טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt
26 במאי 2011
האאקטודרם Xenopus עובריים הפך מודל אטרקטיבי עבור מחקרים של הקוטביות בתא. Assay מתואר, שבה חלוקת subcellular של חלבוני ניאון נבחנת בתאים האאקטודרם. פרוטוקול זה יעזור כתובת לשאלות הקשורות שליטה מרחבית של איתות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון שינויים במיקום התת-תאי של חלבונים בעקבות איתות של גורמי גדילה. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקה של RNAs המקודדים עבור RFP ומרקבל האיתות FRIZZLED 8 לתוך בלאסטומרים של עוברים מוקדמים של xenopus. לאחר מכן, מוכנים נתחים של עור באמצעות אלקטרופורזה ו/או נתחים קריוגניים של העוברים, ואלו נצבעים בשיטת אימונו-סטינינג.
לבסוף, התאים שעברו צביעה אימונוהיסטוכימית נדגמים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כיצד לוקליזציה סוב-צלולית של חלבון ספציפי תלויה במסלולי איתות עובריים. כדוגמה, אנו מדגימים כי diverse מגויס מהצנטרוסומה לממברנת התא על ידי הקולטן FRIZZLED eight.
שיטה זו מאפשרת לחוקרים לוויזואליזציה של לוקליזציה סוב-צלולית של חלבוני איתות in vivo באמצעות עוברים של xenopus. דבר זה עשוי לסייע במתן מענה לשאלות יסודיות בביולוגיה של התפתחות וביולוגיה של התא, כגון מחקרים על ויסות מרחבי של איתות ומנגנוני תעדוף תאים. כדי להתחיל בתהליך של הפריה חוץ גופית, השג ביצי מצפרניות שזוהרו בהן human chorionic gonadotropin.
12 שעות לפני הניסוי, הוסיפו 0.5 עד מיליליטר אחד של תמיסת Marx modified ringer בריכוז 1X על הביצים והפריו אותן in vitro באמצעות חתיכה קטנה של אשך שבוצעה בה נתיחה. לאחר שתי עד שלוש דקות, הנמיכו את ריכוז המלח באמצעות 0.1 XMMR כדי להפעיל את ניידות התבליטים. דגרו למשך 20 דקות.
עם ההפריה, הביציות מכוונות את הקטבים האנימליים כלפי מעלה. הסיר את מעטפת הג'לי של הביצית על ידי החלפת תמיסת ה-MMR בתמיסת cysteine בריכוז 3% במים למשך חמש דקות. שטוף את הביציות שלוש פעמים ב-0.1 XMMR.
הדגיר בטמפרטורה של 13 °C עד לשלב של שני עד ארבעה תאים. לאחר מכן, העבר את העוברים ל-3% fi. Call ב-0.5 XMMR לצורך מיקרו-הזרקה.
סנתזו RNAs מתבניות DNA ליניאריות באמצעות ערכת M message M machine ודללו עם מים נקיים מ-RNAs לריכוז של 0.1 עד 1 µg/µL. עבור RFP, סמן הממברנה GFP CX ו-FRIZZLED 8, השתמשו ב-0.1 עד 1 ng להזרקה. הכינו מחטי הזרקה מצינורות קפילריים באמצעות מושך מחטים (needle pull) וגורס מחטים (needle grinder) לפני ההזרקה.
כייל כל מחט באמצעות מים כך שתשריץ 10 ליטרים של נוזל לכל הזרקה עבור ההזרקות. הנח עוברים על גבי צלחת פלסטיק בתוך טיפה גדולה של 0.5 XMMR בריכוז 3%fial. שאב מיקרוליטר אחד של תמיסת RNA לתוך מחט הזרקה באמצעות מיקרו-מזרק shige צר.
הזריקו 10 nanoliters של RNA לכל אחד משני הבלסטומרים של עוברים בעלי שני תאים. העבירו את העוברים המוזרקים לבאר בלוחית בעלת 12 בארות והדגירו בטמפרטורה של 13 °C עד שיגיעו לשלב הגסטרולציה המוקדם.
העבירו את העוברים בשלב הגסטולציה לתמיסת 0.6 XMMR בצלחת פלסטיק של שישה סנטימטרים המצופה ב-1% aeros. הסירו ידנית את קרומי הוויטל (vitel membrane) באמצעות פינצטה. לאחר מכן, השתמשו במחט tsin ובלולאת שיער כדי להוציא רסיסי רקמה (explants) מהאקטודרמה של העוברים.
קבע אותם ב-3.7% formaldehyde ב-PBS למשך 30 דקות. שטוף את ה-X explan שלוש פעמים, 10 דקות בכל פעם, ב-PBS. לצביעת הגרעינים, הוסף davi לשטיפה השלישית.
בשלב הבא, קבעו את ה-X explan על גבי סרטית זכוכית על ידי הצבתם בין שני רצועות של סרט דביק (scotch tape), כאשר הצד הפנימי הבלתי-פיגמנטי של ה-X explan פונה לעבר העדשה. הוסיפו שתיים עד שלוש טיפות של 20 µL מתמיס הקיבוע. הניחו לביס (cover slip) מעל.
ניתן לבצע חיתוך קריוסיקציוני (cryo sectioning) לעוברים המוזרקים כדי להמחיש את פיזור החלבונים הפלואורסצנטיים בתא ולבצע צביעה עם נוגדנים ספציפיים. בשלב 10, קבעו את העוברים למשך שעה עד שעתיים בטמפרת החדר עם מקבע דחוס במבחנה מזכוכית בנפח 4 ml. לאחר מכן, לאחר שטיפה ב-PBS, הטמיעו את העוברים בתמיסה של 15% ג'לטין דגים ו-15% סוכרוז באותה המבחנה.
למחרת, העבירו את העוברים המוטמעים לתבנית פלסטיק. הקפיאו במהירות את העוברים המוטמעים על קרח יבש. לאחר מכן, הכינו חיתוכי קריו באמצעות קריוסטט.
בצעו צביעה אימונופלואורסצנטית על החתכים, הצמידו את השקופיות ודגמו תמונות של עוברים בחתך רוחבי באמצעות אותה שיטה שתוארה עבור שתלי אקטודרמה. אספו תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Zeiss Axio plan עם המסננים המתאימים ו-aome כדי לזהות ולדגום מישורי Z ספציפיים בתוך ה-X explan. בדמות זו, ersin ממוקם בצנטרוזום בתאי אקטודרמה, אך trans ממוקם בממברנת התא.
בתגובה ל-Frizzled eight, cex GFP מסמן את ממברנת התא בירוק. Diverse in RFP מופיע באדום, וגרעינים המסומנים ב-DPI מופיעים כאן בכחול. Diverse in RFP מגויס לממברנת התאי על ידי Frizzled eight בחתכים קריוגניים של עוברים.
גמא-טובולין הוא סמן לסומסום המרכז (centrosome). לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של התועלת בעוברי Xenopus ותאים עובריים למחקר של תהליכי קיבוע חלבונים ואיתות ברזולוציה תת-תאית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה משתמש באקטודרמה עוברית של Xenopus כמודל לבחינת קוטביות תא באמצעות הערכה של התפלגות תת-תאית של חלבונים פלואורסצנטיים. הפרוטוקול נועד להבהיר את הבקרה המרחבית של אותות בתאי אקטודרמה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
- העברת אותות
רקע
- עוברים של Xenopus מהווים מודל בעל ערך לחקר תהליכים תאיים.
- הבנת קוטביות התא היא קריטית להשגת תובנות בביולוגיה התפתחותית.
- חלבונים פלואורסצנטיים מאפשרים ויזואליזציה של מיקום חלבונים.
- סיגנל של גורמי גדילה משפיע על מיקום חלבונים בתאים.
מטרת המחקר
- לבחינת שינויים בלוקליזציה של חלבונים בתגובה למסלולי איתות.
- להדגמת גיוס של חלבונים למיקומים תאיים ספציפיים.
- לספק פרוטוקול לחקר קוטביות של תאי אקטודרם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקת RNAs המקודדים ל-RFP ו-FRIZZLED eight לעוברים מוקדמים של Xenopus.
- הכנת שתלים אלקטרודרמליים וחתכי קריו של עוברים.
- צביעה אימונוהיסטוכימית של תאים להדמיות של לוקליזציית חלבונים.
- דימוי של תאים צבועים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
תוצאות עיקריות
- התוצאות מראות שינויים ספציפיים במיקום החלבונים בעקבות איתות של גורמי גדילה.
- חלבונים מגוונים מגויסים מהצנטרוסומה לממברנת התא.
- הודגם תפקידו של הקולטן FRIZZLED eight בתהליך הלוקליזציה.
- סופקו תובנות לגבי הבקרה המרחבית של האיתות בתאי אקטודרמה.
מסקנות
- המחקר מדגיש את חשיבות הלוקליזציה של חלבונים באיתות תאי.
- אקטודרמה עוברית של Xenopus משמשת כמודל יעיל למחקרים מסוג זה.
- הפרוטוקול עשוי לסייע במחקרים נוספים על פולריות תא ומסלולי איתות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בקרת מרחבית של לוקליזציית חלבונים בתגובה לאיתות Wnt מהווה נקודת מפנה קריטית לתיקוף מטרות (target validation) והפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. שימוש באקטודרם של Xenopus ובטרנסלוקציה של חלבון פלואורסצנטי מאפשר ויזואליזציה ישירה של דינמיקת חלבונים ספציפית למסלול, ובכך תומך בביטחון חיזוי לגבי מודולציה של המסלול. גישה זו מחזקת החלטות לגבי תיקי מוצרים על ידי הבהרת ההשלכות התפקודיות של מעורבות מטרות מועמדות בהקשר התפתחותי הרלוונטי למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של פעילות מסלול ה-Wnt באמצעות לוקליזציה תת-תאית של חלבונים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור בין הפעלת קולטן לבין התפלגות חללית מחדש של חלבונים.
- מאפשר תיקוף תפקודי של מטרה במערכת עוברית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית.
- משפר את ביטחון התחזית עבור אסטרטגיות של מודולציה של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס מערכת ex vivo מתוקפית לכימות אירועי טרנסלוקציה של חלבונים.
- מספק פלטי דימוי כמותיים וניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות המשך.
- מאפשר סטנדרטיזציה של קריאות עבור סריקת תרכובות או הפרעות גנטיות.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור מחקרי מסלולי איתות קשורים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה אחד עם מנגנוני סיגנלינג רלוונטיים למחלה המעורבים בהפרעות התפתחותיות ובאונקולוגיה.
- שומר על רציפות תרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות במסלול.
- מאפשר קידום מותאם-סיכון על ידי הבהרת פלטי סיגנלינג מרחביים ברקמה שלמה.
- תומך בהלימה של סמנים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה של שינויים במיקום החלבוני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול זה משתלב בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לבין זיהוי מובילים (lead identification), ומספק גשר בין בדיקת השערות מנגנוניות לבין פיתוח בדיקות כמותיות.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת ויזואליזציה של לוקליזציית חלבונים התלויה במסלול כדי להבהיר את המעורבות של המטרה ואת המנגנון הביולוגי.
- סריקה: מספקת תוצרי דימות כמותיים וניתנים לשחזור המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות ותהליכי סריקה.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של לוקליזציית חלבונים בין תנאים ניסיוניים להפרעות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תוצרי סיגנלינג מרחביים לתהליכי התפתחות הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מספקת פלטפורמה לשימוש חוזר לצורך הערכה של חלבוני סיגנלינג ומודולטורים של מסלולים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתוכניות המכוונות למסלולים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הדימוי והכימות של לוקליזציית חלבונים לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות go/no-go על ידי קישור הפעלת מסלולים להפצה פונקציונלית מחדש של חלבונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מטרות במסלולים ומולקולות מועמדות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהזרקה מיקרוסקופית לעוברים, בדימיון פלואורסצנטי ובניתוח כמותי.
- נדרשת גישה לתשתיות איכותיות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח תמונות.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדימיון ופרשנות הנתונים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול בהתאם להקשר הרקמתי.
- מגבלות מעשיות כוללות אילוצי תפוקה (throughput) וצורך במיומנויות אמבריולוגיות מיוחדות.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Introduction
1:27
In vitro Fertilization of Xenopus Eggs
2:34
RNA Microinjection
3:46
Prepare Ectodermal Explants for Imaging
4:46
Alternative Approach: Prepare Cryosectioned Embryos for Imaging
5:57
Representative Fluorescent Imaging Results
6:29
Conclusion
