Name: הדמיה Glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ Bioorthogonal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: למד שיטת כימיה ביו-אורתוגונלית לתיוג גליקנים בעוברי דג הזברה. טכניקה זו מאפשרת הדמיה דינמית של גליקנים פוקוסילטים בשכבת העטיפה במהלך גסטרולציה מאוחרת, ומספקת יתרון על פני שיטות מבוססות לקטינים או נוגדנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (GM093282 אל PW; 3U54AI057158-06S1 כדי RDS) וקרנות ההפעלה של אלברט איינשטיין לרפואה.

1. ביצה איסוף Dechorionation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף והעברת ביצי דג הזברה על צלחת פטרי 35mm, להסיר כמו מים רב ככל האפשר ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ג / מ"ל E Pronease במדיום העובר E3 (5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0.33 mM MgSO 4, pH = 7.4) לעכל את סיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3-5 דקות, למזג את המנה לתוך כוס מלא מים ודגים (60 מ"ג "אושן מיידית" לליטר מזוקקים H 2 O), בעדינות להעביר את הביצים כוס ולאפשר ביצים כדי "ליפול" לתוך המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הביצים במים דגים שלוש פעמים. רוב הביצים ישוחרר מן סיסית שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר, להעביר את הביצים dechorionated כדי agarose מצופה בצלחות פטרי מלאות בינוני העובר E3. </li></ol> 2. Microinjection עם תוצר FucAl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הכלים הבאים הזרקה פרוטוקול דיווח 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביצים dechorionated לתוך הזרקת מנות מלאות בינוני העובר E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המחט, עומס פתרון 2 הזרקה μL. פתרון זה מכיל 20 מ"מ תוצר FucAl מסונתז chemoenzymatically 8 ו או פלואוריד אלקסה 594-dextran (5% w / v) כמו נותב או פנול טעינה צבע אדום (0.1% w / v) ב 0.2 M KCl. כביקורת שלילית, ולהחליף תוצר FucAl עם תוצר fucose בפתרון ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את המחט ולהתאים את הלחץ הזרקת ומשך להניב ירידה 1 NL 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את הביצים עם 1 NL של פתרון או. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הביצים לתוך agarose מצופה בצלחות פטרי מלאות בינוני העובר E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על ביצים 28 ° C ו להסיר את הביצים מופרית בתוך שלוש עד ארבע שעות לאחר ההפריה. </li></ol> 3. BTTES-Cu (אני)-catalyzed התגובה לכימיה לחץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עוברים את הטווח הרצוי שלבי ההתפתחות (gastrula מאוחר למשל, פילוח רקמות זחל מוקדם), מעיל בסיס צלחת 96-agarose היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 92 העובר μL בינוני E3 היטב לכל, ואחריו תוספת של 4 μL אזיד Alexa-488 פלואוריד (ממלאי 2.5 מ"מ H 2 O), 2 μL BTTES-CuSO 4 06:01 מורכבת, ללחוץ בעדינות לתערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים לבאר המכיל את הכימיה לחץ מגיב באמצעות אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר. כל טוב צריך להכיל פחות מחמישה עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 נתרן μL ascorbate מוכן טרי (ממלאי 100 מ"מ H 2 O) ליזום את תגובת לחץ על 3. הריכוז הסופי של כל אחד מגיב: Alexa פלואוריד-488 אזיד: 100 מיקרומטר; CuSO 4: 50 מיקרומטר; BTTES: 300 מיקרומטר; ascorbate נתרן: 2.5 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 דקות, להוסיף 2 bathocuproine sulphonate μL (50 מניות מ"מ H 2 O), chelator נחושת ביולוגית, כדי להרוות את התגובה ואז לדלל מיד עם 100 בינוני E3 μL העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוברים על צלחת זכוכית פטרי ולשטוף את העוברים שטופלו 2 פעמים עם 15 בינוני העובר E3 מ"ל. </li></ol> 4. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של נקודת התכה ultralow agarose (1.2% (w / v) במדיום העובר E3) על צלחת תחתית זכוכית MatTek microwell, והמקום עובר לתוך הירידה agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העוברים dorsally או רוחבית המקום צלחת על הקרח במשך 5 דקות כדי לחזק את הירידה agarose. הוסף בינוני העובר E3 בעדינות כדי בצלחת עד שהוא מכסה את הירידה agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות שדה הקרינה ובהיר נרכשים ברצף באמצעות מיקרוסקופ confocal. כל התמונות העובר נרכשים באמצעות מרווח צעד 5 מיקרומטר. דמויות Composite מוכנים באמצעות תוכנת ImageJ. </li></ol> 5. נציג תוצאות איור 1 מציג את זרימת העבודה של האסטרטגיה שלנו שני שלבים תיוג. איור 2 מציג את התיוג של עוברי דג הזברה דרך CuAAC BTTES בתיווך על הפריה 9.5 שעות שלאחר (hpf). BTTES הוא (triazolylmethyl) טריס אמין מבוססי ליגנד. היא מאיצה באופן דרמטי כאשר CuAAC בתיאום עם ב Cu שנוצר באתרו (אני), ומקדם את התגובה cycloaddition במהירות במערכות החיים ללא לרעילות נראית לעין. מיד לאחר התגובה של 3 דק 'לחץ, אנו מסוגלים לזהות תיוג חזקים מהתמ"ג-FucAl עוברים טיפול (איור 2, לוחות משמאל). הקרינה רקע רק מזוהה עבור עוברים בקרת microinjected עם תוצר fucose (איור 2, לוחות מימין). <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. האסטרטגיה של תיוג glycans fucosylated בשכבה העוטפת של עוברי דג הזברה. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. הדמיה vivo של glycans fucosylated במהלך embryogenesis דג הזברה דרך BTTES-Cu (אני)-catalyzed כימיה לחץ. אחת תא עוברי דג הזברה הבמה microinjected עם מינון בודד של תוצר FucAl ו מותר develאל אופ hpf 9.5. עוברים הם הגיבו אז עם אלקסה פלואוריד 488-אזיד catalyzed ידי BTTES-Cu (I). עוברים הגיבו הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ confocal. מקסימום Z-הקרנת העוצמה תמונות של אלקסה פלואוריד פלואורסצנציה 488 (הפאנל העליון); שדה מוארת (הפאנל התחתון). בר קנה מידה: 100 מיקרומטר. פתרון בעיות <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בעיה </td><td> לגרום </td><td> תרופה </td></tr><tr><td> עוברים נראים בריאים </td><td> הפתרון microinjected מכיל מזהמים </td><td> טוהר של סוכרים נוקלאוטיד צריך להיות גדול מ 85%. בדוק את המקור שלך. </td></tr><tr><td> אין תיוג לאחר התגובה </td><td> ריכוז נחושת היא מתחת ל -30 מיקרומטר </td><td> היזהר שלא לדלל את הפתרון על ידי הוספת תגובה בינוני עודף העובר E3 בעת הוספת העוברים, כמו קצב התגובה יורד באופן משמעותי כאשר ריכוז הנחושת הוא מתחת ל -30 מיקרומטר. </td></tr><tr><td> עוברים מתים לאחר התגובה </td><td> טיפול לא נכון של העוברים </td><td> ודא pipet היא אש מלוטשים כלי התגובה מצופה בשכבה דקה מאוד של agarose 0.5%. </td></tr><tr><td> הדימויים נראים פצעונים </td><td> ריאגנטים לא מעורבבים היטב לפני הוספת עוברים </td><td> פעל על פי צו המומלצת של תוספת עבור ריאגנטים, ולוודא כי הכימיה ריאגנטים לחץ להיות מעורב כראוי לפני הוספת עוברים. </td></tr><tr><td> התמונות מראות את העוברים ניזוקים </td><td> נמרץ רועד פוגע בעוברים במהלך התגובה </td><td> נערו בעדינות פחות מ 10 שניות פעם עוברים הם הפתרון. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li>
<li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+Covalent+labeling+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Qsar+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li>
<li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+copper%28I%29+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li>
<li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li>
<li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li>
<li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%2C+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<p class="jove_content"&gt; הדמיה ביומולקולות<em&gt; In vivo</em&gt; מספק תובנות קריטיות הפעילות הביולוגית שלהם בסביבות מולדתם. בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך תיוג של glycans fucosylated בשכבה העוטפת של עוברי דג הזברה הוא הבין ידי microinjecting חד תא עוברי הבמה עם תוצר FucAl וכן הצמידה השני צעד fluorophore דרך CuAAC BTTES בתיווך ביולוגית<sup&gt; 3</sup&gt;. תיוג יציבה יכולה להיות מושגת תוך 2-3 דקות, ואת glycans שכותרתו הם לגילוי מוקדם ככל hpf 2.5. חשוב לציין, מנה בודדת של תוצר FucAl יכול להניב איתות לזיהוי alkyne תלויי פלורסנט עד hpf 96. גישה דו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> (II) נחושת סולפט pentahydrate </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 488 אזיד </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> dextran, Alexa פלואוריד 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D-22913 </td></tr><tr><td> (+), נתרן L-ascorbate </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic חומצה </td><td> Acros אורגניקס </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> צלחת זכוכית התחתונה microwell </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr></tbody></table>

הדמיה glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ bioorthogonal

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Glycans Imaging in vivo לאחרונה מופעל באמצעות אסטרטגיה bioorthogonal הכתב על ידי טיפול כימי בתאים או אורגניזמים עם מונוסכרידים אזיד או alkyne-tagged 1, 2. מונוסכרידים שונה, מעובד על ידי המנגנון biosynthetic glycan, ישולבו glycoconjugates פני התא. תגיות bioorthogonal אזיד או alkyne מכן לאפשר נטיה קוולנטיים עם בדיקות ניאון להדמיה, או עם בדיקות זיקה העשרה ניתוח glycoproteomic. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים משמש בדרך כלל עבור הדמיה לא פולשנית של glycans fucosylated עוברי דג הזברה, כולל: 1) microinjection של אחד התאים עוברים שלב עם תמ&quot;ג-5-alkynylfucose (תמ&quot;ג-FucAl), 2) תיוג glycans fucosylated בשכבה העוטפת של עוברי דג הזברה עם אזיד-מצומדות fluorophores דרך Cu ביולוגית (אני)-catalyzed אזיד-alkyne cycloaddition (CuAAC), ו 3) הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal 3. השיטה המתוארת כאן ניתן להרחיב בקלות לדמיין בסוגים אחרים של glycans, glycans למשל המכילים חומצה sialic 4 ו N-acetylgalactosamine 5, 6, דג הזברה מתפתח בתוך אורגניזמים חיים אחרים.

השיטה מבוססת על כימיה המאפשר תיוג, מהיר פולשנית, ויציב של alkyne-tagged glycans עוברי דג הזברה מתואר. Glycans Fucosylated בשכבה העוטפת של עוברי דג הזברה בשלב מאוחר gastrulation היו הדמיה במחקר זה.

הדמיה Glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ Bioorthogonal

דימות גליקנים in vivo התאפשר לאחרונה באמצעות אסטרטגיית רפורטר כימי ביו-אורתוגונלי, על ידי טיפול בתאים או באורגניזמים באזיד או...

הדגמה עדכנית של דימוג in vivo של גליקנים משתמשת באסטרטגיית דיווח כימי ביו-אורתוגונלי של טיפול בתאים או באורגניזמים עם מונוסכרידים המסומנים באלקין או באזיד. מונוסכרידים שעברו מודיפיקציה ומעובדים על ידי מערכת הביוסינתזה של הגליקנים משתלבים בתוך גליקוקונג'וגטים על פני השטח של התא, כסימוני אלקין או אזיד ביו-אורתוגונליים. לאחר מכן, הם מאפשרים צימוד קוולנטי עם גששים פלואורסצנטיים לצורך ויזואליזציה, או עם גששי זיקה לצורך העשרה ואנליזה גליקו-פרוטאומיקה.שיטה זו, המבוססת על כימיית קליק (click chemistry), מאפשרת סימון מהיר, לא פולשני וחסון של גליקנים ניתנים לגילוי באמצעות אלקין או אזיד בעוברים של דגי זברה, וניתן להרחיבה בקלות להדמיה של מחלקות אחרות של גליקנים באורגניזמים בשלבי התפתחות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטות לגילוי גליקנים המבוססות על לקטינים או נוגדנים, הוא שניתן ליישמה להדמיה דינמית in vivo. שיטות הדמיה המבוססות על לקטינים ונוגדנים מספקות רק תמומה רגעית (snapshot) של הגליקנים בנקודת זמן מסוימת.קשה ליישם אותם בהקשר של מחקרים דינמיים. בנוסף, סימון גליקנים באמצעות לקטינים או נוגדנים דורש את הוצאת התאים או הרקמות הרלוונטיים מסביבתם הטבעית וקיבועם לפני הניתוח. לעומת זאת, סימון גליקנים באמצעות אסטרטגיית הדיווח הכימי הבי-অর্থוגונלי (bi orthogonal chemical reporter) מתגבר על מגבלות אלו ויכול להיות מיושם ישירות להדמיה לא פולשנית של גליקנים במערכות חיות, כגון עוברי דגי zebrafish ועוברי sea elegance.באמצעות עריכה ציקלית של Azi Aine המתווכת על ידי BTT Es, גרסה תואמת ביולוגית של כימיית Qlik, ניתן להשיג סימון חזק בתוך אחת עד חמש דקות. במהלך הפרוצדורה יתבצעו השלבים הבאים במעבדה שלי: אספו והעבירו ביצי דגי זברה לצלחית פטרי בקוטר 35 מילימטר. הסירו כמה שיותר מים ולאחר מכן הוסיפו 1 mg/mL של pronase E בתווך עוברים כדי לעכל את הקוריון. לאחר שלוש עד חמש דקות, כאשר עשוי להופיע בועיות בקוריון, טבלו את הצלחית בתוך כוס כימית מלאה במי דגים.העבירו בעדינות את הביצים לכלי השיקום על ידי הנחתן להשתוף אל תוך המים. שטפו את הביצים היטב במי דגים כך שמרבית הביצים ישתחררו מהמעטפת שלהן (corion). כעת, בעזרת פיפטה שעברה חישוף באש, העבירו את הביצים המצופות לצלחות פטרי מצופות ב-agros ומלאות במצע גידול לעוברי E three. מלאו את צלחות ההזרקה שהוכנו במצע גידול לעוברי E three והעבירו אליהן את הביצים המצופות.בשלב הבא, הכינו את המחט ומלאו אותה בשני microliters של תמיסת הזרקה המכילה 20 millimolar GDP Fuk all וכן 5%lor, 5 94 dextrin כסמן (tracer) או 0.1%phenyl red loading dye ב-0.2 molar potassium chloride כביקורת שלילית. החליפו את GDP FUCA ב-GDP Fuco בתמיסת ההזרקה. כעת שברו את המחט וכווננו את לחץ ההזרקה ומשך ההזרקה עד להשגת טיפה של one nanoliter.לאחר מכן, הזרקו לביצים ננוליטר אחד של התמיסה. לבסוף, העבירו את הביצים המוזרקות לצלחות פטרי מצופות agros ומלאות בתווך E3 לעובריו, והדגירו בטמפרטורה של 28 °C בתוך שלוש עד ארבע שעות לאחר ההפריה. הסירו את הביצים שלא הופרו כאשר העוברים מגיעים לשלבי ההתפתחות הרצויים, כגון שלב ה-gasa tissue segmentation המאוחר ושלב הלרבה המוקדם.צפו את תחתיתו של לוח 96 בארות ב-aros. הוסיפו 92 µL של מצע עוברים לכל בארה, ולאחר מכן הוסיפו 4 µL של 4 88 azide ממלאי 2.5 mM במים ושני µL של קומפלקס B-T-T-E-S copper sulfate six to one באמצעות פיפטת פסטור מזכוכית מלוטשת באש. העבירו פחות מחמישה עוברים לתוך הבארה.בהמשך להוספת ריאגנט ה-click chemistry, הוסף 2.5 µL של sodium ascorbate בריכוז 100 mM שהוכן טרי. כדי להתניע את תגובת ה-click, תן לתגובה להתבצע במשך שלוש דקות. כעת הוסף 2 µL של batho Cooper wine sulfonate בריכוז 50 mM, שהוא קלטור בנחושת תואם ביולוגית, כדי לעצור את התגובה, ודלל מיד עם 100 µL של מצע גידול לעוברים (embryo medium).העבירו את העובריים לצלוחית פטרי מזכוכית ושטפו את העובריים שעברו טיפול פעמיים עם 15 milliliters של embryo.Medium. הניחו טיפה של aros בעל נקודת התכה נמוכה במיוחד על צלוחית micro well עם תחתית זכוכית מסוג matte tech והעבירו עובר אחד לתוך טיפת ה-aros. ממקמו את העובר והניחו את הצלוחית על קרח למשך חמש דקות.כדי להקריש את טיפת ה-agros, הוסיפו בעדינות מצע לעוברים (embryo medium) לצלוחית עד לכיסוי ה-agros. הוסיפו את הנוזל בטיפות באופן רצופי. השגיגו תמונות פלואורסצנציה ושטח בהיר (brightfield) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי במרווחים של 5 micron ובנו לאחר מכן דמויות מורכבות (composite figures).שימוש בתמונה. J-B-T-T-E-S הוא ליגנד מבוסס טרי-אמין המאיץ באופן דרמטי את ה-copper a c בעת קשירה עם ה-NC two שייצר copper one, ומקדם במהירות את תגובת ה-cyclo edition במערכות חיות ללא רעילות ניכרת. כאן, עוברים של דגי זברא מסומנים באמצעות נחושת המתווכת על ידי B-T-T-E-S.A a C ב-9.5 שעות לאחר ההפריה, מיד לאחר תגובת click של שלוש דקות. סימון חסון של כל העוברים שטופלו ב-GDPF מזוהה כמצופה. רק פלואורסצנציית רקע מזוהה בעוברים ביקורת שהוזרקו במיקרו-הזרקה עם GDP. סימון ודימוג של Fuco ניתנים לביצוע בכל זמן בין 2.5 ל-96 שעות לאחר ההפריה.תמונות אלו התקבלו 24 ו-48 שעות לאחר ההפריה. Pulse chase. שימוש באסטרטגיה זו מאפשר ניטור של הביוסינתזה הדינמית של גליקנים מקישרים, שבהם אלקפוקוזים המיוצרים בנקודות זמן שונות מסומנים בפלואורופורים בצבעים שונים.ניתן לשלב פרוצדורה זו עם מוטציות גנטיות או טכניקות של דיכוי גנטי מבוסס מורפולוגיה כדי לבחון את התפקידים הספציפיים של אנזימים בודדים המסנתזים גליקנים במהלך העבריות של דג הזברה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביוסינתזה של גליקנים, ניתן להחיל אותה גם על מודיפיקציות לאחר תרגום אחרות, כגון אצילציה או ליקווידציה.ניתן ליישם זאת גם בחקר חלבונים שסונטזו לאחרונה.

imaging-glycans-zebrafish-embryos-metabolic-labeling-bioorthogonal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדווחים על פיתוח של מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של העוברים מהונדס דג הזברה בצלחות multiwell. זה מדגים את היכולת לאמוד את ההשפעות תלויות במינון של מולקולה קטנה, BCI, על גדילה פיברובלסטים ביטוי פקטור כתב גנים לספק טכנולוגיה להקמת תפוקה גבוהה כימיים מסכי דג הזברה.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

סרטון זה מדגים בדיקת ספיגת נוגדנים לאיתות Notch/DeltaD באבות גליה רדיאלית של דגי זברה. היא כוללת הרכבה של עוברי דגי זברה דכוריוניים משובצים באגרוז, הזרקת תמיסת צבע המכוונת לליגנדות DeltaD על RGPs, והדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחלוקת תאים אסימטרית המאשרת את הפעלת האיתות Notch/DeltaD.

בדיקת ספיגת נוגדנים לאיתות חריץ הדמיה / DeltaD באבות גליה רדיאלית של דגי זברה

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

מתוארת טכניקה חדשה לאיתור קולטנים אנדוגניים בשפע נמוך הקיימים בעוברי דג הזברה. קראנו לו AFLIP מכיוון שהוא מורכב מתיוג זיקה של הקולטן על ידי הליגנד שלו המקושר למשקעים חיסוניים.

איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

עבודה זו מתארת ​​שיטות להקמת מודלים של היפרגליקמיה חריפה וכרונית בדג הזברה. המטרה היא לחקור את ההשפעה של היפרגליקמיה על תהליכים פיזיולוגיים, כגון נוירוגנזה מכוננת ופציעה המושרה. העבודה גם מדגיש את השימוש דג הזברה כדי לעקוב אחר מולקולות radiolabeled (כאן, [ 18 F] -FDG) באמצעות PET / CT.

מודלים חריפים כרוניים של היפרגליקמיה דג הזברה: שיטה להעריך את ההשפעה של היפרגליקמיה על נוירוגנזה ועל ביודיסטריבוצי של מולקולות Radiolabeled

כאן, אנו מציעים פרוטוקול פשוט המשלב הנדסת אוליגוסכריד מטבולית, כימיית קליקים ומיקרוסקופ הרחבה המאפשר הדמיה ביולוגית של N-גליקופרוטאינים תוך-תאיים עם רזולוציה משופרת באמצעות ציוד מיקרוסקופיה שגרתי.

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון חלבונים עם תג חלבון פלואורסצנטי בזחלי דג הזברה, מערכת in vivo שפותחה לאחרונה ושונתה שימושית במיוחד להדמיית חלבונים בשפע נמוך בדג הזברה.

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

למד שיטת כימיה ביו-אורתוגונלית לתיוג גליקנים בעוברי דג הזברה. טכניקה זו מאפשרת הדמיה דינמית של גליקנים פוקוסילטים בשכבת העטיפה במהלך גסטרולציה מאוחרת, ומספקת יתרון על פני שיטות מבוססות לקטינים או נוגדנים.

הדמיה Glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ Bioorthogonal

גלה סרטונים נוספים