ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בשיטת הגברת אותות חדשה ומהירה כדי לזהות ולאפיין תת-סוגים של נגיפי שפעת על שבב השפעת, פלטפורמת מיקרו-מערך בצפיפות נמוכה. זה מושג על ידי שילוב DTPs ביוטיניליים ושימוש בפריימרים עם קצה פוספול של חמישה ראשוניים כדי להגביר את מקטע הגן של המטריצה ומקטע גן לא מבני מתמציות RNA של שפעת. לאחר PCR מגיע עיכול אנזימטי ופיצול כדי ליצור מוצר ויראלי קצר חד-גדילי ביוטיניל ומוגבר, אשר לאחר מכן מוברז למערך לאחר הכלאה.

זיהוי פוקס משתמש בפילמור פוטו כדי לגדל כתמי פולימר גדולים שבהם מתרחשת הכלאה, ודפוסי הכלאה דיפרנציאלית משמשים לאיתור תת-סוגים של נגיפי שפעת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו זיהוי פלואורסצנטי סטנדרטי, הוא שהיא זולה למדי ומספקת תוצאה מהירה הנראית לעין בלתי עם רגישות אנליטית דומה לפלואורסצנטיות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אפיון נגיפי השפעת באמצעות שבב השפעת מכיוון שמדובר בשיטת זיהוי אוניברסלית.

ניתן ליישם את Ampl Fox גם על מגוון רחב של מערכות אחרות, כגון מיקרו-מערכים אחרים מבוססי DNA וחלבונים בצפיפות נמוכה. בתיאוריה, כל מוצר ביוטינילי אמור להיות מסוגל להיות מסוגל לזהות באמצעות אמוקס. מי שידגים את ההליך יהיו אמבר טיילור, מדענית עמיתה, וקווין מולטון, עוזר מחקר כאן באנדוור, ששניהם מילאו תפקיד מרכזי בפיתוח מכשיר פוקס וכימיית הגילוי בשנים האחרונות.

חלץ RNA ויראלי מ-200 מיקרוליטר של מבודד ויראלי באמצעות ערכת מיצוי RNA ויראלי ופרוטוקול היצרן. יש להוציא 60 מיקרוליטר מהנפח הסופי ולאחסן תמציות במינוס 70 מעלות צלזיוס ומטה לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן הכינו את תערובת המאסטר R-T-P-C-R על ICE לפי פרוטוקול היצרן.

בעזרת תערובת DNTP ביוטינילית, מוסיפים את תערובת הפריימר של שבבי השפעת, המכילה את הריכוזים המוצגים לתערובת המאסטר. פריימר אחד מכל סט צריך להכיל קבוצת פוספול של חמישה ראשוניים כדי להקל על העיכול האנזימטי. ערכת פריימר שפעת מייצרת מוצר זוג בסיסים 1032, וערכת פריימר שפעת B מייצרת מוצר זוג בסיס 811.

מערבולת קצרה ומפיצים 18 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לצינורות PCR דקים בעלי דפנות. לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטר של תבנית RNA לכל צינור תגובה. העבירו את צינורות ה-PCR למחזור תרמי והשתמשו בפרופיל רכיבה עם טמפרטורת כריעה מתאימה.

פרופיל הרכיבה המשמש בבדיקה זו מוצג כאן. הכן את תערובת העיכול האנזימטית על ידי שילוב של 2.2 מיקרוליטר של מאגר תגובת האנזים, 0.8 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ו-1.0 מיקרוליטר של אנזים למבדה אקסונוקלאז לכל תגובת PCR. הסר את הדגימות מהמחזור התרמי והוסף ארבעה מיקרוליטר לכל צינור PCR.

החזר את הדגימות למחזור התרמי ותכנת את המחזור התרמי כפי שמוצג ל-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, החל בארות הכלאה חד פעמיות סביב המיקרו-מערכים להכלאה. לאחר מכן שטפו את המגלשות ב -110 מיליליטר מים מטוהרים על שייקר אורביטלי למשך חמש דקות.

יבש את המגלשות על ידי נגיעה עדינה במגבון טישו לקצה הבאר. שלב 22 מיקרוליטר של שני מאגר הכלאה x עם כל אחד מתוצרי ה-DNA היחידים המקוטעים מעורבב לזמן קצר ופיפטה 40 מיקרוליטר לבארות המיקרו-מערך. אפשר לשקופיות להכלאה במשך שעה בתא לחות לאחר הכלאה, הסר את השקופיות מתא הלחות ושטוף בקצרה כל שקופית עם שני מיליליטר מאגר כביסה D. הנח את השקופיות לתוך מתלה שקופיות.

לאחר מכן, הוסף 110 מיליליטר של מאגרי כביסה A ו-B למיכלים נפרדים באמצעות שייקר מסלולי. שטפו את מתלה השקופיות במאגר A ב-60 עד 90 סל"ד, המהירות המשמשת לכל השטיפות הבאות למשך דקה אחת. לאחר מכן הסר את מתלה ההחלקות ממאגר הכביסה A ושטוף בקצרה עם מאגר כביסה D. העבר את מתלה ההחלקה למאגר הכביסה B ושטוף על שייקר המסלול למשך חמש דקות.

לאחר הכביסה יש לייבש בעדינות את המערכים על כל שקופית עם מגבון טישו ולהניח שקופיות מיובשות בתא הלחות. כהכנה לשלבי זיהוי מטרי צבע שועל, שלב 10 מיקרוליטר משרעת, 20, מיקרוליטר של שני מאגר משרעת x ו-10 מיקרוליטר מים מטוהרים לכל מערך לעיבוד, העביר 40 מיקרוליטר של תערובת תווית לכל מערך ואפשר לתגובת התיוג להמשיך בתא לחות סגור למשך חמש דקות במהלך הכלאה, הכינו 110 מיליליטר מאגר כביסה C במיכל. לאחר התיוג, יש לשטוף מיד כל מערך עם מאגר כביסה D. הנח כל שקופית במדף השקופיות ושטוף ושטוף את מאגר C על שייקר המסלול למשך חמש דקות לאחר שטיפת ים המאגר, טבל בקצרה את מתלה השקופיות שלוש פעמים במיכל מים מטוהרים.

כדי להסיר שאריות מלח יבש את המערכים כפי שהוצג קודם לכן. אחסן את המערכים בקופסת שקופיות כהה עד להפעלת התמונה וההדמיה, שאמורה להסתיים תוך 24 שעות. לאחר מכן, הפעל את קורא Amli Fox וודא שתוכנת Amli view מוכנה להפעלת תמונות לפני זיהוי דגימת מערך.

ראשית, קבע את זמן הפעלת הצילום האופטימלי עבור כל הדגימות על ידי ביצוע הליך כיול קצר. פעם אחת בשימוש יומיומי, יש לחמם את תמיסת ההגברה לטמפרטורת החדר ולמערבולת בקצרה כדי לערבב פיפטה שלושה מיקרוליטרים של משפר הגברה לתוך בקבוקון ההגברה והמערבולת ביסודיות. למשך 10 שניות יש למרוח באופן שווה 40 מיקרוליטר של תמיסת Amplify על שקופית אחת בלבד בכל פעם, ולוודא שאין בועות.

הכנס את שקופית המיקרו-מערך לתא הפעלת התמונות של Amplify Reader. התחל את הפעלת התמונה על ידי בחירה, התחל בתוכנת PL view באמצעות זמן הפעלת התמונה שנקבע בתהליך הכיול. לאחר השלמתו, שטפו את המיקרו-מערך בשני מיליליטר מים מטוהרים כדי להסיר עודף הגברה היווצרות פולימר שקוף התרחשה כעת בנקודות המכילות DNA מטרה אך היא נראית טוב יותר.

לאחר הצביעה, הניחו לכתמי הפולימר להתייבש במשך שתי דקות. לאחר מכן פזרו שתי טיפות של אדום בשפע על המערך ואפשרו להכתים להמשיך במשך שתי דקות לאחר הצביעה שטפו במהירות את השקופית במים מטוהרים וייבשו כפי שהוצג קודם לכן, הכנס את השקופית לתא ההדמיה של קורא Amli Fox כדי לאסוף תמונה באמצעות תוכנת amli לעיבוד תוצאות. התמונה השמאלית מציגה גילוי של דגימה מהרומן H one N one משנת 2009 מאת אמלי פוקס.

בעוד שהתמונה מימין משתמשת בפלואורסצנטיות מסורתית שנוצרת על ידי סורק מיקרו-מערך פלואורסצנטי קונפוקלי, ניתן לראות בקלות את אותו דפוס זיהוי כולל עבור שתי השיטות. עם זאת, תוצאת שועל אמלי נראית לעין בלתי. תמונות אלה מראות תוצאות של שבבי שפעת ממקור אנושי, H שלוש N שניים ממקור אנושי, H אחד N אחד, מקור חזירים, H אחד N אחד, ומערך שועלים שלילי חסר שפעת ניתנת לזיהוי.

רצפים 2 ו-3 המתוארים בכחול מייצרים אות לכל השפעת. מוצג תת-טיפוס, אך הרצפים המתוארים באדום בפינה הימנית התחתונה מייצרים רק אות למוצא החזירים, H אחד N דגימה אחת. הדגימה השלילית מציגה אות על רצף בקרה פנימי המתואר בירוק, מה שמצביע על כך שאין עיכוב או כשל בתגובת R-T-P-C-R.

לאחר השליטה ניתן לבצע את כל התהליך משאיבת הבקבוקון דרך זיהוי אמוקס ופענוח התוצאה הסופית תוך כשש שעות. ניתן להשלים את חלק זיהוי Ampl Fox של ההליך, כולל כיול מכשירים, תוך כ-30 דקות לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף גנום חלקי או מלא על מנת לענות על שאלות נוספות.

בדיקת שפעת זו נועדה כמסך ראשוני, במיוחד עבור דגימות המביאות לדפוס הכלאה ייחודי. מכיוון שזיהוי הוא מבחן כללי, אנו מקווים שהחוקרים ימצאו יישומי מיקרו-מערך חדשים ומעניינים בצפיפות נמוכה שעבורם הזיהוי יכול להוסיף ערך.