קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano
February 17th, 2011
תקשורת זה מובאים נתונים על דיוק ועל שחזור של ספקטרופוטומטר UV-VIS BioSpec ננו עבור dsDNA ו quantitation חלבון. אפילו עם כמויות קטנות במיוחד (1 עד 2 ליטר), שחזור מצוין, בעוד פונקציה מנגב אוטומטי משפר את התפוקה ואת התוצאות שריד מינימלי תוצאות מדויקות יותר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את ריכוזי חומצות הגרעין והחלבונים בצורה מדויקת וניתנת לשחזור באמצעות ספקטרופוטומטר נפח מיקרו. זה מושג על ידי בחירת אורך הנתיב המתאים לדגימה למדידה. השלב השני בהליך הוא מדידת ריק.
לאחר מכן, נמדדת דגימת ה-DNA או החלבון. השלב האחרון של ההליך הוא שמירת הנתונים בפורמט PDF או CSV. בסופו של דבר, תוצאות ניתנות לשחזור עבור DNA וחלבון.
ניתן להשיג כימות במהירות ובדייקנות בשיטה זו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה, מדויקת וניתנת לשחזור. כדי להתחיל בהליך לכימות DNA, הפעל את ספקטרופוטומטר הננו של מפרט ה-BIOS.
פתח את תוכנת ה-BIOS spec nano משולחן העבודה של המחשב. לחץ על הכרטיסייה הפשוטה של חומצת הגרעין D-S-D-N-A. התוכנה תיצור תקשורת עם המכשיר ותריץ רצף אתחול.
זה מוודא שהמכשיר פועל בהתאם למפרט. לאחר מכן, בחר את אורך הנתיב. במחוון אורך הנתיב.
שלוש אפשרויות זמינות לדגימות נפח מיקרוליטר. ניתן להשתמש ב-0.2 מילימטרים או 0.7 מילימטרים. ולדגימות מדוללות, יש אפשרות להשתמש באורך נתיב של חמישה מילימטרים.
בהדגמה זו נבחר 0.7 מילימטרים למדידת דגימה של שני מיקרוליטר. כל החישובים מבוססים על אורך הנתיב שנבחר. לאחר מכן בתוכנה, לחץ על לשונית ההגדרה ובחר הגדרת ניגוב אוטומטית.
בחר אחד עבור ניגוב אחד. לפני מדידת הדגימה, או בכל פעם שנבחר אורך נתיב חדש, נדרשת מדידה ריקה עבור פיפטה באורך נתיב של 0.7 מילימטר שני מיקרוליטר מים או חיץ על הכן. לחץ על ריק למדידה ריקה.
החלון העליון ינוע כדי ליצור מגע עם טיפת הדגימה וניתן לצפות בהבזקי קסנון. לאחר השלמת המדידה, המגב ימחק אוטומטית את הדגימה. כעת ניתן למדוד את המדגם.
חשוב להשתמש בתמיסת דגימה הומוגנית כנוכחות של חלקיקים לא מומסים. חלקיק דגימה יביא לנתונים בלתי ניתנים לשחזור. כדי להימנע מהכנסת בועות אוויר, שאפו בזהירות שני מיקרוליטר מהדגימה ולאחר מכן פיפטה החוצה את הדגימה בצורה אחידה מקצה הפיפטה אל הכן.
לחץ על כפתור ההתחלה במכשיר. כמו קודם, החלון העליון ינוע כדי ליצור קשר עם טיפת הדגימה וניתן לצפות בהבזקי קסנון כדי לקבוע יכולת שחזור, מדידה חוזרת של אותה דגימה שלוש פעמים, כל הנתונים שנרשמו נשמרים אוטומטית כקובץ BUD. לשמירה כקובץ PDF או CCSV, לחצו על 'שמור P-D-F-C-S-V'.
ניתן לשמור את התוצאות גם כקובץ CSV על ידי שימוש בבחירה המתאימה בלשונית השמירה. ניתן לבצע כימות חלבון בשיטת הספיגה השנייה 80. לכימות חלבון, בחר בכרטיסייה כימות חלבון.
הזן את מקדם ההכחדה אפסילון 2 80 אם ידוע, אם אפסילון 2 80 אינו ידוע, חשב אותו באמצעות אפסילון 2 80 calc בחר 0.2 מילימטר במחוון אורך הנתיב כדי למדוד דגימה של שלושה מיקרוליטר. לאחר מכן בתוכנה, לחץ על לשונית ההגדרה ובחר הגדרת ניגוב אוטומטית. בחר שניים לשני מגבונים כדי למנוע העברת דגימה וכדי להבטיח קריאה מדויקת.
כדי למדוד פיפטה ריקה שלושה מיקרוליטר מים או חיץ על הכן, לחץ על ריק למדידה ריקה. לאחר מכן, פיפטה בזהירות שלושה מיקרוליטרים של דגימת חלבון על הכן. מבלי להכניס בועות אוויר כדי להתחיל למדוד את הדגימה, לחץ על התחל בתוכנה או לחץ על כפתור ההתחלה במכשיר.
חזור על המדידה של אותה דגימה שלוש פעמים כדי לקבוע את יכולת השחזור המוצגת. להלן נתונים ממדידות על דגימת DNA דו-גדילית טיפוסית. הנוסחה המשמשת לחישוב ריכוז ה-DNA היא שריכוז הדגימה שווה ל-DF כפול הכמות של OD שתיים 60 פחות OD שלוש 20 פעמים NACF, כאשר DF שווה לגורם דילול הדגימה ו-NACF שווה לגורם ריכוז חומצות גרעין.
גורם ריכוז חומצות הגרעין נקבע בהתאם לאנליט שנבחר. מצוין ריכוז חומצות הגרעין המחושב ויחס OD 2 62 80. טבלה זו מכילה תוצאות בדיקת שחזור לכימות DNA.
יחד, הנתונים מראים תוצאות הניתנות לשחזור גבוה, כפי שניתן לראות מסטיית התקן היחסית הנמוכה של 0.26%, תוצאות מייצגות מניתוח ריכוז חלבון עבור BSA מוצגות כאן. ריכוז המיקרוגרם למיליליטר חלבון מבוסס על ערך אפסילון 2 80. לבסוף, טבלה זו מציגה ניתוח שחזור של כימות החלבון.
סטיית התקן היחסית של 0.51% מצביעה על כך שה-BIOS spec nano מודד במדויק לא רק עבור DNA, אלא גם עבור חלבונים. לאחר השליטה, ניתן לנתח מספר דגימות בדקה אחת.
סקירה
מחקר זה מעריך את הדיוק והשחזור של ספקטרופוטומטר BioSpec-nano UV-VIS להערכת כמויות של dsDNA וחלבונים. השיטה מפגינה שחזור מעולה אפילו עם נפחי דגימות זעירים, ומגדילה את התפוקה עם מעבר מינימלי.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביוכימיה
- כימיה אנליטית
- ביוטכנולוגיה
רקע
- כימות מדויק של חומצות גרעין וחלבונים הוא קריטי במחקר ביולוגי.
- ספקטרופוטומטריה של נפחים זעירים מאפשרת ניתוח עם דרישות דגימות מינימליות.
- פונקציות אוטומטיות יכולות לשפר את יעילות ודיוק המדידה.
- שחזור הוא חיוני לתוצאות ניסוייות אמינות.
מטרת המחקר
- להעריך את הביצועים של ספקטרופוטומטר BioSpec-nano להערכת כמויות של חומצות גרעין וחלבונים.
- לבסס פרוטוקול למדידות מדויקות באמצעות נפחי דגימות קטנים.
- להדגים את אמינות התוצאות באמצעות מדידות חוזרות.
שיטות ששימשו
- בחירת אורך נתיב מתאים למדידת הדגימה.
- מדידה ריקה לפני ניתוח הדגימה.
- ניקוי אוטומטי כדי למנוע מעבר בין דגימות.
- שמירת נתונים בפורמטים PDF או CSV לניתוח נוסף.
תוצאות עיקריות
- תוצאות שיחזור גבוהות להערכת כמויות DNA עם סטיית תקן יחסית של 0.26%.
- הערכת כמויות חלבונים גם היא הראתה דיוק גבוה עם סטיית תקן יחסית של 0.51%.
- ניתן להשיג מדידות מהירות ומדויקות עם ה-BioSpec-nano.
- ניתן לנתח דגימות מרובות במהירות, ובכך לשפר את התפוקה.
מסקנות
- ספקטרופוטומטר BioSpec-nano מספק כימות אמין הן עבור dsDNA והן חלבונים.
- פונקציות אוטומטיות משפרות משמעותית את יעילות המדידה.
- שיטה זו מתאימה ליישומי תפוקה גבוהה במחקר ביולוגי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Accurate and reproducible quantification of nucleic acids and proteins is essential for target validation and assay development in early drug discovery. The BioSpec-nano micro-volume spectrophotometer enables high-throughput, low-sample-consumption measurements with automated sample handling, reducing variability and improving data reliability for lead identification workflows. Its rapid measurement cycle and low relative standard deviation support predictive confidence in downstream screening and translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise quantification of nucleic acid and protein samples to support target expression analysis and pathway interrogation.
- Operational Value: Reduces sample consumption and manual handling steps, increasing throughput for hypothesis testing in discovery biology.
- Predictive Value: Low relative standard deviation (0.26% for DNA, 0.51% for protein) enhances confidence in quantitative data used for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides reproducible absorbance measurements (OD260-OD320 for DNA, OD280 for protein) suitable for assay standardization and reagent qualification.
- Operational Value: Automated wiping and blanking minimize carryover and ensure measurement consistency across plates or batches.
- Scalability: Three-second measurement time enables rapid screening of sample libraries or fractionation outputs.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker quantification and pharmacokinetic sample analysis where low-volume, high-precision detection is required.
- Mechanistic De-risking: Accurate protein concentration data (via ε280 calculation from Trp, Tyr, Cys-S-S residues) enables correct dosing in functional assays.
- Workflow Integration: Outputs in PDF/CSV format facilitate data tracking and cross-functional sharing between discovery and preclinical teams.
Pipeline & Workflow Integration
The BioSpec-nano fits within the discovery continuum from initial target validation through assay development and into preclinical sample analysis, particularly where sample conservation and measurement reproducibility are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven quantification of nucleic acids (e.g., gene expression constructs) and proteins (e.g., purified targets, antibodies) for target validation.
- Screening: Enables QC of sample inputs and reaction outputs in biochemical or cell-based assays with minimal volume requirements.
- Analytics: Delivers quantitative OD-based readouts with automated pathlength correction and extinction coefficient calculation for proteins.
- Translational Research: Compatible with low-volume preclinical samples (e.g., plasma, tissue lysates) requiring accurate concentration normalization.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared core lab resource for standardized quantitation across multiple projects and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves data quality and reproducibility in nucleic acid and protein quantitation, reducing false negatives/positives in early screening.
- Operational Value: Automation of sample contact, measurement, and cleaning reduces user variability and increases lab efficiency.
- Strategic Value: Enables faster iteration in lead optimization by providing reliable quantification for structure-activity relationship (SAR) studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted resource allocation by delivering trustworthy quantitative data for target prioritization.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with spectrophotometer principles and pathlength selection based on sample concentration.
- Needs access to a PC with BioSpec-nano software and periodic maintenance of optical surfaces.
- Benefits from standardized SOPs for blanking, wiping, and sample application to ensure cross-user consistency.
- Adaptable to various sample types (DNA, protein, other analytes) via software configuration and pathlength adjustment.
- Limited to absorbance-based quantification; not suitable for fluorescent or luminescent assays without additional instrumentation.
