Name: טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: חקור שינויים בלוקליזציה תת-תאית של חלבונים בתגובה לאיתות גורמי צמיחה ב-Xenopus. הפרוטוקול משתמש בהזרקת RNA לשלב מוקדם של עוברים, חתכי קריו וצביעת אימונופלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר במעבדה סוקול בחסות Institues הלאומי לבריאות.

1. הפריה במבחנה של Xenopus ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ביצים צפרדעים נקבה כי הוזרקו גונדוטרופין כוריוני אנושי (400 יחידה / צפרדע) 12 שעות לפני הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ביצים לתוך כמות קטנה (0.5-1 מ"ל) של פתרון 1 x שונה של מארק Ringer (MMR) 10 כדי להפרות את הביצים אותם במבחנה עם חתיכה קטנה של testis גזור. אחרי 2-3 דקות, להוסיף 0.1 x MMR כדי לכסות את פני השטח של כל הביצים. ב 20 דקות, מעיל ביצה וריבה יוסר על ידי ציסטאין 3% - HCL (במונחי pH 8 עם סודיום הידרוקסיד). ביצים נשטפים עם 0.1 x MMR שלוש פעמים נשאר חממה קר (13 מעלות צלזיוס) זריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביציות מופרות מותר לפתח לשלב 2-4 תאים. עבור זריקות, העוברים מועברים לתוך פתרון המכיל Ficoll 3%, 0.5 x MMR. </li></ol> 2. RNA Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNAs מסונתזים מתבניות ה-DNA לינארית באמצעות mMessage mMachine Kit (Ambion) ו מדולל במים RNase ללא בריכוז המניות של 0.1-1 מיקרוגרם / μl. מינון אופטימאלי של RNAs זריקות נקבעים בניסויים הטייס. RNAs עבור Diversin-RFP, סמן קרום GFP-CAAX ו מסולסלת 8 משמשים 0.1-1 ננוגרם לכל זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטי הזרקה מוכנים עם חולץ מחט מתוך נימי ולאחר מכן עם מטחנת מחט. לפני זריקה, מחט כל מכויל עם מים כדי להוציא 10 nl של הזרקת נוזל לכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זריקות, עוברים מונחות על צלחת פלסטיק לתוך אגל גדול של Ficoll 3%, 0.5 x MMR. אחת microliter של פתרון RNA הוא נשאב לתוך מחט מזרק עם Narishige microinjector. 10 nl של רנ"א מוזרק בלסטומרים חיה של 8 תאים העוברים 2-3 פעמים. עוברים מוזרק מועברים לתוך באר של צלחת 12 הבאר. </li></ol> 3. הכנת Ectodermal Explants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עוברים מוזרק להגיע בשלב מוקדם gastrula, הם מועברים לתוך פתרון MMR 0.6 x בצלחת פלסטיק 3 ס"מ מצופה agarose 1%. קרום Vitelline מוסרת באופן ידני עם זוג מלקחיים. Explants Ectodermal הם נכרת מן העוברים באמצעות מחט טונגסטן hairloop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explants Ectodermal מועברים לתוך בקבוקון זכוכית קבוע עם פורמלדהיד 3.7% ב פוספט בופר סליין (PBS) במשך 30 דקות. Explants קבוע נשטפים עם PBS שלוש פעמים (10 דקות כל אחד). DAPI נכלל לתוך לשטוף את כתם שלישי גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explants הם רכובים על זכוכית שקופית. שתי רצועות של נייר דבק מחוברים לשקופית ואת explants ממוקמים בין שתי רצועות. מאז את המשטח החיצוני של explants הוא פיגמנט, הצד הפנימי של explants צריך להתמודד עם מטרה מיקרוסקופ. הוסף 2-3 טיפות 20 μl של הפתרון הרכבה (70% גליצרול ב PBS כולל 25 מ"ג / מ"ל DABCO, נגד דהייה מגיב) 11. שים coverslip על העליונה. </li></ol> 4. הדמיה של Explants תחת מיקרוסקופ פלורסנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות הן מתחת למיקרוסקופ Axioplan Zeiss ניאון עם מסננים מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות נלקחים עם הקובץ המצורף Apotome לדמיין מטוס ספציפיים explants עצמאית מספר. </li></ol> 5. Cryosectioning Cryosectioning היא דרך חלופית כדי להמחיש את ההפצה של חלבוני ניאון בתא רלוונטי יותר עבור immunostaining. בשלב 10, עוברים קבועים עבור 1-2 שעות עם מיצב של דנט (20% DMSO, מתנול 80%), שטפתי עם PBS, ו 15% מוטבע פתרון gelatin/15% סוכרוז דגים 11. עוברים מוקפאים במהירות מוטבע על קרח יבש cryosections נוצרות על לייקה cryostat. חתכים יכלול תאים ectodermal שיורשים RNAs מוזרק ומוצרי חלבון המתורגם שלהם. סעיפים לשמור הקרינה וניתן immunostained עם נוגדנים ספציפיים ואז שכותרתו עם נוגדנים משני מצומדות עם פלואורסצנטי. גרעינים מגואלות DAPI. התקשורת הרכבה זהים כפי שתואר לעיל. הדמיה יכול להתבצע כפי שתואר לעיל. 6. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2700/2700fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. קולטן מסולסלת המתגייסים Diversin על קרום התא. תאים האאקטודרם להביע 8 מסולסלת (Xfz8) ו-RFP דיב RNAs לחשוף דיב-RFP על קרום התא, במקום centrosome (כפי שעולה מכתים שיתוף g-טובולין). תכנית הניסוי היא בראש; טיפוסי חתך מוצג.

<ol><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+induction+---+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic induction --- molecular aspects.</a> Development. 99, 285-306 (1987).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Principles+of+Developmental+Genetics%22">Principles of Developmental Genetics</a>. Moody, S. A. , Academic Press. (2007).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li>
<li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li>
<li>Gordon, M. D., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling%3A+multiple+pathways%2C+multiple+receptors%2C+and+multiple+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors.</a> J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).</li>
<li>Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ankyrin+repeat+protein+Diversin+recruits+Casein+kinase+Iepsilon+to+the+beta-catenin+degradation+complex+and+acts+in+both+canonical+Wnt+and+Wnt%2FJNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling.</a> Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).</li>
<li>Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversin+regulates+heart+formation+and+gastrulation+movements+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).</li>
<li>Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomal+localization+of+Diversin+and+its+relevance+to+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling.</a> J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).</li>
<li>Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Xenopus+Frizzled+8+in+dorsal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development.</a> Mech Dev. 74, 145-157 (1998).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30, 675-686 (1982).</li>
<li>Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+is+required+for+Dishevelled+function+in+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling.</a> J Biol. 4, 3-3 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השתמשנו בפרוטוקול לעיל כדי לאפיין את לוקליזציה subcellular של Diversin. ב explants קוטב חיה, Diversin-RFP התגלתה ליד הגרעין colocalized עם טובולין-g, סמן centrosomal, ב cryosections (איור 1). לאחר לוקליזציה subcellular של חלבון מזוהה, בונה המחיקה יכול להיווצר להקים אילו תחומים החלבון הכרחי ומספיק לוקליזציה subcellular. בגישה זו, התחומים לוקליזציה centrosomal של Diversin שמופו לאמצע וב-carboxy מסוף תחומים של החלבון, המכיל גם מוטיב סליל מפותל-8. <p class="jove_content...

טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב xenopus האאקטודרם בתגובה איתות wnt

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

הקוטביות Cell הוא מאפיין בסיסי של התאים האיקריוטים כי מוסדר באופן דינאמי במהלך ההתפתחות העוברית 1, 2 על ידי גורמים פנימיים וחיצוניים כאחד. אחד במעברי האותות המעורבים תקנה זו הוא מסלול ה-Wnt, אשר משמש פעמים רבות במהלך embryogenesis ו קריטי עבור מחלות אנושיות 3, 4, 5. רכיבים מולקולריים מרובות של מסלול זה מתואמת להסדיר איתות בצורה מרחבית מוגבלת, אבל המנגנונים אינם מובנים במלואם. Xenopus תאים עובריים אפיתל היא מערכת מצוינת ללמוד לוקליזציה subcellular של איתות חלבונים שונים. חלבונים היתוך פלורסנט באים לידי ביטוי על ידי עוברי Xenopus microinjection RNA, explants ectodermal מוכנים ולוקליזציה חלבון מוערך על ידי epifluorescence. בפרוטוקול זה ניסיוני אנו מתארים כיצד לוקליזציה subcellular של Diversin, חלבון cytoplasmic כי היה מעורב איתות הקוטביות בתא נחישות 6, 7 הוא דמיינו בתאים Xenopus ectodermal ללמוד התמרה האות Wnt 8. Coexpression של ליגנד Wnt או קולטן מסולסלת משנה את חלוקת Diversin התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי אדום, RFP, ומגייסת אותו קרום התא באופן מקוטב 8, 9. זה פרוטוקול לשעבר vivo אמור להיות תוספת מועילה במבחנה של בתאי יונקים בתרבית, שבו השליטה במרחב של איתות שונה מזו של רקמת שלם הרבה יותר קשה לנתח.

האאקטודרם Xenopus עובריים הפך מודל אטרקטיבי עבור מחקרים של הקוטביות בתא. Assay מתואר, שבה חלוקת subcellular של חלבוני ניאון נבחנת בתאים האאקטודרם. פרוטוקול זה יעזור כתובת לשאלות הקשורות שליטה מרחבית של איתות.

טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt

קוטביות תאים היא תכונה בסיסית של תאי אוקריוטים, המוסדרת באופן דינמי על ידי גורמים פנימיים וחיצוניים במהלך התפתחות העובר...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון שינויים במיקום התת-תאי של חלבונים בעקבות איתות של גורמי גדילה. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקה של RNAs המקודדים עבור RFP ומרקבל האיתות FRIZZLED 8 לתוך בלאסטומרים של עוברים מוקדמים של xenopus. לאחר מכן, מוכנים נתחים של עור באמצעות אלקטרופורזה ו/או נתחים קריוגניים של העוברים, ואלו נצבעים בשיטת אימונו-סטינינג.לבסוף, התאים שעברו צביעה אימונוהיסטוכימית נדגמים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כיצד לוקליזציה סוב-צלולית של חלבון ספציפי תלויה במסלולי איתות עובריים. כדוגמה, אנו מדגימים כי diverse מגויס מהצנטרוסומה לממברנת התא על ידי הקולטן FRIZZLED eight.שיטה זו מאפשרת לחוקרים לוויזואליזציה של לוקליזציה סוב-צלולית של חלבוני איתות in vivo באמצעות עוברים של xenopus. דבר זה עשוי לסייע במתן מענה לשאלות יסודיות בביולוגיה של התפתחות וביולוגיה של התא, כגון מחקרים על ויסות מרחבי של איתות ומנגנוני תעדוף תאים. כדי להתחיל בתהליך של הפריה חוץ גופית, השג ביצי מצפרניות שזוהרו בהן human chorionic gonadotropin.12 שעות לפני הניסוי, הוסיפו 0.5 עד מיליליטר אחד של תמיסת Marx modified ringer בריכוז 1X על הביצים והפריו אותן in vitro באמצעות חתיכה קטנה של אשך שבוצעה בה נתיחה. לאחר שתי עד שלוש דקות, הנמיכו את ריכוז המלח באמצעות 0.1 XMMR כדי לה

polarized-translocation-fluorescent-proteins-xenopus-ectoderm

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מיפוי גנטי הגורל ועין מתנהלת (GIFM) סימני עקבות תאים עם שליטה במרחב ובזמן...

גישה מעשית מיפוי גנטי ועין מתנהלת הגורל: מדריך חזותי כדי מארק עקוב אחר תאים In vivo</em

אנו מתארים כאן את השימוש בגרסת חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש pH, pHluorin, כדי לחקור את הדינמיקה המרחבית-זמנית של קולטני הדרכה אקסון סחר על פני התא. הקולטן pHluorin מתויג מתבטא הן בתרבות התא in vivo, באמצעות electroporation של העובר אפרוח.

שימוש pHluorin כדי להעריך את הדינמיקה של קולטני הדרכה אקסון בתרבות התא בעובר אפרוח

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo  ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

אנו מציגים transgenesis חולף מציאת גן ב intestinalis Ciona, קבוצת אחות chordate לבעלי חוליות, תוך שימוש בטכניקות microinjection ו electroporation. שיטות כאלה להקל גנומיקה תפקודית חסר חוליות הפשוטות הזה כולל מאפיינים בסיסיים של בעלי חוליות, כולל notochord ו epithelia ראש חושים ועל orthologs הרב של הגנים הקשורים למחלות אנושיות.

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em&gt; ב Vivo</em&gt; מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה optogenetic כדי לווסת מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK) פעילות במהלך התמיינות תאים והתפתחות עובריים Xenopus . שיטה זו מאפשרת הפעלה הפיכה של המסלול איתות MAPK בתרבית תאים יונקים ועל אורגניזמים חיים תאיים, כמו עוברי Xenopus , עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון כסמן ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.

גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של...

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

כימות של גדיל הדנ"א הכפול פסים באמצעות היווצרות γH2AX כסמן המולקולרית הפכה כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור כימות γH2AX מוקדים לאחר חשיפה לקרינה של תאים.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

חקור שינויים בלוקליזציה תת-תאית של חלבונים בתגובה לאיתות גורמי צמיחה ב-Xenopus. הפרוטוקול משתמש בהזרקת RNA לשלב מוקדם של עוברים, חתכי קריו וצביעת אימונופלואורסצנציה.

טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt

גלה סרטונים נוספים