Name: ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: למדו את שיטת ampliPHOX לזיהוי צבעוני של שפעת ב-DNA microarray. טכנולוגיית הפוטופולימריזציה מאפשרת זיהוי מהיר וזול של תתי-סוגי נגיפי השפעת תוך דקות ספורות, עם רגישות דומה לשיטות פלואורסצנטיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

InDevR מודה NIH / NIAID U01AI070276 ו R43AI077112 למימון עבודה זו.

1. לדוגמא הגברה באמצעות RT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית רנ"א נגיפי מחומר קליני או נגיפי לבודד באמצעות MinElute ספין Qiagen ערכת וירוס בשיתוף עם פלטפורמה QIAcube אוטומטיות גרעין מיצוי חומצה. עקירות מבוצעות על דגימה 200 μl עם נפח elution הסופי של μl 60. תמציות חנות ב -70 ° C או נמוכה לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזור החופשי תבנית, להכין את תערובת RT-PCR מאסטר על הקרח על פי פרוטוקול של היצרן. כדי לשלב ביוטין במהלך RT-PCR, שימוש בתערובת dNTP biotinylated במקום היצרן סיפק לערבב dNTP. עלות באמצעות תערובת dNTP biotinylated הוא פחות מ 1 $ USD / assay. שיטות חלופיות ההתאגדות ביוטין כגון שימוש פריימר biotinylated יכול לשמש גם. הוסף פריימר מתערבב בריכוזים הסופי של 1.0 מיקרומטר עבור שפעת A, 1.0 מיקרומטר עבור שפעת B, ו - 0.14 מיקרומטר על הבקרה הפנימית. שפעת ערכה פריימר מגביר את הגן מטריצה ​​קטע (1032 מוצר NT) ואת ערכת שפעת תחל ב מגביר קטע הלא מבניים גן (811 מוצר NT). כל קבוצה פריימר FluChip מכיל פריימר עם קבוצת phosphoryl '5 כדי להקל על דור ה-DNA גדילי יחיד באמצעות עיכול אנזימטי עם exonuclease למבדה הבאים PCR. המוצר שהתקבל תקועים אחד דורש פעמים הכלאה קצר בהרבה המקבילה גדילי כפול משמעותית מקצרת את זמן assay הכוללת. תערובת מוכנה מראש של primers אלה, כמו גם תבנית RNA פנימית מלאה זמינים InDevR לחוקרים המעוניינים על בסיס מוגבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת ולהפיץ 18 μl של האב לתוך תערובת דק דופן צינורות PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צינורות על הקרח לאזור עבודה מתאימה בנוסף התבנית, ולהוסיף 2 תבנית μl אל צינור כל תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צינורות PCR כדי Cycler תרמית, ולהפעיל את פרופיל תרמית הבאים: שעתוק לאחור על 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, איון אנזים / הפעלה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, 40 מחזורי PCR של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 ° C עבור ה -30, ו - 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, וכן הרחבה סופית ב 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li></ol> 2. הכלאה של RT-PCR מוצרים microarrays צפיפות נמוכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפיק DNA גדילי יחיד עבור הכלאה FluChip, להכין את התערובת עיכול אנזימטי על ידי שילוב של 1.0 למבדה μl exonuclease האנזים, 2.2 μl של למאגר התגובה הנלווה, ו 0.8 μl מים nuclease חינם. כמויות אלה הן למדגם יחיד, אך ניתן לשנותם פשוט על המספר הכולל של הדגימות להתעכל. הסר דגימות Cycler תרמי להוסיף 4 μl של התערובת מוכנה התגובה לכל לעכל את גדיל פוספורילציה של המוצר PCR. חזור דגימות Cycler תרמי התוכנית Cycler תרמית 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ואחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להשלים עיכול אנזימטי ופיצול צעדים חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microarrays שפעת אישית בשימוש מודפסות בשקופיות אלדהיד פונקציונליות זכוכית על ידי אפלייד microarrays Inc (בטמפה, AZ). 5'-amino רצפים ללכוד הסתיים משולבים עם חיץ אכון אופטימיזציה מודפס בריכוז סופי של 20 מיקרומטר (למעט רצף הבקרה החיובית אשר בנוסף יש שינוי 3'-ביוטין, והוא הבחין בריכוז הסופי של 500 ננומטר) . ללא מגע תצפית השיטה משמשת, בקוטר נקודה אופטימלית של 300 מיקרומטר מרכז אל מרכז המגרש 700 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר microarrays מתיבת אחסון להחיל לשימוש יחיד בארות הכלאה סביב microarrays על ידי הסרת סדין מגן לחיצה בחוזקה מסביב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שקופיות לפח לשטוף המכילה 110 מ"ל של מים מטוהרים במשך 5 דקות לשטוף מראש הכלאה באמצעות שייקר מסלולית בסל"ד 60-90. יבש בעדינות את המערך על ידי נגיעה מגב רקמות לשפת הבאר ומאפשר למים להיות רשע משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 22 μl של הצפת הכלאה 2x עם כל המוצרים מקוטעת ssDNA, ו 40 pipet μl של פתרונות הכלאה לתוך בארות microarray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות להכליא בתא לחות סגור למשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מן החדר לחות, בקצרה לשטוף מערכים עם שטפי הצפת D בבקבוק לשטוף לפני הצבת למעמד שקופיות. בדרך כלל נפח שטיפה של שטפי הצפת D הוא 2 מ"ל לכל המערך. שקופית המקום מדף המכיל שקופיות סל כביסה המכילה 110 מ"ל לשטוף הצפת המקום א סל על מסלולית שייקר בסל"ד 60-90 דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מתלה שקופיות הצפת לשטוף, בקצרה לשטוף עם שטפי הצפת D, החלק העברת מתלה לסל המכיל מאגר B לשטוף, ולנער בסל"ד 60-90 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש בעדינות את המערך בכל שקופית, שקופיות מקום יבש בתא לחות לקראת השלבים ampliPHOX Colorimetric איתור. </li></ol> 3. ampliPHOX: תיוג המוצר הכלאה שבבי כיול עם ampliTAG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב 10 μl של ampliTAG, 20 μl של חיץ ampliTAG 2x, ו - 10 μl של מים מטוהרים עבור כל מערך להיות מעובד. כרכים מגיב וניתן לשנותם פשוט על המספר הכולל של הדגימות. הקפד להכין תערובת תיוג מספיק כדי להסביר את כל מערכי המדגם מערכי כיול הצורך. מספר שבבי כיול צורך תלוי אם אתה מבצע כיול מלא (עבור מכשיר חדש, או הרבה החדשה של ריאגנטים), או פשוט לבדוק את המכשיר. עבור כיול מלא, 3 שבבי כיול צריך להיות מתויג, ואת לבדיקה מגיב, רק שבב יחיד כיול צריך להיות מתויג. שים לב לפני מערכי כיול מסומנים, הם צריכים לעבור שלב טרום הכלאה הכביסה אשר תוארה בעבר עבור מערכי שפעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 40 μl של תערובת תווית למערך כל ולאפשר תיוג התגובה להמשיך בתא לחות סגור במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לשטוף מערכים עם שטפי הצפת D בבקבוק לשטוף לפני הצבת שקופיות במעמד שקופיות. העברת מתלה לפח המכיל 110 מ"ל של שטפי הצפת C, לנער בסל"ד 60-90 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש סל לשטוף שני, מלא מים מטוהרים, לבצע שלוש מטבלים ברציפות מים קצרה כדי להסיר שאריות מלח. יבש מערכי בעדינות על ידי נגיעה מגב רקמות לקצה את הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microarrays כיום שכותרתו כראוי עם ampliTAG, והיתר של הליך זיהוי ampliPHOX יכול להתבצע. Photoactivation הדמיה של מערכי שכותרתו אמורה להסתיים בתוך 24 שעות, ומערכים נוספים ניתן לאחסן בתיבת שקופית כהה עד לשימוש. </li></ol> 4. ampliPHOX: כיול, הגברה אות, הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ampliPHOX הקורא ולהבטיח תוכנה ampliVIEW מוכן photoactivation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את זמן photoactivation אופטימלי באמצעות שבבי כיול. בנוסף במבוא קצר העוקב, הליך זה הוא התווה גם במדריך מבצע ampliPHOX בפירוט. שבבי כיול מכילים סדרה של דילולים של רצף בקרה biotinylated כי מנוצלים כדי לייעל את הרגישות של assay, במטרה למקסם את מספר השורות של השבב כיול המייצרים איתות חיובי כפי שנקבע על ידי התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ampliPHY מ 4 ° C, לאפשר לחמם לטמפרטורת החדר, והמערבולת בקצרה לערבב. 3 Pipet μl של ampliPHY משפר לתוך הבקבוקון ampliPHY, והמערבולת ביסודיות במשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן שווה להעביר 40 μl של פתרון ampliPHY לתוך microarray היטב המכיל את ampliTAG שכותרתו מערך, להבטיח כי בועות לא נוכחים. סגור את הבקבוקון ampliPHY בין כל יישום. הכנס את השקופית microarray למפרץ photoactivation של הקורא ampliPHOX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מערך הכיול הראשונה, להשתמש photoactivation ברירת המחדל זמן בתיבת 'זמן' בלוח השמאלי של התוכנה, ולחץ על 'התחל' הירוק כפתור כדי להפעיל את photoactivation. לאחר השלמת, הסר את מערך ולשטוף עם מים מטוהרים להסיר ampliPHY עודף. נקה היווצרות פולימר על כמה נקודות צריך עכשיו להיות גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר כתמים פולימר להתייבש במשך 2 דקות, ולאחר מכן להפיץ שתי טיפות ampliRED על מערך ולאפשר מכתים להמשיך במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, במהירות microarray לשטוף עם מים מטוהרים ויבש עם רקמות לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס microarray לתוך המפרץ הדמיה של Reader ampliPHOX, ולחץ על כפתור 'תמונה לכידה חדש' בכרטיסייה הדמיה. צילמו פעם, להתאים את היבול ולשמור את התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסיה ניתוח, בחר את שבב כיול מסכה על כפתור 'מיקום אוטומטי "כדי להתחיל את הניתוח. התוכנה באופן אוטומטי לייצר "שיא סיכום 'מציג את תוצאות לכימות. בהתבסס על תוצאות אלו, בזמן photoactivation מותאם על ידי 10 שניות עבור מערך הכיול השני, הנוהל חזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן photoactivation האופטימלי נקבע, מערכי המדגם יכול להיות מעובד באמצעות הגברה אות באותו פרוטוקול הדמיה המשמש מערכי כיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתמונה כבשו עבור מערכי המדגם, מסכה עבור פריסת מערך מסוים שלך כגון הפריסה שפעת מערך המתואר כאן יכול להיות תוכנה created.The ampliVIEW הוא מסוגל לבצע ניתוח תמונת אוטומטיות להפקת התוצאות שפעת subtyping עבור כל דגימה. </li></ol> 5. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. איור סכמטי של שיטת זיהוי ampliPHOX colorimetric. (א) ה-DNA היעד Biotinylated הוא הכלאה לזהות כל אחד במערך, ו - (ב) שכותרתו עם ampliTAG. (ג) פתרון ampliPHY הוא הוסיף אז, (ד) חשיפה לאור כדי ליצור פולימר כתמים נראים לעין. (ה) נקודות הפולימר נוצר מוכתמות לאחר מכן עם צבע רעיל כדי לשפר את החדות. ontent "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. (א) שפעת פריסת microarray צפיפות נמוכה. רצפים 1-7 ו - 10-13 שפעת היעד, רצפים 8, 9 היעד שפעת B. (B) ampliPHOX ו (ג) תמונות הקרינה של 2009 הרומן H1N1 ("שפעת החזירים") הדגימה מראה את דפוס זיהוי זהה על ידי שני שיטות. <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. משמאל לימין, תמונות מייצג ampliPHOX לשפעת H3N2, מוצא האדם, H1N1, H1N1 2009 רומן (החזירים המוצא), ו טיפוס שלילי. כל 3 תת מראים דפוסים ברורים ויזואלית במערך. שימו לב שלילית שרק הבקרה הפנימית MS2 נתפסת, המציין את ההגברה RT-PCR לא היה עצור.

<ol><li>Kumar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Widely+Used+Diagnostics+%22DNA-Microarray%22-A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Amer+J+Inf+Dis%22%5BJournal%5D)">The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review.</a> Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).</li>
<li>Miller, M. B., Tang, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Concepts+of+Microarrays+and+Potential+Applications+in+Clinical+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).</li>
<li>Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+microarrays+in+the+clinic%3A+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">DNA microarrays in the clinic: infectious diseases.</a> BioEssays. 30, 673-682 (2008).</li>
<li>Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+pathogen+detection+using+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays.</a> Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).</li>
<li>Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+the+future+hold+for+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">What does the future hold for clinical microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).</li>
<li>Dawson, E. D., Rowlen, K. L. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDawson%2C+ED+%22Influenza%3A+Molecular+Virology%22">Influenza: Molecular Virology</a>. Wang, Q., Tao, Y. J. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2010).</li>
<li>Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+hemagglutinin+subtyping+and+pathotyping+of+avian+influenza+viruses+by+a+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray.</a> J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).</li>
<li>Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluChip%3A+Experimental+evaluation+of+a+diagnostic+influenza+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray.</a> J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).</li>
<li>Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+influenza+viruses+with+resequencing+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Inf+Dis%22%5BJournal%5D)">Identifying influenza viruses with resequencing arrays.</a> Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).</li>
<li>Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+DNA+Flow-Thru+Chip%2C+a+three-dimensional+biochip%2C+for+typing+and+subtyping+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses.</a> J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).</li>
<li>Kuck, L. R., Taylor, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerization+as+an+innovative+detection+technique+for+low-density+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays.</a> Biotechniques. 45, 179-186 (2008).</li>
<li>Avens, H. J., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fluorescent+polymerization-based+signal+amplification+for+sensitive+and+non-enzymatic+biodetection+in+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomat%22%5BJournal%5D)">Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays.</a> Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).</li>
<li>Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+detection+using+polymerization-based+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Antigen detection using polymerization-based amplification.</a> Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).</li>
</ol>

כל הכותבים הם עובדי InDevR, Inc, גוף ללא מטרות רווח. InDevR הוא מסחור הטכנולוגיה ampliPHOX המתוארים להלן.

הטכנולוגיה colorimetric ampliPHOX זיהוי המוצגת כאן היא אלטרנטיבה מהירה, זולה זיהוי צבע פלואורסצנטי יחיד עבור יישומים microarray צפיפות נמוכה. מוצג באופן סכמטי באיור 1, עיקרון הזיהוי מבוסס על שימוש של תווית photoinitiator (1B). בנוכחות פתרון מונומר המכילים (1C), חשיפה לאור גורמת photoinitiator (ampliTAG) כדי לעורר תגובה פילמור רק באזורים שכותרתו (1D). למרות הפגינו כאן על מערך ה-DNA לזיהוי שפעת subtyping, הטכנולוגיה ניתן להאריך לזהות כל מוצר biotinylated שנתפסו על m...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב / ציוד </th><th> יצרן </th><th> קטלוג # </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Qiagen ספין MinElute וירוס Kit </td><td> Qiagen </td><td> 57704 </td><td> יחידה 60 μl elution </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td> אופציונלי </td></tr><tr><td> ABI 9800 Fast Cycler תרמי </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4441166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen OneStep RT-PCR ערכת </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> ערכת dNTPs לא בשימוש </td></tr><tr><td> מאגר אכון 2x </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> MI-5007 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים Biotinylated dNTP </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> MI-5009 </td><td></td></tr><tr><td> Lambda exonuclease </td><td> Epicentre ביוטכנולוגיות </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> FluChip תערובת פריימר </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> שאינם זמינים עדיין למכירה </td></tr><tr><td> Orbital שאכר </td><td> Madell טכנולוגיה </td><td> ZD-9556-A </td><td></td></tr><tr><td> לשטוף בינס </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> MI-4002 </td><td></td></tr><tr><td> לשטוף Racks </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> MI-4003 </td><td></td></tr><tr><td> הכלאה 2x הצפת </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> MI-5004 </td><td></td></tr><tr><td> כיול Chips </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> AP-5006 </td><td></td></tr><tr><td> לשטוף Buffers AD </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> MI-5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> AP-5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> AP-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2x ampliTAG הצפת </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> AP-5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, משפר ampliPHY </td><td> InDevR בע&quot;מ </td><td> AP-5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox איתור colorimetric על ה-dna microarray לשפעת

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

Microarrays DNA התפתחו כמו כלי רב עוצמה לצורך זיהוי הפתוגן. 1-5 למשל, דוגמאות רבות של היכולת סוג נגיף שפעת תת הוכחו. 6-11 זיהוי subtyping של שפעת על microarrays DNA יש יישומים הן לציבור בריאות המרפאה לגילוי מוקדם, התערבות מהירה, למזער את ההשפעה של מגיפת שפעת. הקרינה מסורתית כיום זיהוי הנפוץ ביותר שיטת microarray. עם זאת, ככל שהטכנולוגיה מתקדמת לקראת microarray לשימוש קליני, 1 להחליף מכשור יקר עם טכנולוגיית זיהוי עלות נמוכה מפגין תכונות ביצועים דומים הקרינה יעשה מבחני microarray אטרקטיבי יותר וחסכונית. הטכנולוגיה colorimetric ampliPHOX זיהוי מיועד יישומי מחקר, יש מגבלה של גילוי בתוך סדר גודל אחד של הקרינה המסורתית 11, עם יתרון העיקרי להיות העלות המשוערת של פי עשרה כלי נמוך בהשוואה סורקים microarray confocal נדרש הקרינה microarray זיהוי. יתרון נוסף הוא הקומפקטיות של המכשיר אשר מאפשר ניידות וגמישות, בניגוד מכשירים פלואורסצנטי המסורתית. בגלל הטכנולוגיה פילמור הוא לא ליניארי מטבעם כמו גילוי הקרינה, לעומת זאת, היא המתאימה ביותר עבור יישומים צפיפות נמוכה microarray שבו כן / לא לענות על נוכחות של רצף מסוים הוא הרצוי, כגון מערכי זיהוי הפתוגן. כיום הצפיפות במקום מקסימלית תואם זיהוי ampliPHOX הוא ~ 1800 נקודות / מערך. בגלל המגבלות צפיפות נקודה, microarrays צפיפות גבוהה יותר אינם מתאימים לאיתור ampliPHOX. כאן, אנו מציגים טכנולוגיה ampliPHOX זיהוי colorimetric כשיטה הגברה אות על microarray צפיפות נמוכה פיתחה לגילוי ואפיון של נגיפי שפעת (FluChip). אף על פי פרוטוקול זה משתמש FluChip (microarray DNA) כיישום אחד ספציפי של ampliPHOX איתור, כל microarray שילוב היעד biotinylated ניתן שכותרתו זוהה באופן דומה. העיצוב microarray ו biotinylation יעד להישבות הם באחריות המשתמש. ברגע היעד biotinylated כבר שנתפסו על המערך, איתור ampliPHOX יכול להתבצע על ידי תיוג הראשון עם מערך המצומד streptavidin-תווית (ampliTAG). לאחר חשיפה לאור באמצעות Reader ampliPHOX, מכשיר פילמור של פתרון מונומר (ampliPHY) מתרחשת רק אזורים המכילים ampliTAG שכותרתו מטרות. הפולימר שנוצר יכול להיות מוכתם לאחר מכן עם פתרון רעיל כדי לשפר בניגוד חזותי, ואחריו הדמיה וניתוח באמצעות חבילת תוכנה פשוטה (ampliVIEW). Assay FluChip כולו ממדגם בלתי חילוץ לתוצאות יכול להתבצע על 6 שעות, הפעולות הגילוי ampliPHOX שתוארו לעיל ניתן להשלים כ -30 דקות.

ampliPHOX טכנולוגיית זיהוי colorimetric מוצג כחלופה זולה גילוי הקרינה עבור microarrays. בהתבסס על photopolymerization, ampliPHOX מייצר נקודות פולימר מוצק לעין עירומה רק כמה דקות. תוצאות הם צילמו אז לפרש באופן אוטומטי עם חבילת תוכנה פשוטה אך רבת עוצמה.

ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

מערכי DNA זעירים (DNA microarrays) הפכו לכלי רב עוצמה לזיהוי פתוגנים.1-5 לדוגמה, דוגמאות רבות ליכולת לסווג לתסוגות ולתתי-סוגים את נגיף השפעת...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בשיטה חדשה ומהירה להגברת אות על מנת לזהות ולאפיין תת-סוגים של נגיפי שפעת על גבי ה-flu chip, פלטפורמת מיקרו-מערך (microarray) בצפיפות נמוכה. דבר זה מושג על ידי שילוב של DTPs הביוטיניליים ושימוש בפריימרים בעלי קצה פוספו[]');ל' ב-5' כדי להגביר את מקטע הגן של המטריקס ומקטע גן לא מבני מתוך תמריתי RNA של שפעת. לאחר ה-PCR מתבצעים עיכול אנזימטי ופרגמנטציה כדי ליצור תוצר נגיפי מוגבר וביוטינילילי קצר בעל גדיל בודד, אשר עובר היברידיזציה למערך לאחר תהליך ההיברידיזציה.גילוי באמצעות Fox משתמש בפוטו-פולימריזציה כדי לגדל נקודות פולימר גדולות שבהן מתרחשת היברידיזציה, ודפוסי היברידיזציה דיפרנציאליים משמשים לזיהוי תתי-סוגים של נגיפי שפעת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון גילוי פלואורסצנציה סטנדרטי, הוא שהיא זולה למדי ומספקת תוצאה מהירה הנראית לעין בלתי מזוינת, עם רגישות אנליטית דומה לזו של פלואורסצנציה. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מאפייני נגיפי שפעת באמצעות שימוש ב-flu chip, מכיוון שהיא מהווה שיטת גילוי אוניברסלית.ניתן להחיל את Ampl Fox גם על מגוון רחב של מערכות אחרות, כגון מערכי מיקרו (microarrays) אחרים בעלי צפיפות נמוכה המבוססים על DNA וחלבונים. תיאורטית, ניתן לזהות כל תוצר ביוטינילי (biotinylated) באמצעות amox. את הפרוצדורה ידגימו אמבר

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Virochip הוא microarray הפאן ויראלי שנועד לזהות בו זמנית את כל וירוסים ידועים, כמו גם וירוסים רומן על בסיס הומולוגיה ברצף נשמרת. כאן אנו מדגימים איך לנהל assay Virochip לנתח דגימות קליניות עבור נוכחות של וירוסים מוכרים ושאינם מוכרים.

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

שיטה זו מתארת ​​את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש &lt;10 נפח μl של חומר הבדיקה יש פוטנציאל הקרנה בו זמנית של פתוגנים רבים.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

בסרטון זה אנו מדגימים את התהליך לאיתור איזוטיפים של נוגדנים במספר דגימות נסיוב אנושי באמצעות שקופית microarray המודפסת עם תת-סוגים אנטיגניים של זני נגיפי שפעת.

בדיקת מיקרו-מערך אנטיגן נגיפי לאיתור איזוטיפים של נוגדנים בסרום נגד אנטיגן נגיפי

הסרטון מדגים בדיקה לכימות נגיפי שפעת A ו-B. בדיקה זו משתמשת בהגברה של אנדונוקלאז עם פריימרים ספציפיים לשפעת וזיהוי מטרות באמצעות בדיקות משואות מולקולריות.

בדיקה מבוססת מולקולרית לכימות נגיפי שפעת A ו-B

שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב פותח לשימוש כאבחון מולקולרי. השבב מבצע חילוץ חומצות גרעין, transcriptase ההפוכה, וה-PCR. שיטות לבודה והפעלת השבב מתוארות.

ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת

Microarray הגברה משלב הכלאת הגברה וmicroarray PCR אסימטרי לתוך תא בודד, אשר מייעל באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה. פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray שניתן להשתמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאבים.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

באמצעות אסטרטגיית מיקרו-מערך גליקן מודפסת, מבחן צלחת קונבנציונאלי של 96 בארות ממוזער לניתוח של נגיף ההמגלוטינין של נגיף השפעת A והספציפיות לקולטנים המכילים חומצה סיאלית.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

אנו מתארים assay מהיר, מולקולרי מבוסס השפעת A ו- B. שפעת assay מזהה כל מטרה בתוך 15 דקות על ידי העסקת הגברת בידוד תרמית עם פריימרים ספציפי שפעת ואחריו איתור יעד עם בדיקות משואה מולקולריות. שפעת A ו- B assay הוא ידידותי למשתמש ונזקק ידות על מינימאליות זמן לבצע.

איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

זרם מרובב אבחון לאיתור Zika chikungunya, וירוסים דנגה לדרוש הכנת הדוגמא מורכבים ומכשור יקרים, קשה להשתמש בסביבות משאבים נמוכה. אנו מראים אבחון המשתמשת הגברה איזותרמי עם הגששים טרומי לחלוקה ניידים במטרה סטרנד ויוכל להבדיל וירוסים אלה עם רגישות גבוהה.

הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מיקרוarray חלבון שנבנה על ידי הדפסת אנטיגנים שפעת על ניטרוצלולוזה מצופה שקופיות בו סרום בדיקה עבור נוגדנים מרובים isotypes נגד מעל 250 אנטיגנים מפני זנים וירוסים שונים, ובכך המאפשר מדידה של רוחב של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס.

שימוש של מיקרוarray אנטיגן שפעת כדי למדוד את היקף של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

למדו את שיטת ampliPHOX לזיהוי צבעוני של שפעת ב-DNA microarray. טכנולוגיית הפוטופולימריזציה מאפשרת זיהוי מהיר וזול של תתי-סוגי נגיפי השפעת תוך דקות ספורות, עם רגישות דומה לשיטות פלואורסצנטיות.

ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

גלה סרטונים נוספים