קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע את ריכוזי החומצות הגרעיניות והחלבונים באופן מדויק וניתן לשחזור באמצעות ספקטרופוטומטר לנפחים מזעריים. דבר זה מושג תחילה על ידי בחירת אורך המסלול המתאים לדגימה הנמדדת. השלב השני של ההליך הוא מדידת דגימת ביקורת (blank).

בשלב הבא, נמדוד את דגימת ה-DNA או החלבון. השלב האחרון של הפרוטוקול הוא שמירת הנתונים בפורמט PDF או CSV. התוצאה הסופית היא תוצאות בעלות הדירות גבוהה עבור DNA וחלבון.

ניתן לקבל כימות באופן מהיר ומדויק באמצעות שיטה זו. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה, מדויקת וניתנת לשחזור. כדי להתחיל בהליך לכימות DNA, הדליקו את הספקטרופוטומטר BIOS spec nano.

פתחו את תוכנת ה-BIOS spec nano משולחן העבודה של המחשב. לחצו על הלשונית simple nucleic acid D-S-D-N-A. התוכנה תבסס תקשורת עם המכשיר ותפעיל רצף אתחול.

פעולה זו מאששת כי המכשיר פועל בהתאם למפרטים. כעת, בחרו את אורך המסלול. השתמשו במכוון אורך המסלול.

שלוש אפשרויות זמינות עבור דגימות בנפח מיקרוליטר. ניתן להשתמש ב-0.2 millimeters או 0.7 millimeters. ועבור דגימות מהוללות, קיימת אפשרות להשתמש בקוביה בעלת אורך נתיב של five millimeter.

בהדגמה זו, נבחר ערך של 0.7 millimeters למדידת דגימה של two microliter. כל החישובים מבוססים על אורך המסלול שנבחר. בשלב הבא בתוכנה, לחצו על לשונית ה-setup ובחרו ב-auto wiping setup.

בחרו אחת עבור ניגוב אחד. לפני מדידת הדגימה, או בכל פעם שנבחר אורך נתיב חדש, נדרשת מדידת בלאנק. עבור אורך נתיב של 0.7 millimeter, טפטפו two microliters של מים או בופר על המעמד. לחצו על blank למדידת בלאנק.

החלון העליון יזוז כדי ליצור מגע עם טיפת הדגימה וניתן יהיה להבחין בהבזקי קסנון. עם סיום המדידה, המגב ינקה באופן אוטומטי את הדגימה. כעת ניתן למדוד את הדגימה.

חשוב להשתמש בתמיסת דגימה הומוגנית, שכן נוכחות של חלקיקים לא מומסים בדגימה תוביל לנתונים שאינם ניתנים לשחזור. כדי למנוע היווצרות בועות אוויר, יש לשאוב בזהירות 2 µL מהדגימה ולאחר מכן להעביר את הדגימה באופן אחיד מקצה הפ pipette אל הפדסטל.

לחצו על כפתור ההפעלה (start) במכשיר. כפי שקרה קודם, החלון העליון יזוז כדי ליצור מגע עם טיפת הדגימה, וניתן יהיה להבחין בהבזקי קסנון. כדי לקבוע את השחזוריות, חזרו על המדידה של אותה דגימה שלוש פעמים; כל הנתונים שנרשמו נשמרים אוטומטית כקובץ BUD. כדי לשמור כקובץ PDF או CSV, לחצו על save P-D-F-C-S-V.

ניתן לשמור את התוצאות גם כקובץ CSV באמצעות הבחירה המתאימה בלשונית השמירה. ניתן לבצע כימות חלבון באמצעות שיטת הבליעה ב-280 ננומטר. לצורך כימות חלבון, בחר בלשונית כימות החלבון.

הזינו את מקדם הניגוד epsilon 280 אם הוא ידוע; אם Epsilon 280 אינו ידוע, חשבו אותו באמצעות Epsilon 280 calc. בחרו ב-0.2 millimeters בסרגל הזז של אורך המסלול (path length) כדי למדוד דגימה של 3 µL. לאחר מכן, בתוכנה, לחצו על לשונית ה-setup ובחרו ב-auto wiping setup. בחרו ב-2 עבור שני ניגובים כדי למנוע שאריות דגימה (carryover) ולהבטיח קריאה מדויקת.

כדי לבצע כיול אפס (blank) לפיפט, טפטפו 3 µL של מים או בופר על המעמד, ולחצו על blank למדידת כיול האפס. לאחר מכן, טפטפו בזהירות 3 µL של דגימת חלבון על המעמד. ללא הכנסת בועות אוויר, לחצו על start בתוכנה או על כפתור ה-start במכשיר כדי להתחיל במדידת הדגימה.

חזרו על מדידת אותה דגימה שלוש פעמים כדי לקבוע את השחזור המוצג. להלן נתונים ממדידות של דגימה טיפוסית של DNA דו-גדילי. הנוסחה המשמשת לחישוב ריכוז ה-DNA היא: ריכוז הדגימה שווה ל-DF כפול הכמות של OD 260 פחות OD 320 כפול NACF, כאשר DF הוא מקדם דילול הדגימה ו-NACF הוא מקדם ריכוז חומצות גרעיניות.

מקדם ריכוז החומצה הגרעינית נקבע בהתאם לאנליט שנבחר. ריכוז החומצה הגרעינית המחושב ויחס ה-OD 2 62 80 מוצגים. טבלה זו מכילה תוצאות של בדיקות הדירות עבור כימות DNA.

יחד, הנתונים מראים תוצאות בעלות הדירות גבוהה, כפי שניתן לראות מהסטיית התקן היחסית הנמוכה של 0.26%. מוצגות כאן תוצאות מייצגות מניתוח ריכוז חלבון עבור BSA. ריכוז החלבון במיקרוגרם למיליליטר מבוסס על ערך ה-Epsilon 280. לבסוף, טבלה זו מציגה ניתוח הדירות של כימות החלבון.

סטיית התקן היחסית של 0.51% מעידה על כך ש-BIOS spec nano מודד od במדויק לא רק עבור DNA, אלא גם עבור חלבונים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לנתח דגימות מרובות בתוך דקה אחת.