells%3A+in+vitro+and+in+vivo+properties%2C+and+potential+for+gene+therapy+and+cell+replacement+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human neural stem and progenitor cells: in vitro and in vivo properties, and potential for gene therapy and cell replacement in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 1, 279-299 (2001).</li>
<li>Rajan, P., Snyder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+their+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and their manipulation.</a> Methods Enzymol. 419, 23-52 (2006).</li>
<li>Ruiz-Lozano, P., Rajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+in+vitro+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cells as in vitro models of disease.</a> Curr Stem Cell Res Ther. 2, 280-292 (2007).</li>
<li>Sheen, V., Ferland, R., Harney, M., Hill, R., Neal, J., Banham, A., Brown, P., Chenn, A., Corbo, J., Hecht, J., Folkerth, R., Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+proliferation+and+migration+in+human+Miller-Dieker+neural+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Impaired proliferation and migration in human Miller-Dieker neural precursors.</a> Ann Neurol. 60, 137-144 (2006).</li>
<li>Bahn, S., Mimmack, M., Ryan, M., Caldwell, M., Jauniaux, E., Starkey, M., Svendsen, C., Emson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+target+genes+of+the+neuron-restrictive+silencer+factor+in+neurospheres+derived+from+fetuses+with+Down%27s+syndrome%3A+a+gene+expression+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Neuronal target genes of the neuron-restrictive silencer factor in neurospheres derived from fetuses with Down's syndrome: a gene expression study.</a> Lancet. 359, 310-315 (2002).</li>
<li>Ferland, R. J., Batiz, L. F., Neal, J., Lian, G., Bundock, E., Lu, J., Hsiao, Y. C., Diamond, R., Mei, D., Banham, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+neural+progenitors+along+the+ventricular+and+subventricular+zones+in+periventricular+heterotopia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of neural progenitors along the ventricular and subventricular zones in periventricular heterotopia.</a> Hum Mol Genet. 18, 497-516 (2009).</li>
<li>Esposito, G., Imitola, J., Lu, J., De Filippis, D., Scuderi, C., Ganesh, V. S., Folkerth, R., Hecht, J., Shin, S., Iuvone, T., Chesnut, J., Steardo, L., Sheen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+functional+profiling+of+human+Down+syndrome+neural+progenitors+implicates+S100B+and+aquaporin+4+in+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic and functional profiling of human Down syndrome neural progenitors implicates S100B and aquaporin 4 in cell injury.</a> Hum Mol Genet. 17, 440-457 (2008).</li>
<li>Esposito, G., Scuderi, C., Lu, J., Savani, C., De Filippis, D., Iuvone, T., Steardo, L. J. r, Sheen, V., Steardo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100B+induces+tau+protein+hyperphosphorylation+via+Dickopff-1+up-regulation+and+disrupts+the+Wnt+pathway+in+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">S100B induces tau protein hyperphosphorylation via Dickopff-1 up-regulation and disrupts the Wnt pathway in human neural stem cells.</a> J Cell Mol Med. 12, 914-927 (2008).</li>
<li>Flax, J. D., Aurora, S., Yang, C., Simonin, C., Wills, A. M., Billinghurst, L. L., Jendoubi, M., Sidman, R. L., Wolfe, J. H., Kim, S. U., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftable+human+neural+stem+cells+respond+to+developmental+cues%2C+replace+neurons%2C+and+express+foreign+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and express foreign genes.</a> Nat Biotechnol. 16, 1033-1039 (1998).</li>
<li>Fults, D., Pedone, C. A., Morse, H. G., Rose, J. W., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+primitive+neuroectodermal+tumor+cell+line+from+the+cerebral+hemisphere%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemisphere.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 51, 272-280 (1992).</li>
<li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+systems%3A+physiological+players+or+in+vitro+entities%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?</a> Nat Rev Neurosci. 11, 176-187 (2010).</li>
<li>Svendsen, C. N., ter Borg, M. G., Armstrong, R. J., Rosser, A. E., Chandran, S., Ostenfeld, T., Caldwell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> J Neurosci Methods. 85, 141-152 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ישנן גישות שונות כלפי רקמות תרבות טריים לייצר שורות תאים אנושיים. מבחינה היסטורית, רקמה טרי כבר קוצרים ותרבותיים מיד לייצר תאים מסוגים שונים במערכת העצבים המרכזית. אולם גישה זו היא מוגבלת בבירור במספר דגימות שניתן להשיג, אשר במקרה של דגימות האדם, הוא בדרך כלל קטן למדי. בהתחשב במידה מינימלית של מניפולציה, בתרבית תאים עצביים טרי לספק את מערכת ניסיונית אמין ביותר על ידי הגבלת חפצי פוטנציאליים culturing המורחבת. היצע מוגבל הוביל לגישה השנייה של יצירת שורות תאים אנושיים שהיו הונצח באמצ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> נוקאאוט DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12660-012 </td><td> דיסוציאציה בינונית </td></tr><tr><td> גזע Pro NSC SFM </td><td> Invitrogen </td><td> A10509-01 </td><td> תרבות בינוני </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> Invitrogen </td><td> 10091-148 </td><td> קפוא בינוני </td></tr><tr><td> הנקס פתרון (-Ca 2 +, Mg-2 +) </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-095 </td><td> דיסוציאציה בינונית </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D2650 </td><td> קפוא בינוני </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 431788 </td><td> דיסוציאציה בינונית </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 158127 </td><td> קיבוע פתרון </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> R &amp; D </td><td> 234-FSE </td><td> בידול בינוני </td></tr><tr><td> ששש </td><td> R &amp; D </td><td> 1845-SH </td><td> בידול בינוני </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> R &amp; D </td><td> 221-AA </td><td> בידול בינוני </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td> בידול בינוני </td></tr><tr><td> עכבר אנטי MAP2 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M2320 </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> הארנב נגד DCX </td><td> תא האיתות </td><td> 4604s </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> הארנב נגד GFAP </td><td> DAKO </td><td> Z0334 </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> הארנב Anti-S100B </td><td> DAKO </td><td> Z0311 </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> הארנב נגד O1 </td><td> מתנות של פרופסור טימותי Vartanian * </td><td></td><td> 01:50 </td></tr><tr><td> הארנב נגד O4 </td><td> מתנות של פרופסור טימותי Vartanian * </td><td></td><td> 01:50 </td></tr><tr><td> 40μm מסננת תא </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td><td></td></tr></tbody></table> * טימותי Vartanian, MD, PhD, החוג לנוירולוגיה Neuroscience, Weill Cornell Medical College, ניו יורק, ארה&quot;ב

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

בתאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים יחד neuroepithelium אזור חדרית במהלך הפיתוח של הצלחת קליפת המוח. אלה אבות מוקדם בסופו של דבר להצמיח אבות ביניים מאוחר יותר, תת שונים תא עצב גליה היוצרות את קליפת המוח. היכולת ליצור ולהרחיב NSCs האנושי (מה שנקרא neurospheres) מרקמות מושלך העובר נורמלי מספק אמצעי שבעזרתו ישירות במחקר היבטים פונקציונליים של אדם נורמלי NSC פיתוח 1-5. גישה זו יכולה גם להיות מכוונת כלפי דור NSCs מהפרעות נוירולוגיות ידוע, ובכך והנותן את ההזדמנות כדי לזהות תהליכים המשנים התפשטות מחלת אבי, הגירה בידול 6-9. התמקדנו בזיהוי מנגנוני פתולוגיים האדם NSCs תסמונת דאון שעשוי לתרום פנוטיפ המחלה אלצהיימר מואצת 10,11. גם in vivo ולא במודלים חוץ גופית העכבר יכול לשכפל את הרפרטואר זהה של גנים בכרומוזום האנושי 21. כאן אנו משתמשים בשיטה פשוטה ואמינה כדי לבודד תסמונת דאון NSCs מ בוטלה קליפת המוח העוברי האנושי לגדל אותם בתרבית. מתודולוגיה מספקת להיבטים ספציפיים של קצירת לנתיחה, רקמה עם ציוני דרך אנטומיים מוגבל, מיון התא, ציפוי passaging NSCs של האדם. אנו מספקים גם כמה פרוטוקולים בסיסיים גרימת הבחנה של NSCs האדם לתוך תת תא בררניים יותר.

שיטה פשוטה ואמינה על בידוד תרבות בתאי גזע עצביים של רקמה אנושית מושלכים קליפת המוח העוברי מתואר. תרבויות שמקורם ידוע הפרעות נוירולוגיות האדם יכול לשמש אפיון של תהליכים פתולוגיים תאית ומולקולרית, כמו גם לספק פלטפורמה כדי להעריך את יעילות תרופתי.

תאי גזע עצביים (NSCs) שוכנים לאורך הנוירואפיתל של האזור הוונטריקולרי במהלך התפתחות הפלטה הקורטיקלית. פרוגניטורים מוקדמים אלו...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי גזע עצביים אנושיים מרקמה קורטיקלית פרונטלית שהושלכה. הדבר מושג תחילה על ידי הכנה מראש של התמיסות והחומרים לפני נתיחת מוחות עובריים אנושיים. לאחר מכן תתבצע תחזוקה של תאי הגזע העצביים המבודדים, הכוללת הרחבה נוספת, אפיון וניסויים.אחסון לטווח ארוך הוא אפשרי, כמו גם הקמת תרביות משנה להבחנה של תאי פרוגניטור לתאי עצב ותאי גליה. בסופו של דבר, ניתן לאפיין את הבחנת התאים ממערכת עצבים מרכזית (CNS) תקינה ולהשוואتها לזו של תאים המופקים ממערכת עצבים מרכזית עם הפרעות נוירולוגיות ידועות. המשמעויות של טכניקה זו משתרעות על פני טיפול או אבחנה של כל הפרעה במערכת העצבים המרכזית האנושית.הטכניקה מספקת פלטפורמה פשוטה ואמינה להערכת S פתולוגי ולבחינת היעילות הפרמקולוגית של תרופות חדשות עבור הפרעה נתונה. בשל ערכן החריג של תאים רב-עוצמה (multipotent cells), יש להכין את כל החומרים מראש לפני תחילת הפרוטוקול. כדי למזער את הסיכון לפגיעה בדגימות, יש להכין מראש ערכת נתיחה מקוררת, אמבט חימום לתווך תרבית בטמפרטורה של 37 °C, ותוך הקפאת תאים מקורר לאחסון לטווח ארוך.לצורך שימור בהקפאה (Cryo-preservation) עבור הדיסקציה, הכינו פינצטות מעוקרות באוטוקלב ולאבני סכין עם ידיות לצורך דיסוציאציה של תאים. הכינו פיפט-גאן, פיפטות העברה של 10 milliliter ומסנן תאים של 40 micromolar. הכינו והניחו בצד מספר צלחות תרבית של 10 centimeter לצורך הדיסקציה.מבחנות צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר לצורך דיסוסיאציה. מבחנות צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר לאחסון רקמה ומבחנות הקפאה להקפאת תאים. כדי להבטיח הצלחה, יש לקצור רקמה חיה בגיל 18 עד 22 שבועות בתוך שעתיים מרגע זמינותה.באופן אידיאלי, ניתן להשיג רקמה עוברית תוך דקות ספורות מרגע זמינותה על ידי סיכום איסוף לאחר הליכים אלקטיביים. הרקמות הן לרוב מרוסקות, אך חלק משמעותי מהמוח נשאר שלם. אספו את המוח לתוך צלחת פטרי בנפח 10 מיליליטר הממולאת ב-dissection Medium קר מאוד.זהו את החלקים השונים של הקורטקס (קליפת המוח) באמצעות נקודות ציון אנטומיות. גבולות הקורטקס הפרונטלי, הפריאטלי והאוקסיפיטלי נקבעים לפי נקודת ההצטלבות המשוערת של החריץ המרכזי (central sulcus) והחריץ הסילביאני (syl fissure). השתמשו בלהבים כירורגיים כדי להוציא רקמה מהקורטקס הפרונטלי, קדמית לחריץ המרכזי ולאורך הגבול של החריץ הסילביאני.יש לוודא שהחדר נשאר שלם וללא נזק. כעת, הסר שאריות דם וקרומי מוח מגוש קליפת המוח הפרונטלית שהופרד. אם הדגימה אינה מפורקת מדי והיא גדולה מספיק, חתוך את הגוש למספר דגימות קטנות יותר כדי לשמור חלקן לבדיקות היסטולוגיה ובדיקות חלבון או mRNA.כעת העבירו בלוק של רקמת מוח למבחנת צנטריפוגה של 50 מיליליטר והוסיפו מדיום לדיסקציה קר מאוד בנפח השווה לפי שלושה נפח הרקמה. בעזרת פיפטה, בצעו דיסוציאציה עדינה של הרקמה עד שכל הרקמות יתרסקו. כדי להביא את התאים לתליה מלאה, סננו אותם דרך מסננת תאים של 40 מיקרומולר.כעת סנטריפיגו את תרחיף התאים והשעיכו מחדש את משקע התאים ב-10 milliliters של מצע גידול טרי וחם. בעזרת המוציטומטר, ספרו את מספר התאים וחשבו את הנפח עבור 2 מיליון תאים. כעת העבירו את הנפח של 2 מיליון תאים לכל בקבוק תרבית ריבועי של 25 סנטימטר.הוכן עם חמישה מיליליטר של מצע גידול חמים. שמרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך שבוע אחד. החליפו חצי מכמות המצע פעם בשבוע עבור תרביות ארוכות יותר. לאחר שבוע עד שבועיים בתרבית, נוצרים בדרך כלל נוירוספירות עם קוטר NSC שבין 200 ל-400 מיקרון.על מנת לפרק את הנוירוספירות לתאים בודדים, דגרו את התאים עם EDTA במדיום הנקס (Hank's medium) למשך 15 דקות. כדי להכין את התאים התלוים לתת-תרבית, סבבו אותם במערכת צנטריפוגה, שטפו אותם במדיום הנקס והחזירו את התאים למדיום תרבית חם.כדי להתחיל את הדיפרנציאציה, זרעו את התאים המפוהקים על זכוכית כיסוי מצופה ב-poly-D-lysine ו-Laminin 1 בצפיפות של 100,000 תאים לכיסוי זכוכית, והדגרירו למשך 30 דקות. ניתן להבחין בקלות בדיפרנציאציה של התאים לאוליגודנדרוציטים, נוירונים או אסטרוציטים.לבידול עצבי, יש לתחזק את התאים במדיום עם B 27 למשך שבעה ימים. לתרבית בידול של אסטרוציטים, יש להחזיק את התאים במדיום עם FBS למשך שבעה ימים. לבידול של אוליגודנדרוציטים, יש לתחזק את התאים במדיום משונה עם גורמי גדילה למשך יומיים, ולאחר יומיים, להשתמש באותו מדיום משונה ללא גורמי הגדילה למשך חמישה ימים נוספים לצורך אחסון תאי הגזע.לאחר צנטריפוגציה של תגלי התאים המופרדים, השביו את התאים במדיום הקפאה בריכוז של 10 מיליון תאים למיכל. לכל מיליליטר, הקפיאו את התאים באיטיות בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius לפני הקפאתם בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius לאחסון לטווח ארוך. העבירו אותם לחנקן נוזלי.בהמשך, התאים מופשרים במהירות במקלחת מים בטמפרטורה של 37 °C וסוספנדים מחדש ב-D-M-E-M-F 12 מחומם בתוספת 10% serum לצורך שטיפה. התאים המחוממים סנטריפוגים לאחר מכן, השקיעה נשאבת, והתאים סוספנדים מחדש בתרבית המחוממת.תאי גזע עצביים בינוניים מעובר תקין. בשבוע 18 להיריון, הם תורגשו כדי ליצור נוירוספרות (neurospheres), אשר עברו טרנספקציה עם GFP. הנוירוספרות עברו דיפרנציאציה ליצירת מספר סוגי תאים, שקיובעו לאחר מכן ונצבעו באמצעות סמני תאים ורומין.פוטנציאל רב-תאי נצפה באמצעות ביטוי של סמנים המעידים על נוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד, להרחיב ולמניפולציה של תאי גזע עצביים אנושיים מרקמה קורטיקלית פרונטלית שהושלכה. אזורים אלו מספקים הזדמנות ייחודית לחקור מנגנוני מחלה בסביבה קורטיקלית אנושית, ולבחון את היעילות הפוטנציאלית של חומרים פרמקותרפויטיים.

generation-neural-stem-cells-from-discarded-human-fetal-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הקמנו פרוטוקול לזירוז של neuroblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות העצבית האנושית העצבית תא סוגים של פיתוח עבור מערכת העצבים המרכזית העצבית לתיקון.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

סרטון זה מדגים את השיטה להבדיל תאי גזע עצביים אנושיים מנוירוספרות לאבות עצביים ואסטרוציטים באמצעות טיפול אנזימטי ותרבית בתווך עשיר בגורמי גדילה, מה שמוביל בסופו של דבר להבשלה לתאי אב מיוחדים.

התמיינות תאי גזע עצביים אנושיים לאבות עצביים ואסטרוציטים

סרטון זה מתאר שיטה להכנת כיסויי זכוכית המצופים בפוליאורניתין ולמינין כדי לשפר את ההידבקות והצמיחה של תאי גזע עצביים. הטכניקה כוללת דגירות רציפות ושטיפות, מה שמקל על היווצרות מטריצה תומכת המקדמת צמיחה והתמיינות של תאים עצביים, המחקה מבנים הנמצאים בנוירונים.

יצירת נוירונים פירמידליים קורטיקליים מתאי גזע עצביים אנושיים

תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

פרוטוקול זה מתאר שיטת חיתוך מכאנית רומן המאפשרת ההתרחבות של אגרגטים גזע ותאים אב עצביים כדוריים ללא ניתוק להשעית תא בודד. שמירה על קשר תא / תא מאפשרת צמיחה מהירה ויציבה במשך 40 מעברים.

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

חוט השדרה של יונקים בוגרים מכיל תאי גזע/אב עצביים (NSPCs) שניתן לבודד ולהרחיב בתרבית. פרוטוקול זה מתאר את הקציר, הבידוד, התרבית והמעבר של NSPCs שנוצרו מהאזור הפרי-חדרי של חוט השדרה הבוגר מהחולדה ומתורמי השתלת איברים אנושיים.

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

הפרוטוקול מציג את התיכנות מראש של תאים היקפיים דם מונפקוף כדי לגרום לתאי גזע עצביים על ידי זיהום וירוס סנדאי, הבידול של iNSCs לתוך הנוירונים הפראים, השתלת ה-DA מקדים לתוך מגירסה חד צדדית מחלת פרקינסון מודלים העכבר, והערכה של הבטיחות והיעילות של הקדם-הלאומית של התובע המחוזי עבור טיפול PD.

דור של תאי גזע עצביים מתוך היקפי תאים מונמונומנט ובידול לכיוון תא העצב הפראמינרגיים ללימודי השתלות

אנו מציגים שיטה ללא הנדסה גנטית (ללא GM) כדי להשיג תאים עם פנוטיפ עצבי מתאי דם היקפיים מתוכנתים מחדש. הפעלה של מסלול איתות המקושר לחלבון חדשני הקשור ל- GPI אנושי חושפת שיטה יעילה ללא GM להשגת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

דור ללא GM של תאים עצביים שמקורם בדם

למד שיטה להפקת תאי גזע עצביים מרקמה קליפתית עוברית אנושית. השיטה מאפשרת הרחבה, אפיון והבדלה לתאי עצב וגליה לחקר מחלות מערכת העצבים ולבדיקת יעילות תרופות.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

גלה סרטונים נוספים