Name: קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: למד כיצד לכמת DNA דגדושי וחלבונים במהירות ובדייקנות באמצעות הספקטרופוטומטר BioSpec-nano. שיטה זו מציעה תוצאות ברות-השגה גבוהה עם נפחי דגימה זעירים ומניעת זיהום בין דגימות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. נוהל quantitation DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך על המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת BioSpec ננו משולחן העבודה במחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכרטיסייה פשוט חומצה dsDNA גרעין (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוכנה יהיה ליצור תקשורת עם המכשיר ולהפעיל רצף האתחול. זה מוודא כי המכשיר מתפקד בהתאם למפרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 0.7 או 0.2 מ"מ על המחוון pathlength. זה בוחר את pathlength וכל החישובים מבוססים על pathlength שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא BioSpec ננו ההתקנה לחץ על הגדרת-Autowiping תוכנה. בחר 1 או 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 μL (0.7 מ"מ) H 2 O או חיץ על הכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ ריק או F6 למדידת ריק. בכל פעם pathlength חדשה נבחרה יש צורך להקליט ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 μL של המדגם על הכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התחל בתוכנה או ללחוץ על הכפתור להתחיל על המכשיר. החלון העליון מהלכים ליצור קשר עם רביב המדגם. מהבהב קסנון ניתן לצפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מדגם זהה 3 פעמים כדי לקבוע reproducibility. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הנתונים נרשם נשמר כקובץ. ניצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור כקובץ. Pdf או. קובץ CSV לחץ על שמור PDF / csv או F9. תוצאות ניתן גם לשמור כקובץ csv. באמצעות בחירה בלשונית המתאימה לשמור. </li></ol> 2. פרוטוקול quantitation חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר quantitation הכרטיסייה חלבון (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את e280 מקדם הכחדה, אם הוא ידוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם e280 אינו ידוע לחשב אותו באמצעות e280Calc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 0.7 או 0.2 מ"מ על המחוון pathlength. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על Setup-Autowiping ההתקנה. בחר 2 ומעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 3 μL (0.2 מ"מ) H 2 O או חיץ על הכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ ריק או F6 למדידת ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 3 μL מדגם חלבון על הכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התחל בתוכנה או ללחוץ על הכפתור להתחיל על המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מדגם זהה 3 פעמים כדי לקבוע reproducibility. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הנתונים נרשם נשמר כקובץ. ניצן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור כקובץ. Pdf או. קובץ CSV לחץ על שמור PDF / csv או F9. </li></ol> 3. נציג תוצאות: 1. תוצאות עבור quantitation DNA איור 3 מציג את נתוני מדידות על דגימת DNA גדילי כפול טיפוסי. ריכוז ו OD 260/280 יחס מחושב מוצגים גם. איור 4 מכיל מבחן reproducibility תוצאות quantitation DNA. הנתונים איורים 3 ו -4 תוצאות מראה ולייצר מאוד כפי שעולה סטיית תקן נמוכה יחסית של 0.26%. הערה 1: אי דיוק quantitation DNA יכול לנבוע נוכחות של רכיבים חיץ אשר עשוי לספוג באזור UV. זהו גם צורך להשתמש בפתרון מדגם הומוגני. ככל שכמות מדגם pipetted להיות רק 1-2 pipetting μL, נזהר כרכים מדויק ללא הקדמה של בועות בכל הנדרש. 2. תוצאות עבור quantitation חלבון איור 5 מייצג ריכוז חלבון ניתוח BSA. ריכוז מיקרוגרם / מ"ל ​​חלבון מבוססת על ערך e280. איור 6 מציג ניתוח שחזור. ברור מן סטיית התקן היחסית של 0.51% כי BioSpec ננו ריכוז אמצעים בדיוק - לא רק דנ"א אלא גם חלבונים. הערה 2: גורמים המשפיעים על ריכוז חלבון קביעת ריכוז מדויק של חלבון אפשרית כאשר יש תופעות מינימום מחוסר יציבות הנגרמת על ידי ה-pH, מאגרים, טמפרטורה או תוספים. חלבונים מטוהרים רוב עובר שלבים שונים של עיבוד, ולכן ייתכן כי החלבון עשוי להכיל חומרים פעילי שטח או תוספים אחרים שעשויים להפריע ליצירת טיפה. לקבלת דוגמיות כאלה, באמצעות 5 מ"מ pathlength תא קוורץ מומלץ מאוד. <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> 1. איור אנליטי מבחר חלון quantitation DNA גדילי כפול <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור אנליטי מבחר חלון quantitation ללא חלבון הנקרא <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. נציג נתונים עבור quantitation DNA <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. שחזור נתונים quantitation DNA <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. נציג נתונים עבור quantitation חלבון <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt='"איור'> איור 6. שחזור נתונים עבור quantitation חלבון

<ol><li>Aisubel, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAisubel%2C+F+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th edition, WILEY. (1999).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.</li>
</ol>

Suja Sukumaran, PhD הוא עובד של Shimadzu שעושה את המכשיר בהשתתפות במאמר זה.

BioSpec-nano תוכנן כדי לפתור את הבעיות הנוכחיות הטמון שיטות quantitation DNA, כגון תוצאות לא עקביות ועל עבודת כפיים מייגעת. מדידת כל לוקח רק 3 שניות, מה שמאפשר ביולוג מולקולרי מנוסה לנתח דגימות מרובות על 3-6 תוך דקה. תכונת מגב ייחודי לא רק משפרת את התפוקה של המדידה, היא גם מבטלת את הצורך בניקוי ידני של כנים, וכתוצאה מכך שריד זניח בין המדידות. יתר על כן, רק 2 בדיקות באמצעות מגבונים עבור דגימות DNA המכיל 1000 ng / μL, ציין שריד פחות מ 2 ng / μL. הזמינות של תא pathlength 5 מ&quot;מ מספק אפשרות לנתח חומצות גרעין לדלל דגימות חלבון, מרחיב את השימוש במכשיר זה עבור יישומים אחרים.

<table><tbody><tr><td>BioSpec-nano</td><td>Shimadzu Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA מטימוס של עגל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מסרום של בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש micro בנפח bio-spec ספקטרופוטומטר nano

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

גרעין quantitation נהלים חומצה יש מתקדמות באופן משמעותי בשלושת העשורים האחרונים. יותר ויותר, ביולוגים מולקולריים דורשים ניתוח בקנה אחד קטן בנפח של דגימות חומצות גרעין עבור הניסויים שלהם. BioSpec ננו מספק פתרון אפשרי לבעיות לא מדויק, לא לשחזור תוצאות, הטמון שיטות quantitation הנוכחית DNA, באמצעות האופטיקה המקצועית גלאי PDA רגיש. BioSpec ננו יש גם פונקציונליות אוטומטיות כזו הרכבה, מדידה, ניקוי נעשים על ידי המכשיר, ובכך למנוע השמה משעמם, חוזר על עצמו, וגם לא עקבית של אלמנט סיב אופטי ניקוי ידני. במחקר זה, הנתונים שהוצגו על כימות של דנ&quot;א וחלבונים, כמו גם על שחזור מדידה ודיוק. מגע מדגם אוטומטי לסריקה מהירה מאפשר מדידה תוך שלוש שניות, וכתוצאה מכך תפוקה מעולה. ניתוח הנתונים מבוצע באמצעות תכונות מובנות של התוכנה. הנוסחה המשמשת לחישוב ריכוז ה-DNA הוא: לדוגמא ריכוז = DF ° (OD260-OD320) · NACF (1) איפה DF = דילול מדגם גורם ו NACF = גורם גרעין ריכוז החומצה. גורם גרעין ריכוז חומצה מוגדר בהתאם אנליטי שנבחר 1. ריכוז תוצאות חלבון ניתן לבטא מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​או שומות / L ידי הזנת e280 וערכים משקל מולקולרי בהתאמה. כאשר ערכים שאריות של Tyr, TRP ו - ציסטאין (SS האג&quot;ח) מוזנים בכרטיסיה e280Calc, מקדם את הערכים הכחדה מחושבים e280 = 5,500 x (שאריות TRP) + 1490 x (שאריות Tyr) + 125 x (ציסטאין אס האג&quot;ח) . ערך e280 משמש תוכנה לחישוב ריכוז. בנוסף לקביעת ריכוז של חומצות גרעין וחלבונים, BioSpec ננו יכול לשמש ספקטרופוטומטר מיקרו נפח אולטרה עבור analytes רבים אחרים או ספקטרופוטומטר תקן באמצעות 5 pathlength תאים מ&quot;מ.

תקשורת זה מובאים נתונים על דיוק ועל שחזור של ספקטרופוטומטר UV-VIS BioSpec ננו עבור dsDNA ו quantitation חלבון. אפילו עם כמויות קטנות במיוחד (1 עד 2 ליטר), שחזור מצוין, בעוד פונקציה מנגב אוטומטי משפר את התפוקה ואת התוצאות שריד מינימלי תוצאות מדויקות יותר.

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

נהלי כימות של חומצות גרעיניות התקדמו באופן משמעותי בשלושת העשורים האחרונים. יותר ויותר ביולוגים מולקולריים דורשים עקביות...

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע את ריכוזי החומצות הגרעיניות והחלבונים באופן מדויק וניתן לשחזור באמצעות ספקטרופוטומטר לנפחים מזעריים. דבר זה מושג תחילה על ידי בחירת אורך המסלול המתאים לדגימה הנמדדת. השלב השני של ההליך הוא מדידת דגימת ביקורת (blank).בשלב הבא, נמדוד את דגימת ה-DNA או החלבון. השלב האחרון של הפרוטוקול הוא שמירת הנתונים בפורמט PDF או CSV. התוצאה הסופית היא תוצאות בעלות הדירות גבוהה עבור DNA וחלבון.ניתן לקבל כימות באופן מהיר ומדויק באמצעות שיטה זו. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה, מדויקת וניתנת לשחזור. כדי להתחיל בהליך לכימות DNA, הדליקו את הספקטרופוטומטר BIOS spec nano.פתחו את תוכנת ה-BIOS spec nano משולחן העבודה של המחשב. לחצו על הלשונית simple nucleic acid D-S-D-N-A. התוכנה תבסס תקשורת עם המכשיר ותפעיל רצף אתחול.פעולה זו מאששת כי המכשיר פועל בהתאם למפרטים. כעת, בחרו את אורך המסלול. השתמשו במכוון אורך המסלול.שלוש אפשרויות זמינות עבור דגימות בנפח מיקרוליטר. ניתן להשתמש ב-0.2 millimeters או 0.7 millimeters. ועבור דגימות מהוללות, קיימת אפשרות להשתמש בקוביה בעלת אורך נתיב של five millimeter.בהדגמה זו, נבחר ערך של 0.7 millimeters למדידת דגימה של two microliter. כל החישובים מבוססים על אורך המסלול שנבחר. בשלב הבא בתוכנה, לחצו על לשונית ה-setup ובחרו ב-auto wiping setup.בחרו אחת עבור ניגוב אחד. לפני מדידת הדגימה, או בכל פעם שנבחר אורך נתיב חדש, נדרשת מדידת בלאנק. עבור אורך נתיב של 0.7 millimeter, טפטפו two microliters של מים או בופר על המעמד. לחצו על blank למדידת בלאנק.החלון העליון יזוז כדי ליצור מגע עם טיפת הדגימה וניתן יהיה להבחין בהבזקי קסנון. עם סיום המדידה, המגב ינקה באופן אוטומטי את הדגימה. כעת ניתן למדוד את הדגימה.חשוב להשתמש בתמיסת דגימה הומוגנית, שכן נוכחות של חלקיקים לא מומסים בדגימה תוביל לנתונים שאינם ניתנים לשחזור. כדי למנוע היווצרות בועות אוויר, יש לשאוב בזהירות 2 µL מהדגימה ולאחר מכן להעביר את הדגימה באופן אחיד מקצה הפ pipette אל הפדסטל.לחצו על כפתור ההפעלה (start) במכשיר. כפי שקרה קודם, החלון העליון יזוז כדי ליצור מגע עם טיפת הדגימה, וניתן יהיה להבחין בהבזקי קסנון. כדי לקבוע את השחזוריות, חזרו על המדידה של אותה דגימה שלוש פעמים; כל הנתונים שנרשמו נשמרים אוטומטית כקובץ BUD. כדי לשמור כקובץ PDF או CSV, לחצו על save P-D-F-C-S-V.ניתן לשמור את התוצאות גם כקובץ CSV באמצעות הבחירה המתאימה בלשונית השמירה. ניתן לבצע כימות חלבון באמצעות שיטת הבליעה ב-280 ננומטר. לצורך כימות חלבון, בחר בלשונית כימות החלבון.הזינו את מקדם הניגוד epsilon 280 אם הוא ידוע; אם Epsilon 280 אינו ידוע, חשבו אותו באמצעות Epsilon 280 calc. בחרו ב-0.2 millimeters בסרגל הזז של אורך המסלול (path length) כדי למדוד דגימה של 3 µL. לאחר מכן, בתוכנה, לחצו על לשונית ה-setup ובחרו ב-auto wiping setup. בחרו ב-2 עבור שני ניגובים כדי למנוע שאריות דגימה (carryover) ולהבטיח קריאה מדויקת.כדי לבצע כיול אפס (blank) לפיפט, טפטפו 3 µL של מים או בופר על המעמד, ולחצו על blank למדידת כיול האפס. לאחר מכן, טפטפו בזהירות 3 µL של דגימת חלבון על המעמד. ללא הכנסת בועות אוויר, לחצו על start בתוכנה או על כפתור ה-start במכשיר כדי להתחיל במדידת הדגימה.חזרו על מדידת אותה דגימה שלוש פעמים כדי לקבוע את השחזור המוצג. להלן נתונים ממדידות של דגימה טיפוסית של DNA דו-גדילי. הנוסחה המשמשת לחישוב ריכוז ה-DNA היא: ריכוז הדגימה שווה ל-DF כפול הכמות של OD 260 פחות OD 320 כפול NACF, כאשר DF הוא מקדם דילול הדגימה ו-NACF הוא מקדם ריכוז חומצות גרעיניות.מקדם ריכוז החומצה הגרעינית נקבע בהתאם לאנליט שנבחר. ריכוז החומצה הגרעינית המחושב ויחס ה-OD 2 62 80 מוצגים. טבלה זו מכילה תוצאות של בדיקות הדירות עבור כימות DNA.יחד, הנתונים מראים תוצאות בעלות הדירות גבוהה, כפי שניתן לראות מהסטיית התקן היחסית הנמוכה של 0.26%. מוצגות כאן תוצאות מייצגות מניתוח ריכוז חלבון עבור BSA. ריכוז החלבון במיקרוגרם למיליליטר מבוסס על ערך ה-Epsilon 280. לבסוף, טבלה זו מציגה ניתוח הדירות של כימות החלבון.סטיית התקן היחסית של 0.51% מעידה על כך ש-BIOS spec nano מודד od במדויק לא רק עבור DNA, אלא גם עבור חלבונים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לנתח דגימות מרובות בתוך דקה אחת.

concentration-determination-nucleic-acids-proteins-using-micro-volume

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דגימות Microvolume הם לכמת ידי מערכת ספקטרופוטומטר המשתמשת מתח הפנים הטבעי לשמור דגימות ללא שימוש cuvettes או נימים. טווח דינמי של ריכוזי חלבון מהירות שבה הם יכולים להימדד הם גדל מאוד בשיטה זו.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

ספקטרומטריית מסה הוכיחה להיות כלי רב ערך עבור ניתוח מערכות חלבון גדול. שיטה זו מאפשרת תובנות אדריכלות, הרכב stoichiometry הכוללת של למקטע רב מכלולים. כאן, אנו לתאר, שלב אחר שלב, כיצד לבצע ניתוח מבניות ספקטרומטריית מסה, ולאפיין מבנים macromolecular.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

הפגנה של כימות dsDNA באמצעות מולקולרית בדיקות PicoGreen לצבוע Hitachi ו-F-7000 ספקטרופוטומטר Fluorescence מצויד אביזר microplate הקורא.

כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי

השימוש במערכות NanoDrop microvolume כחלופות מעשי ויעיל המסורתית מתודולוגיה חומצות גרעין quantitation מתוארת באמצעות הדגמה של שני פרוטוקולים microvolume quantitation חומצת גרעין.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

פרוטוקול לניתוח nanoparticle מעקב (נ.ת. ע) והזרימה cytometry תפוקה גבוהה להעריך חלקיקים פולימריים גן משלוח מתואר. נת"ע מנוצל כדי לאפיין את התפלגות גודל חלקיקי nanoparticle והפצת החלקיקים לפלסמיד. cytometry זרימת תפוקה גבוהה מאפשר הערכת יעילות transfection כמוני לספרייה של biomaterials מסירת הגן.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ"א, דנ"א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.

מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular

בדיקות אופטיות מבוססות ננו-חלקיקים תוכננו ככלי לזיהוי אנטיגנים באמצעות ספקטרוסקופיה של Raman ו-UV-Vis. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת בדיקות כאלה לבדיקה אימונולוגית של ספקטרוסקופיה UV-Vis/Raman באופן שישלב יכולות ריבוב עתידיות.

בודה UV-Vis ראמאן ספקטרוסקופיה פלטפורמת Immunoassay

פולימרים semiflexible להציג תכונות מכניות ייחודי המוחלות בהרחבה על ידי מערכות החיים. עם זאת, מחקרים שיטתיים על biopolymers מוגבלות מאז מאפיינים כגון הפולימר קשיחות אינם נגישים. כתב יד זה מתאר איך מגבלה זו הוא מצויין לתכנות צינוריות דנ א, הפעלת ניסיוני מחקרים על ההשפעה של פילמנט קשיחות.

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

הפרוטוקול המתואר כאן נועד למדוד את הקוטר ההידרודינמי של חלקיקים כדוריים, ליתר דיוק חלקיקי זהב, במדיה מימית באמצעות ניתוח מעקב חלקיקים (NTA). האחרון כרוך במעקב אחר תנועת החלקיקים עקב תנועה בראונית ויישום משוואת סטוקס-איינשטיין כדי להשיג את הקוטר ההידרודינמי.

ניתוח מעקב חלקיקים של חלקיקי זהב במדיה מימית באמצעות השוואה בין מעבדות

בזאת הוא תיאר את ההליך מיושם קבוצת מבניים ותפקודיים ביולוגיה קאפרי ממברנה להגדיר באופן ידני ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה ב mesophases lipidic.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

למד כיצד לכמת DNA דגדושי וחלבונים במהירות ובדייקנות באמצעות הספקטרופוטומטר BioSpec-nano. שיטה זו מציעה תוצאות ברות-השגה גבוהה עם נפחי דגימה זעירים ומניעת זיהום בין דגימות.

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

גלה סרטונים נוספים