Name: הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: למדו כיצד למדוד את יכולת החדירה של זני חיידקים לתאי מארח באמצעות Staphylococcus aureus ותאי אנדותל אנושיים. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome (WT 0,795,880).

פרוטוקול הבא יתאר את המחקר של הפלישה תא האנדותל ש ' aureus אבל תיאורטית יכול לשמש כדי ללמוד הפלישה הסלולר על ידי חיידק כלשהו culturable. ספציפית ס שלבים בתאי האנדותל aureus ו מסומנים. 1. הכנה של חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות S. aureus זנים של 4-16 שעות (תלוי שלב הצמיחה חובה) ב 10 Brain-Heart מרק מ"ל (BHI) עירוי ב 37 מעלות צלזיוס באוויר עם רועד בסל"ד 200. אלה התנאים לצמיחה הן ספציפיות עבור ס aureus ו - ייתכן שיהיה צורך להתאים לחיידקים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חיידקים שלוש פעמים בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM; Invitrogen) על ידי סיבובים חלופי של צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (5000 x גרם, 10 דקות), הסרת supernatant התרבות resuspension של גלולה חיידקי בהיקף שווה ערך של DMEM. מדוד את צפיפות אופטית של ההשעיה של חיידקים וכתוצאה מכך אשר לאחר מכן ניתן להתאים לפי הצורך. עבור ס aureus, אנו מכינים השעיה על OD 600 = 1, אשר מתאים ~ 10 9 CFU -1 מ"ל. </li></ol> 2. תא האנדותל תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות קו תא האנדותל EA.hy926 1 ב DMEM בתוספת העובר שור בסרום (FBS; 10%) ו-L-גלוטמין (2 mM) ב 37 ° C ב 5% CO 2. לחלופין, ונקווה העיקרי האדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVECs) ניתן לרכוש Lonza (באזל, שווייץ) ו בתרבית בינוני הבסיס אנדותל בתוספת 2% FBS, תמצית מוח שור (כולל הפרין), גדילה אנושי גורם האנדותל הידרוקורטיזון ב 37 מעלות 5% CO 2 על פי ההוראות של היצרן (Lonza). אלה התנאים לצמיחה ספציפיים עבור תאים אלה ייתכן שיהיה צורך להתאים את סוגי תאים אחרים המארח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול לתאי אנדותל ב T75 צלוחיות להשלים confluency, מאומת על ידי העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את 24 גם צלחות להכנסה של coverslips. מלקחיים פיין (להבה מעוקרים) יש צורך להעביר את coverslips, אשר יש משטח אחד מבריק אטום אחת. המקום coverslips בבארות של צלחת 24 היטב עם משטח אטום כלפי מעלה כדי לאפשר התקשרות לתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את התאים מן הבקבוק T75 עם 3 מ"ל טריפסין-EDTA (0.25%), ולהוסיף 10 מ"ל של המדיום תרבות הרלוונטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של תאים resuspended ל 24 גם צלחות המכילות coverslips Thermanox זכוכית. אחת T75 בקבוק ומחוברות של תאים תאים סיפק מספיק עבור שני 24 גם צלחות, וכתוצאה מכך כ 5 × 10 5 תאים לכל טוב (בינוני 500 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות עבור 48 שעות כפי שתואר לעיל, ולוודא 100 תא% confluency על ידי מיקרוסקופ אור הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים לשטוף coverslips ב PBS ולהוסיף 24 גם צלחות חדשות המכילות 490 DMEM μl FBS המכיל 10% בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחון את תפקידה של תהליכים מטבוליים ספציפיים הפלישה התא, מעכבי ניתן להוסיף תאים בתרבית 1 שעות לפני תוספת של חיידקים בריכוזים נשמר במהלך assay. לדוגמה, כדי לקבוע את התפקיד של סידור מחדש של אקטין ס הפלישה aureus של בתאי האנדותל, 50 מיקרומטר cytochalasin D ניתן להוסיף, או לתפקיד של caveolae, 5 מ"מ methyl-β-cyclodextrin ניתן להוסיף. </li></ol> 3. הפלישה Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של חיידקים שטף (וכתוצאה מכך כ 2 × 10 7 CFU מ"ל aureus -1 ס) זה טוב המכיל coverslip שטף בשכבה ומחוברות של בתאי האנדותל ב 490 DMEM μl המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 15-90 דקות 37 ° C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את המספר הכולל של חיידקים הקשורים התאים (חסיד והפנימו), לטבול, לשטוף את coverslips שלוש פעמים PBS ולהוסיף בארות טרי המכיל 500 טריטון 0.5% μl X-100 ב PBS. כדי להבטיח את התאים באופן מלא lyse ולשחרר את כל החיידקים הפנימו, פיפטה מספר פעמים, מצביע על קצה פיפטה ישירות על פני השטח של coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת החיידקים על ידי ציפוי ההשעיה נוזלי (או דילולים זה במידת הצורך) על פני השטח של צלחות TSA. מאז TX-100 יהיה lyse רבים חיידקים גראם שליליים, saponin יכול לשמש במקום 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את מספר החיידקים הפנימו, להסיר את supernatant תרבות מכל המכיל חיידקים מאוגד היטב ולהחליף 500 μl DMEM/10% FBS בתוספת 200 מיקרוגרם מ"ל -1 גנטמיצין. אנו משתמשים באופן שגרתי גנטמיצין ולא lysostaphin כאן כפי שהוא זול יותר מאפשר לנו לעבור בין הניסויים באמצעות סוגים שונים של חיידקים (למשל Staphylococci ו Lactococci) מבלי לשנות את פרוטוקול הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 דקות 60 להרוג את כל החיידקים תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips 3 פעמים PBS,lyse ו למנות על ידי ציפוי על גבי ה-TSA, כמתואר עבור assay את הידבקות לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרים מסוימים זה עשוי להיות עדיף על פני חזותית לספור את מספר החיידקים באמצעות מיקרוסקופ אור. במקרה זה, והן ספציפיות ס תא הפלישה aureus, להשתמש lysostaphin (10 מיקרוגרם מ"ל -1) במקום גנטמיצין פיזית להשמיד את החיידקים תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips עבור 20min ב 37 ° C ב-CO 2 בתמיסה lysostaphin, ולאחר מכן לשטוף ולתקן עם Cytopath (Cellpath). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המבול coverslips עם קריסטל סגול (0.5% w / v) עבור 5min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים לשטוף במים, האוויר יבש לעלות על שקופיות הזכוכית. מספר חיידקים לכל מ"מ 2 של בתאי האנדותל ומחוברות ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ אור. </li></ol> 4. נציג תוצאות: ביטוי של חלבונים מחייב פיברונקטין (FnBPA ו FnBPB) על פני השטח של ס aureus מקנה את היכולת לפלוש לתאי אנדותל. מחקר שנערך לאחרונה מחדש את תחום פיברונקטין מחייב של FnBPA 3. Wild-type (WT) ס aureus 8325.4 פולש לתאי אנדותל עם יעילות גבוהה, תוך זן חסר הן FnBPA ו-B (Δ fnb) הראו רמות נמוכות משמעותית של internalisation (איור 1A). השלמה של מוטנטים עם fnb קידוד פלסמיד מינוס תחום פיברונקטין מחייבים (pFnR0) לא לקדם פלישה (איור 1A). לעומת זאת, השלמה של מוטנטים בקידוד פלסמיד fnb כל הגן (pFnBA4) משוחזר הפלישה לרמות WT (איור 1A). תפקידה של FnBPA בפלישה תא האנדותל יכול להיות גם הדגימו באמצעות לארח את הביטוי Heterologous lactis Lactococcus. ביטוי של הפלסמיד המקודד FnBPA ב L. lactis (pRM9 9) לא לשפר באופן משמעותי את הידבקות לתאי אנדותל לעומת חיידקים להביע שום FnBPA (CTL) (ברים פתוחים, 1B איור). לעומת זאת, ל-לבטא FnBPA lactis פלשו לתאי אנדותל ברמות גבוהות משמעותית המתח לא הביע (ברים סגור, 1B איור). הניסויים בוצעו ארבע פעמים כפולות סטיית תקן ממוצע ± מוצג. * מייצגים נתונים שאינם שונים באופן משמעותי מבחינה סטטיסטית (p = &lt;0.05) מ WT או ערכים CTL. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הפלישה של EA. Hy926 לתאי אנדותל ש ' aureus (א) או ל lactis (B).

<ol><li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li>
<li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li>
<li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+attach+to+human+fibronectin+through+a+tandem+beta-zipper%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper.</a> Nature. 423, 177-181 (2003).</li>
<li>Magoffin, R. L., Spink, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protection+of+intracellular+Brucella+against+streptomycin+alone+and+in+combination+with+other+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics.</a> J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).</li>
<li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+intraleukocytic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Interaction of intraleukocytic bacteria.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).</li>
<li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22+Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).</li>
<li>De Melo, M. A., Pechere, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mucin+on+Campylobacter+jejuni+association+and+invasion+on+HEp-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells.</a> Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).</li>
<li>Shaw, J. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+invasion+of+human+tissue+culture+cells+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).</li>
<li>Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Host+Cell+Invasion+and+Virulence+in+Sepsis+is+Facilitated+by+the+Multiple+Repeats+within+FnBPA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).</li>
<li>Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+invasion+of+a+human+oral+cell+line+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans.</a> Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).</li>
<li>Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li>
<li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun.%22%5BJournal%5D)">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li>
<li>Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li>
<li>Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li>
<li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li>
<li>Eiff, C. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+small+colony+variants%3A+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li>
<li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li>
<li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<html> Assay אנו מתארים מבוסס על assay ההגנה גנטמיצין, אשר נמצאת בשימוש נרחב כדי ללמוד את הפלישה של תאים לארח על ידי חיידקים. תצפיות של חוסר היכולת של אנטיביוטיקה גנטמיצין אחרים כדי להרוג חיידקים תאיים נוצלו במחקרים מוקדם הפלישה של תאים לארח על ידי חיידקים 4-8. השימוש של 24, 48 או אפילו 96-היטב צלחות מאפשרת את הדור של כמויות גדולות של נתונים כמותיים לשחזור בתקופה קצרה של זמן ובעלות נמוכה יחסית. Assay היא גם מושכת משום שהיא אינה מצריכה ציוד מומחה, זה יכול להיות מותאם לעבודה עם חיידקים ותאים שונים, וניתן להשתמש בו כדי ללמוד את התפקיד של תהליכים בתא שני חיידקים מארח בפלישה 9. ואכן, מאז הניסויים המוקדמים, assay ההגנה גנטמיצין הועסק נרחב כדי למדוד תא הפלישה לארח על ידי מגוון של חיידקים שונים או אפילו שילוב של חיידקים 10,11. בעוד עקרונות הליבה זהים, שינויים קלים רבים בשיטת דווחו. במאמר זה תיארנו גרסה שלנו המצוין בו שינויים עשוי להיות נחוץ עבור חיידקים אחרים או לתאי המארח. בעת תכנון ניסוי כדי למדוד את התא המארח הפלישה שימוש בגישה זו יש מספר נקודות חשובות שיש לשקול: רגישות חיידקים גנטמיצין. זה אולי נראה מובן מאליו, אבל חשוב לוודא את החיידק הנלמד רגיש גנטמיצין בטמפרטורת הריכוז, על משך הזמן לשמש. במקרה של רגישות, יתכן שניתן יהיה להשתמש באנטיביוטיקה אחרת 5. גישה חלופית ניתן להשתמש אנזימים ממס (lysostaphin, mutanolysin, ליזוזים) 12. דגירה ו inoculum. כאשר ביצוע assay בפעם הראשונה חשוב לקבוע את הזמנים הדגירה אופטימלית inoculum חיידקי לשמש. לכן, הניסויים הראשוניים צריכה לבחון הן את הידבקות הפלישה לאורך זמן (5 דקות של עד 6 שעות). חשוב גם להעריך כיצד הפלישה מושפע ריבוי של זיהום (משרד הפנים, מספר החיידקים לכל תא). באופן כללי עדיף להשתמש במספר הנמוך ביותר של חיידקים האפשרי זה יצמצם נזק תאים בתרבית. הבדלים חשובים בין זנים עשוי לפספס אם תקופות דגירה ממושכת או inocula גדולים משמשים 9,13. נזק נייד. חשוב לשטוף את החיידקים לפני השימוש. עם זאת, הנזק התאי אינו מוגבל ייצור הרעלן. פלישה חיידקית, אינדוקציה של אפופטוזיס והפרעה תפקודים תאיים נורמליים יכולים לגרום נזק הסלולר. זה יכול להוביל חדירה של גנטמיצין לתוך התא, להרוג חיידקים הפנימו ולתת את הרושם כי הפלישה לא קרה 14. תנאי דגירה. הטמפרטורה ועל ההרכב של המדיום התרבות יכולה להיות השפעה משמעותית על הפלישה. למשל, פלישה של תאים על ידי הלה pyogenes סטרפטוקוקוס תלוי בנוכחות של פיברונקטין מסיסים, שהוא בדרך כלל קיים בסרום 15. שיקול נוסף הוא התפתחות חיידקים במדיום תרבות במהלך הניסוי. תרבות וכימות של חיידקים תוך תאיים. למרות TX-100 לא יכול להרוג חיידקים תאיים, היא עלולה לעכב את הצמיחה שלהם. ככזה, הוא חשוב לבדוק שכפול חיידקים על התקשורת מוצק בנוכחות של חומרי ניקוי. איפה השפיע, יתכן שניתן יהיה להשתמש בריכוז נמוך יותר של חומר ניקוי או להשתמש אלטרנטיבה כגון saponin. היתרון של assay הגנה גנטמיצין על מכתים את סגול קריסטל assay מיקרוסקופיה היא כי פחות עבודה אינטנסיבית, והוא מאפשר איתור בידול של תת אוכלוסיות של חיידקים הפנימו. לדוגמה, ס &#39; aureus יכול לייצר או סוג המושבה רגילה (NCT) או גרסה מושבה קטנה (SCV) 16, אשר לא יהיה להבחין באמצעות מיקרוסקופ בתאי חיידקים בודדים. היתרון של מכתים את סגול קריסטל assay assay במיקרוסקופ על ההגנה גנטמיצין היא clumping התא ניתן להסביר וכי חיידקים תאיים כי הזן &#39;קיימא אבל לא culturable &quot;המדינה יזוהו 17. בחינת התפקיד של תהליכי התא המארח בפלישה חיידקי. מחקרים רבים המועסקים מעכבי תפקוד התא המארח כגון cytochalasin D, אשר מפריעה התארגנות אקטין. מחקרים כאלה יכולים לכלול גם נוגדנים היעד על פני קרום התא קולטנים מציאה siRNA של גנים ספציפיים 18. חשוב וחיוני על מנת להבטיח כי טיפולים אלה אינם משפיעים על כדאיות או עיקול של תאים בתרבית או להיות השפעה רעילה על חיידקים. העתיד כיוונים: &quot;&gt; ontent בגלל זה assay מבוצע בדרך כלל רב גם צלחות תרבית תאים, זה אפשרי תיאורטית להתאים אותה פעולה תפוקה גבוהה הקרנה, אשר עשויה לכלול בחינה של ספריות של התא לתפקד מעכבי פוטנציאל, אנטי infectives או אנטיביוטיקה נועדה למקד חיידקים תוך תאיים. לחילופין, גישה כזו יכולה לשמש מסך ספריות מוטציה לזהות גנים המעורבים הידבקות, פלישה או הישרדות תאיים. במקרים מסוימים זה עשוי להיות רצוי לכלול כוחות גזירה (זרימה) במערכת מודל, למשל כאשר הדוגמנות האנדותל, כדי לחקות באופן הדוק יותר בסביבת vivo. מקדמות שוטפות בעיצוב וייצור של תאים זרימה microfluidic התרבות מערכות תא לספק את האפשרות של העסקת assay הגנה גנטמיצין in-host הפתוגן מודלים המשלבים כוחות גזירה. לסיכום, פרוטוקול המתואר כאן מבוסס על גישות דומות בשימוש במשך שנים רבות. זה נרחב החלים על סוגים רבים של תאים בתרבית מינים חיידקים יכולים לייצר כמויות גדולות של נתונים במהירות ובעלות נמוכה יחסית.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>עירוי מוח-לב</td><td>BioChemika</td><td>53286</td><td></td></tr><tr><td>ז'&amp;#8211;סרום בקר טל (tal bovine serum)</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2519</td><td></td></tr><tr><td>מצע בסיסי לתאי אנדותל</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3121</td><td></td></tr><tr><td>תמצית מוח בקר (כולל הפרין)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092</td><td></td></tr><tr><td>גורם גידול אנדותליאלי אנושי</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4017C</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4035C</td><td></td></tr><tr><td>GA-1000</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092C</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ליסוסטפין (Lysostaphin)</td><td>דו-צדדי</td><td>LSPN-50</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים של Thermanox</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TKT-210-330P</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Cytopath</td><td>TCS Biosciences</td><td>HC8595</td><td></td></tr><tr><td>סגול גבישי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי T75</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2618</td><td></td></tr><tr><td>מתיל-בטא-סיקלודקסטרין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>332615</td><td></td></tr></tbody></table>

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

להלן נתאר כיצד אנחנו לומדים את הפלישה לתאי אנדותל אנושיים על ידי Staphylococcus aureus חיידקים פתוגנים. פרוטוקול כללי ניתן ליישם מחקר של הפלישה תא החיידק על ידי כמעט כל culturable. שלבי בו היבטים ספציפיים של הפלישה ניתן ללמוד, כגון תפקידה של התארגנות אקטין או caveolae, יהיו מודגשות. תאים מארח מגדלים צלוחיות וכאשר מוכן לשימוש הן seeded לתוך 24 גם צלחות המכילות coverslips Thermanox. שימוש coverslips מאפשר הסרת הבאים של התאים מבארות כדי להפחית מהפרעות חלבונים בסרום מופקדים על הצדדים של בארות (אשר S. aureus היה לצרף). חיידקים גדלים לצפיפות הנדרשת ושטף כדי להסיר כל החלבונים המופרשים (רעלים למשל). Coverslips בשכבות ומחוברות של בתאי האנדותל מועברים 24 גם צלחות חדשות המכילות בינוני תרבות טרי לפני תוספת של חיידקים. חיידקים ותאים מודגרת אז יחד סכום נדרש זמן של 5% CO 2 ב 37 ° C. עבור ס aureus זה הוא בדרך כלל בין 15-90 דקות. Coverslips Thermanox יוסרו גם כל לטבול לרחוץ PBS להסיר חיידקים פנויות. אם חיידקים הקשורים הכולל (חסיד והפנימו) יש לכמת, coverslips ממוקמות אז גם טרי המכיל טריטון 0.5% X-100 ב PBS. Pipetting עדין מוביל להשלים תמוגה תאים וחיידקים הם המנויים על ידי דילול ציפוי סדרתי על אגר. אם מספר חיידקים פלשו התאים נדרשת, coverslips מתווספים בארות המכיל 500 ברקמת μl תרבות בינוני בתוספת גנטמיצין ו הדגירה נמשך 1 שעה, אשר יהרגו את כל החיידקים חיצוני. Coverslips אז יכול להיות שטף, lysed תאים וחיידקים המנויים על ידי ציפוי על אגר כמתואר לעיל. אם הניסוי דורש ראיה ישירה, coverslips ניתן לתקן ומוכתמת עבור במיקרוסקופ אור פלואורסצנטי או confocal או מוכן במיקרוסקופ אלקטרונים.

פרוטוקול כללית לחקר פלישה של תאים לארח על ידי פתוגן חיידקי, תוך התמקדות<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; ותאי האנדותל האדם.

כאן נתאר כיצד אנו בוחנים את הפלישה של תאים אנדותליאליים אנושיים על ידי הפתוגן הבקטריאלי Staphylococcus aureus. ניתן להוציא את הפרוטוקול הכללי מ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא למדוד את יכולתן של זנים חיידקיים לפלוש לתאי מאכסן. תאי מאכסן בתרבית מועברים על גבי כיסויי זכוכית (cover slips) בתוך פלטה בעלת 24 בארות ומודגראים עד שהם מגיעים לקונפלואנסיה (co fluency). לאחר מכן, כיסויי הזכוכית נשטפים ומועברים לפלטה חדשה.חיידקים שנספו מתרבית צח broth סטנדרטית נשטפים באמצעות סנטריפוגציה ולאחר מכן מתווספים לתרבית תאי המארח. לאחר שהתרחשה פלישה (invasion), חיידקים חוץ-תאיים מושמדים באמצעות Gentamycin, והכיסויות (cover slips) נשטפות ומועברות לצלחת חדשה. לבסוף, תאי המארח עוברים ליזיס והליזאטים נזרעים על צלחות הגאר כדי לקבוע את מספר החיידקים התוך-תאיים.בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות את יכולת הפלישה של חיידקים ספציפיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפתוגנזה המיקרוביאלית, כגון האופן שבו פלישת חיידקים לתאי המארח גורמת למחלה. היא יכולה גם להקל על זיהוי ואפיון של חלבונים חיידקיים המעורבים באינטראקציות בין פתוגנים למארח.את הפרוצדורה זו ידגים ד"ר Andrew Edwards, פוסט-דוקטורנט ממעבדה. עבור בדיקה זו נשתמש בתאי אנדותל אנושיים מסוג EAHY 9 26 המגודלים בבקבוקי T 75 בטמפרטורה של 37 °C. קצרו את התאים ברגע שהגיעו לכ- 95% confluence.שטפו את התאים עם 10 milliliters של PBS כדי להסיר את מצע הגידול. נתקו את התאים על ידי דגירה בתמיסת trypsin EDTA למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו אותם לפקתול קורניל (chronicle tube).בשלב הבא צנטריפוגו את התאים והשביו אותם למצב של סספנזיה בערך 25 milliliters של מצע DMEM מלא, או בריכוז של 1 million cells per milliliter, באמצעות פינצטה סטרילית. הניחו כיסוי זכוכית (cover slip) תרמי בכל באער של פלטת תרבית רקמות בעלת 24 באערים. ודאו כי הצד האטום של כיסוי הזכוכית, אליו יכולים להיצמד התאים, פונה כלפי מעלה.בשלב הבא, הוסיפו 500 µL של תאים לכל באר והדגירו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות או עד שהתאים יגיעו לفلואנסיות (confluency). לאחר ההדגרה, השתמשו בפינצטה נקייה כדי להסיר בזהירות כל זכוכית כיסוי וטבלו אותן ב-DMEM כדי להסיר חלבונים מסיסים מופרשים. העבירו את זכוכית הכיסוי השטופות לבארות נפרדות בפלטה חדשה בעלת 24 בארות המכילה 490 µL של DMEM מלא לכל באר.יש להקפיד על שמירת כיוונן של לביבות הזכוכית כך שהתאים יפנו כלפי מעלה. הכין תרבית של 10 milliliter של staphylococcus aureus בתוך מצע גידול brain heart infusion broth. העבר את תרבית החיידקים לשפופרת קונית וסבב את החיידקים בצנטריפוגה ב-5,000 ×g למשך 10 דקות.לאחר שהתאים שקעו למשקע, הסיר את העל-משקע ושפוף. השהה את המשקע ב-10 milliliters של DMEM סטרילי כדי לשטוף את התאים, סבב את התאים לצנטריפוגה פעם נוספת וחזור על השטיפה שלוש פעמים. השהה שוב את החיידקים ב-DMEM ומדוד את הצפיפות האופטית של התמיסה.כווננו את הריכוז כדי להגיע ל-OD 600 של 1.0, המקביל לכ-10⁹ יחידות יוצרות מושבות למיליליטר. ברגע שתהיה תרחיף החיידקים מוכן, הוסיפו 10 µL של חיידקים לכל באער בלוח של 24 באערים המכיל את לביבות הזכוכית.דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 15 עד 90 דקות כדי לאפשר לחיידקים להיקשר לתאים ולהפריש לתוכם. לאחר דגירה זו, שאבו את הנוזל מהכלים המכילים את החיידקים שאינם קשורים, והחליפו אותו ב-10%F-B-S-D-M-E-M מועשר ב-Gentamycin. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 60 דקות כדי להרוג את החיידקים החוץ-תאיים.לאחר דגירה זו, יש לשטוף כל זכוכית כיסוי ב-DMEM שלוש פעמים כדי להסיר את האנטיביוטיקה. לאחר מכן, העבר אותן לפלטת 24 בארות חדשה המכילה 500 microliters של 0.5%Triton X 100 ב-PBS לכל בארה.כפי שנעשה קודם לכן, יש להקפיד שהצד המכוסה של התא יפנה כלפי מעלה. שטפו בעוצמה כל זכוכית כיסוי באמצעות תמיסת Triton, על ידי פיפטור של הנוזל בבאר מעלה ומטה ישירות על זכוכית הכיסוי, כדי להבטיח שכל התאים יעברו ליזיס והחיידקים התוך-תאיים ישתחררו. בצעו דילולים סדרתיים של הליזט כדי לכמת את מספר החיידקים המדביקים. אספו את הליזט והעבירו דילולים סדרתיים לפלטות TSA.ניתן לקבוע את מספר היחידות יוצרות המושבות (Colony forming units) בצלחות אלו לאחר 24 שעות של דגירה ב-37 degrees Celsius. גרף זה מציג את מספר חיידגי ה-staphylococcus aureus מסוג הטיפוס הפראי או כאלו החסרים חלבון קושר לפיברינוגן הפולשים לתאי אנדותל אנושיים, בהשוואה לחיידגי הטיפוס הפראי. יכולת הפלישה לתאי אנדותל של staphylococcus aureus החסרים חלבון קושר לפיברונקטין פגועה באופן משמעותי.קומפלימנטציה של המוטנט באמצעות פלסמיד המקודד לחלבון קושר פיברונקטין, למינוס הדומיין הקושר לפיברונקטין, לא קידמה פלישה. בניגוד לכך, קומפלימנטציה של המוטנט באמצעות פלסמיד המקודד לחלבון קושר פיברונקטין מלא, החזירה את הפלישה לרמות של סוג בר. בניסוי זה, הוכח כי lactococcus Lactus המבטא את החלבון הקושר פיברונקטין מסוגל לפלוש לתאי מאכסן.בעוד שחיידקים שאינם מבטאים את החלבון לא היו בעלי יכולת להיצמד לתאים, היכולת הייתה זהה עבור שני הזנים. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה בתוך שלוש שעות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת החיידקים ותאי המארח לצורך חקר פלישת תאים.עליך להיות מסוגל לזהות את השלבים שבהם ניתן לשאול שאלות נוספות כדי להעמיק את הבנתך של היבט זה של המחלה.

invasion-of-human-cells-by-a-bacterial-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת היכולת של Porphyromonas gingivalis, חיידק פתוגני אנאירובי, להיצמד ולפלוש לתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). לאחר הדבקת תאי המאכסן בחיידק, התאים המארחים עוברים ליזה כדי לשחרר חיידקים דבוקים ומופנמים. כאשר הליזט מצופה בתווך מתאים, נוכחות מושבות מעידה על אינטראקציות מוצלחות בין חיידקים לתאים מארחים.

בדיקת זיהום חיידקי לחקר אינטראקציות אנאירוביות בין חיידקים לתאים מארחים

ביצוע מבחני תרבית תאים לחקירת הידבקות ופלישה חיידקים בתנאים אירוביים הוא בדרך כלל בלתי מייצג...

פלישת חיידקי enteric של תאי אפיתל במעי<em&gt; במבחנה</em&gt; באופן דרמטי משופר תוך שימוש במודל לשכת דיפוזיה אנכי

חיידקי ליסטריה הוא פתוגן חיידקים גראם חיובי משמש לעתים קרובות כמודל עיקרי לחקר טפילות תאית. הדמיה מאוחר L. חיידקי לשלבי זיהום בהקשר של מסכי RNA התערבות קטנים מאפשר למחקר העולמי של מסלולים הסלולר נדרשים לזיהום חיידקים של תאי מארח יעד.

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

ליסטריה מונוציטוגנים גורמת לזיהומים עובריים אצל נשים בהריון ודלקת קרום המוח באוכלוסיות רגישות.  תת-אוכלוסיות של חיידקים יכולות ליישב רקמת לב, ולגרום לדלקת שריר הלב בחולים ובחיות מעבדה.  כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד להעריך L. monocytogenes פלישה לתאי לב במבחנה קולוניזציה לב בבעלי חיים נגועים.

הערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של הלב בעכברים נגועים באמצעות מונוציטוגנים ליסטריה

הנה פרוטוקול מוצג למדוד לכידת חיידקים על ידי תאי CD4 + T אשר מתרחש במהלך מצגת אנטיגן באמצעות transinfection מהתאים נגועים מראש דנדריטים (DC). אנו מראים כיצד לבצע את הצעדים הדרושים: בידוד של תאים ראשוניים, של היווצרות זיהום המצומד תא DC, DC / T, ומדידה של transfection תא T חיידקים.

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

תאי האפיתל של מקלעת הכורואיד (CP) יוצרים את מחסום נוזל הדם-מוח (BCSFB). מודל חוץ גופי של BCSFB משתמש בתאי פפילומה מקלעת כורואיד אנושיים (HIBCPP). מאמר זה מתאר תרבית וזיהום בסיסי של תאי HIBCPP באמצעות מערכת הכנסת מסנן תרבית תאים.

מודל אפיתל דמה מקלעת מבוססת תאים של הגדר ודם-השדרתי נוזל לחקר זיהום חיידקים מצד basolateral

אנו מתארים שני מבחני במבחנה, ויוו זיהום זה יכול לשמש כדי לנתח את פעילותם של גורמי קידוד המארח.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

המחקר מציג שיטה לחקר זיהום חיידקי במבחנה באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע ברקמה. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל ולהבחין בין אורגנידים בשני ממדים, להדביק אותם ב-Escherichia coli פולשנית דבקה, ולהעריך קריאות מפתח, כולל פריצת מחסום אפיתליאלי, הדמיית זיהומים ותגובת RNA אפיתליאלית.

תרבית אורגנית דו-ממדית על תמצית פולשת או ממברנת בסיס לחקר אינטראקציות בין מארח לחיידקים

Wormsorter מאפשר מסכי גנטיים בelegans Caenorhabditis ידי מיון תולעים לפי ביטוי של כתבי ניאון. כאן, אנו מתארים את השימוש חדש: מיון על פי קולוניזציה על ידי פתוגן-GFP-לבטא, ואנו מעסיקים אותו כדי לבחון את התפקיד הבין היטב הכרת הפתוגן בייזום תגובה חיסונית.

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

בניגוד לחלקיקים HIV-1 ללא סלולריים, תאי CD4 + T נגוע הם חשו ביעילות על ידי תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC). כתב יד זה מתאר שיטה שבה תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) או pDCs המבודד הם שיתוף תרבותיים עם HIV-1 תאי T נגועים כדי להעריך חישה מולדת על ידי pDCs כפי שהוערכו על ידי שחרורו של הסוג-אני IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

למדו כיצד למדוד את יכולת החדירה של זני חיידקים לתאי מארח באמצעות Staphylococcus aureus ותאי אנדותל אנושיים. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות.

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

גלה סרטונים נוספים