הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי גזע עצביים אנושיים מרקמה קורטיקלית פרונטלית שהושלכה. הדבר מושג תחילה על ידי הכנה מראש של התמיסות והחומרים לפני נתיחת מוחות עובריים אנושיים. לאחר מכן תתבצע תחזוקה של תאי הגזע העצביים המבודדים, הכוללת הרחבה נוספת, אפיון וניסויים.

אחסון לטווח ארוך הוא אפשרי, כמו גם הקמת תרביות משנה להבחנה של תאי פרוגניטור לתאי עצב ותאי גליה. בסופו של דבר, ניתן לאפיין את הבחנת התאים ממערכת עצבים מרכזית (CNS) תקינה ולהשוואتها לזו של תאים המופקים ממערכת עצבים מרכזית עם הפרעות נוירולוגיות ידועות. המשמעויות של טכניקה זו משתרעות על פני טיפול או אבחנה של כל הפרעה במערכת העצבים המרכזית האנושית.

הטכניקה מספקת פלטפורמה פשוטה ואמינה להערכת S פתולוגי ולבחינת היעילות הפרמקולוגית של תרופות חדשות עבור הפרעה נתונה. בשל ערכן החריג של תאים רב-עוצמה (multipotent cells), יש להכין את כל החומרים מראש לפני תחילת הפרוטוקול. כדי למזער את הסיכון לפגיעה בדגימות, יש להכין מראש ערכת נתיחה מקוררת, אמבט חימום לתווך תרבית בטמפרטורה של 37 °C, ותוך הקפאת תאים מקורר לאחסון לטווח ארוך.

לצורך שימור בהקפאה (Cryo-preservation) עבור הדיסקציה, הכינו פינצטות מעוקרות באוטוקלב ולאבני סכין עם ידיות לצורך דיסוציאציה של תאים. הכינו פיפט-גאן, פיפטות העברה של 10 milliliter ומסנן תאים של 40 micromolar. הכינו והניחו בצד מספר צלחות תרבית של 10 centimeter לצורך הדיסקציה.

מבחנות צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר לצורך דיסוסיאציה. מבחנות צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר לאחסון רקמה ומבחנות הקפאה להקפאת תאים. כדי להבטיח הצלחה, יש לקצור רקמה חיה בגיל 18 עד 22 שבועות בתוך שעתיים מרגע זמינותה.

באופן אידיאלי, ניתן להשיג רקמה עוברית תוך דקות ספורות מרגע זמינותה על ידי סיכום איסוף לאחר הליכים אלקטיביים. הרקמות הן לרוב מרוסקות, אך חלק משמעותי מהמוח נשאר שלם. אספו את המוח לתוך צלחת פטרי בנפח 10 מיליליטר הממולאת ב-dissection Medium קר מאוד.

זהו את החלקים השונים של הקורטקס (קליפת המוח) באמצעות נקודות ציון אנטומיות. גבולות הקורטקס הפרונטלי, הפריאטלי והאוקסיפיטלי נקבעים לפי נקודת ההצטלבות המשוערת של החריץ המרכזי (central sulcus) והחריץ הסילביאני (syl fissure). השתמשו בלהבים כירורגיים כדי להוציא רקמה מהקורטקס הפרונטלי, קדמית לחריץ המרכזי ולאורך הגבול של החריץ הסילביאני.

יש לוודא שהחדר נשאר שלם וללא נזק. כעת, הסר שאריות דם וקרומי מוח מגוש קליפת המוח הפרונטלית שהופרד. אם הדגימה אינה מפורקת מדי והיא גדולה מספיק, חתוך את הגוש למספר דגימות קטנות יותר כדי לשמור חלקן לבדיקות היסטולוגיה ובדיקות חלבון או mRNA.

כעת העבירו בלוק של רקמת מוח למבחנת צנטריפוגה של 50 מיליליטר והוסיפו מדיום לדיסקציה קר מאוד בנפח השווה לפי שלושה נפח הרקמה. בעזרת פיפטה, בצעו דיסוציאציה עדינה של הרקמה עד שכל הרקמות יתרסקו. כדי להביא את התאים לתליה מלאה, סננו אותם דרך מסננת תאים של 40 מיקרומולר.

כעת סנטריפיגו את תרחיף התאים והשעיכו מחדש את משקע התאים ב-10 milliliters של מצע גידול טרי וחם. בעזרת המוציטומטר, ספרו את מספר התאים וחשבו את הנפח עבור 2 מיליון תאים. כעת העבירו את הנפח של 2 מיליון תאים לכל בקבוק תרבית ריבועי של 25 סנטימטר.

הוכן עם חמישה מיליליטר של מצע גידול חמים. שמרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך שבוע אחד. החליפו חצי מכמות המצע פעם בשבוע עבור תרביות ארוכות יותר. לאחר שבוע עד שבועיים בתרבית, נוצרים בדרך כלל נוירוספירות עם קוטר NSC שבין 200 ל-400 מיקרון.

על מנת לפרק את הנוירוספירות לתאים בודדים, דגרו את התאים עם EDTA במדיום הנקס (Hank's medium) למשך 15 דקות. כדי להכין את התאים התלוים לתת-תרבית, סבבו אותם במערכת צנטריפוגה, שטפו אותם במדיום הנקס והחזירו את התאים למדיום תרבית חם.

כדי להתחיל את הדיפרנציאציה, זרעו את התאים המפוהקים על זכוכית כיסוי מצופה ב-poly-D-lysine ו-Laminin 1 בצפיפות של 100,000 תאים לכיסוי זכוכית, והדגרירו למשך 30 דקות. ניתן להבחין בקלות בדיפרנציאציה של התאים לאוליגודנדרוציטים, נוירונים או אסטרוציטים.

לבידול עצבי, יש לתחזק את התאים במדיום עם B 27 למשך שבעה ימים. לתרבית בידול של אסטרוציטים, יש להחזיק את התאים במדיום עם FBS למשך שבעה ימים. לבידול של אוליגודנדרוציטים, יש לתחזק את התאים במדיום משונה עם גורמי גדילה למשך יומיים, ולאחר יומיים, להשתמש באותו מדיום משונה ללא גורמי הגדילה למשך חמישה ימים נוספים לצורך אחסון תאי הגזע.

לאחר צנטריפוגציה של תגלי התאים המופרדים, השביו את התאים במדיום הקפאה בריכוז של 10 מיליון תאים למיכל. לכל מיליליטר, הקפיאו את התאים באיטיות בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius לפני הקפאתם בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius לאחסון לטווח ארוך. העבירו אותם לחנקן נוזלי.

בהמשך, התאים מופשרים במהירות במקלחת מים בטמפרטורה של 37 °C וסוספנדים מחדש ב-D-M-E-M-F 12 מחומם בתוספת 10% serum לצורך שטיפה. התאים המחוממים סנטריפוגים לאחר מכן, השקיעה נשאבת, והתאים סוספנדים מחדש בתרבית המחוממת.

תאי גזע עצביים בינוניים מעובר תקין. בשבוע 18 להיריון, הם תורגשו כדי ליצור נוירוספרות (neurospheres), אשר עברו טרנספקציה עם GFP. הנוירוספרות עברו דיפרנציאציה ליצירת מספר סוגי תאים, שקיובעו לאחר מכן ונצבעו באמצעות סמני תאים ורומין.

פוטנציאל רב-תאי נצפה באמצעות ביטוי של סמנים המעידים על נוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד, להרחיב ולמניפולציה של תאי גזע עצביים אנושיים מרקמה קורטיקלית פרונטלית שהושלכה. אזורים אלו מספקים הזדמנות ייחודית לחקור מנגנוני מחלה בסביבה קורטיקלית אנושית, ולבחון את היעילות הפוטנציאלית של חומרים פרמקותרפויטיים.