Name: בשנת vivo לייזר Axotomy ב C. elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: למד כיצד לבצע חיתוך נוירונים מדויק ב-C. elegans באמצעות לייזר MicroPoint in vivo. שיטה זו מאפשרת חיתוך מרחבי וזמני מדויק של נוירונים מתויגים, ומסייעת לחוקרים לחקור התחדשות נוירונים GABA מוטוריים ביעילות ובעלות נמוכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה במעבדה Hammarlund ממומנת על ידי: NIH מענקים NS066082 R01-01 ו T32GM007223, קרן Beckman, ואת רפואי אליסון קרן.

<ol><li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li>
<li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage%2C+ephrin+signaling%2C+and+synaptic+branchi+ng%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branchi ng.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 15132-15137 (2007).</li>
<li>Yan, D., Wu, Z., Chisholm, A. D., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DLK-1+Kinase+Promotes+mRNA+Stability+and+Local+Translation+in+C.+elegans+Synapses+and+Axon+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The DLK-1 Kinase Promotes mRNA Stability and Local Translation in C. elegans Synapses and Axon Regeneration.</a> Cell. 138, 1005-1018 (2009).</li>
<li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgery%3A+Functional+regeneration+after+laser+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosurgery: Functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li>
<li>Gabel, C. V., Antoine, F., Chuang, C., Samuel, A. D. T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li>
<li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li>
<li>Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1988).</li>
<li>McLntire, S. L., Jorgensen, E., Kaplan, J., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GABAergic+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The GABAergic nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364, 337-341 (1993).</li>
<li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in.</a> C. elegans. Optics Express. 15, 8521-8531 (2007).</li>
<li>Chung, S., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+A%3A+Materials+Science+%26+Processing%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Applied Physics A: Materials Science & Processing. 96, 335-341 (2009).</li>
<li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature Protocols. 5, 395-407 (2010).</li>
<li>Wang, Z., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+axon+regeneration.+Current+Opinion+in+Neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of axon regeneration. Current Opinion in Neurobiology.</a> , Forthcoming (2010).</li>
<li>Huang, X., Cheng, H. -J., Tessier-Lavigne, M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAX-1%2C+a+Novel+PH%2FMyTH4%2FFERM+Domain+Cytoplasmic+Protein+Implicated+in+Netrin-Mediated+Axon+Repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">MAX-1, a Novel PH/MyTH4/FERM Domain Cytoplasmic Protein Implicated in Netrin-Mediated Axon Repulsion.</a> Neuron. 34, 563-576 (2002).</li>
<li>McIntire, S. L., Reimer, R. J., Schuske, K., Edwards, R. H., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+vesicular+GABA+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the vesicular GABA transporter.</a> Nature. 389, 870-876 (1997).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFang-Yen%2C+C+%22Laser+microsurgery+in+C.+elegans+in+Methods+in+Cell+Biology%3A+Caenorhabditis+elegans%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Laser microsurgery in C. elegans in Methods in Cell Biology: Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. , Elsevier Academic Press. Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Guo, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5, 531-533 (2008).</li>
<li>Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+precision+on-chip+small-animal+immobilization%2C+multi-photon+imaging+and+femtosecond-laser+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation.</a> Lab on a Chip. 8, 653-656 (2008).</li>
<li>Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+on-chip+high-throughput+whole-animal+sorting+and+screening+at+subcellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 13891-13895 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li>
<li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior%2C+nerve+regeneration%2C+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 561-567 (2009).</li>
<li>Samara, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+in+vivo+femtosecond+laser+neurosurgery+screen+reveals+small-molecule+enhancer+of+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Large-scale in vivo femtosecond laser neurosurgery screen reveals small-molecule enhancer of regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).</li>
<li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> Journal of Experimental Zoology. 231, 45-56 (1984).</li>
<li>Sulston, J. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+cell+autonomy+during+postembryonic+development+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 78, 577-597 (1980).</li>
<li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 87, 286-300 (1981).</li>
<li>Allen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Innate+Immune+Responses+to+Infection+and+Wounding+in+the+C.+elegans+Epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis.</a> Current biology. CB 18, 481-489 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מגוון של מערכות לייזר שימשו לחתוך neurites ב C. elegans, וכן מספר מחקרים בחנו את הביצועים שלהם בפירוט 3,7,10,11. הלייזר MicroPoint השתמשו בפרוטוקול שלנו היא מערכת סוהר כי הוא קל להקים ולתחזק, והוא זמין במחיר נמוך לחוקרים לעומת מערכת לייזר TI-Sapphire. לעומת מערכת TI-Sapphire, לעומת זאת, הלייזר MicroPoint צפוי לגרום נזק שטח גדול יותר, אשר עשוי להיות נחות עבור יישומים מסוימים. אם מערכת TI-Sapphire הוא הרצוי, פרוטוקול מעולה על בניית מערכת כזו זמין 12. הפרוטוקול הנוכחי יכול להתבצע על מגוון רחב של הנוירונים ב C. elegans, עם זאת, נציין, כי ההבדלים ביכולות משובי בין סוגים שונים של נוירונים צפויים 13. בנוסף, רקע מהונדס שונים יכולים להשפיע על ההצלחה רגנרטיבית. למרות אחוז התחדשות הנוירונים GABA הוא עקבי למדי בין זנים שונים סמן מהונדס, שציינו עלייה קלה הכוללת התחדשות ב juIs76 14 לעומת 15 oxIs12 תולעים. הבדלים בין סמנים של הנוירונים לגעת גם תוארו 2. אנחנו מעדיפים כדי לשתק את התולעים עם microbeads במקום הרדמה כמו חרוזים את התוצאה מהר immobilization עקבית יותר 16. זהו גם יתרון כאשר אנו מסוגלים להתבונן התחדשות ללא כל תופעות בלבול אפשרי בשל הרדמה 17. שיטה חלופית ללא הרדמה עבור immobilization הוא השימוש התקנים microfluidic. השימוש מיקרופלואידיקה עבור axotomy תוארה בהרחבה 17-22. אנו מוצאים כי עם שימוש עקבי, את הפונקציות לייזר הטוב ביותר כאשר coumarin 440 בתא צבען משתנה פעם בשבוע כל ביצוע ההליך המתואר במדריך MicroPoint. אם יש צורך, המחוון הנחתה ניתן להשתמש כדי להגדיל את כוחו, אבל זה עשוי להיות אינדיקציה צבע ישן או חוסר לייזר. כמו כן, יש לצבוע תאים חיים מוגבל, שבסופו של דבר צריך להיות מחדש או להחליף (ראה פתרון בעיות). זה יכול להיות קשה לתמרן את neurite היעד תחת הכוונת המציינים את המיקוד לייזר, במיוחד אם החיה היא משותקת באופן חלקי. אנו מוצאים כי שלב ידני אינו אופטימלי למטרה זו, למרות שהוא שמיש בהחלט. בשלב ג&#39;ויסטיק שבשליטת ממונע מדויק יותר, אנו מוצאים כי באמצעות תוכנה שתומכת תמונה גרירה עם העכבר כדי להזיז את הבמה ממונע הוא הטוב ביותר. אלמנטים Nikon מספק תכונה זו מתוארת בפרוטוקול זה, אבל את החבילה Micromanager חינם, כמו גם תוכנות הדמיה אחרות, ייתכן פונקציונליות דומה. דרך אחרת של מיקוד בסדר היא להעביר את המיקוד לייזר, ולא החיה. קרן מנגנון היגוי גלונומטר זמין כמו תוספת על הלייזר MicroPoint, אם גישה זו היא המועדפת. מלבד היישום שלה ללימוד התחדשות עצבית, הלייזר יכול לשמש כדי לכרות סוגי תאים אחרים, כגון העור, השריר, או תאים מיוחדים, או לשבש סינפסות עצביות ספציפיות 23-27. יתר על כן, המסלולים המווסתים את התנוונות הנוירונים המלווה פציעה או מחלה יכולה להיחקר עם מערכת זו. ככזה, את השימוש של לייזרים פעמו ימשיכו לשפוך אור על שני גורמים גנטיים השינויים הביולוגיים המאפשרים לתא התחדשות העצבית ותהליכים רלוונטיים אחרים. פתרון בעיות: המתואר כאן כמה בעיות נפוצות ופתרונות הקשורים בהם. <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלייזר אינו גזירה כראוי. זה צפוי כי גם לייזר הוא מחוץ לפוקוס (ראה סעיף 2), או לצבוע בתא צבע צריך להיות מוחלף (ראה MicroPoint ידנית). לחלופין, התא לצבוע ייתכן שיהיה צורך להחליף או מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התולעים עוברים על agarose כרית. זהו בדרך כלל סימן לכך משטח agarose לח מדי. אנו מוצאים כי רפידות צריך להיות שמאל במשך כ 30 שניות לפני תולעים ממוקמים להם לעקוף את הבעיה הזו. אתה יכול גם לנסות להשתמש בגודל קטן יותר (0.05 מיקרומטר) microbeads. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההתאוששות של תולעים קשה ולא יעיל. זה יכול להיגרם על ידי הסרת coverslip שגוי או על ידי כרית agarose יבש. אם כרית הוא יבש מדי, אתה עשוי להבחין כי האקסונים לפתח מראה חרוזים. במקרים מסוימים, זה בגלל התולעים לא הונחו על משטח די מהר אחרי זה נעשה. לחלופין, המניה הישנה של פתרון agarose אולי ריכוז גבוה מ -3% לאחר ההיתוך חוזרות ונשנות. </li></ol>

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> חרוזי פוליסטירן 0.05 מיקרומטר </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 08691 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי פוליסטירן 0.10 מיקרומטר </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose GPG / LE </td><td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> 00972 </td><td> אולטרה טהורים </td></tr><tr><td> פלקון 14 מ&quot;ל פוליסטירן Round-Bottom Tube </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> 17 x 100 מ&quot;מ סגנון, nonpyrogenic </td></tr><tr><td> Thermo Scientific רגיל שקופיות מיקרוסקופ precleaned </td><td> אירי מדעי החברה </td><td> 420-004T </td><td> 3 &quot;x 1&quot; x 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> כיסוי החלקות </td><td> VWR </td><td> 48366 205 </td><td> 18 מ&quot;מ x 18 מ&quot;מ מס &#39;1 1 / 2 </td></tr><tr><td> KIMTECH המדע Kimwipes </td><td> קימברלי קלארק </td><td> 34155 </td><td></td></tr><tr><td> BD פלקון 100 x 15mm צלחת פטרי סגנון </td><td> BD Biosciences </td><td> 351029 </td><td></td></tr><tr><td> ריק Tape 3/4w x 500L </td><td> TimeMed </td><td> T-512 </td><td></td></tr><tr><td> טבילה שמן </td><td> ניקון </td><td></td><td> סוג A, nd = 1.515 </td></tr><tr><td> EG1285 או CZ1200 </td><td> סי אלגנס גנטית מרכז </td><td> http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ </td><td></td></tr><tr><td> OptiScan II </td><td> מדעי מראש </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ש-Elements Ar או Br </td><td> ניקון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> לייזר MicroPoint אבלציה מערכת </td><td> פוטוניים מדעי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מתחם מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td> Eclipse 80i </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu מצלמה </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> דגם C8484-05G01 </td><td></td></tr><tr><td> Dell Precision T3400 PC עם Intel Core 2 Duo </td><td> Dell </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Windows XP Professional </td><td></td><td> מיקרוסופט </td><td> גרסת 2002, סדרה Pack 3 </td></tr><tr><td> Dual אמבטיה יבש החממה </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td></td><td> אנלוגי שולט </td></tr><tr><td> 4X תוכנית פלואוריד אובייקטיבי </td><td> ניקון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100x תוכנית Apo VC שמן אובייקטיבי </td><td> ניקון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> דומון # 5 / 45 מלקחיים </td><td> דומון </td><td> 11251-35 </td><td> Dumoxel טיפים סטנדרטיים, ניתן גם להשתמש ב # 7 </td></tr><tr><td> הביתור מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td> SMZ800 </td><td> עם הפנס NI-150 עוצמה גבוהה </td></tr></tbody></table>

בשנת vivo לייזר axotomy ב c. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

נוירונים לתקשר עם תאים אחרים באמצעות אקסונים דנדריטים, הרחבות קרום דק המכילים התמחויות טרום או פוסט סינפטי. אם נוירון הוא נפגע על ידי פציעה או מחלה, עלול להתחדש. גורמים סלולרי פנימי חיצוני להשפיע על היכולת של תא עצב להתחדש ולשקם את תפקוד. לאחרונה, נמטודות ג elegans התפתחה אורגניזם מודל מצוין לזהות גנים איתות המסלולים המשפיעים על התחדשות של נוירונים 1-6. הדרך העיקרית ליזום התחדשות הנוירונים ב C. elegans היא חיתוך לייזר בתיווך או axotomy. במהלך axotomy, תהליך עצבי fluorescently שכותרתו היא הכרות באמצעות אנרגיה גבוהה פולסים. בתחילה, התחדשות הנוירונים ב C. elegans נבדקה באמצעות לייזר femtosecond מוגבר 5. עם זאת, מחקרים התחדשות לאחר מכן הראו כי לייזר פעמו קונבנציונליים יכולים לשמש במדויק לנתק נוירונים in vivo ו לתגובה משובי דומה 1,3,7. אנו מציגים פרוטוקול לביצוע in vivo לייזר axotomy ב התולעת באמצעות MicroPoint פעמו לייזר, מערכת סוהר זמינה וכי כבר בשימוש נרחב עבור אבלציה תא ממוקד. אנו מתארים יישור לייזר, מקבע את התולעים, חיתוך נוירונים ספציפיים, והערכת התחדשות הבאים. המערכת מספקת את היכולת לחתוך מספר גדול של נוירונים תולעים מרובות במהלך הניסוי אחד. לפיכך, לייזר axotomy כפי שמתואר במסמך זה מערכת יעילה לייזום ניתוח תהליך של התחדשות.

פרוטוקול לחתוך נוירונים<em&gt; ג elegans</em&gt; עם לייזר פעמו MicroPoint מוצג. אנו מתארים הקמת המערכת, משתק תולעים ניתוק שכותרתו נוירונים. היתרונות כוללים מערכת יחסית בעלות נמוכה ויכולת לנתק תהליכים עצביים או תאים לכרות<em&gt; In vivo</em&gt;.

בשנת vivo לייזר Axotomy ב C. elegans

נוירונים מתקשרים עם תאים אחרים באמצעות אקסונים ודנדריטים, שהם שלוחות ממברנה דקיקות המכילות התמחותיות פרה-סינפטיות או פוסט-סינפטיות. אם נוירון...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחתוך במדויק את הנוירונים של CL בשילוב עם לייזר in vivo. דבר זה מושג על ידי הרכבת מערכת ה-taxotomy, מיקוד מדויק, יישור וכיוון של הספק הלייזר. כאשר תולעים מקובעות על תבנית מיקרוסקופ, ניתן לחתוך את הנוירונים שלהן תוך שליטה מרחבית וזמנית מדויקת.המידה שבה נוירונים קטועים מתחדשים נמדדת לאחר מכן על ידי דירוג של קונוסי צמיחה ו/או על ידי מעקב אחר אורכי הנוריטים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון לייזר פמטו-שנייה, הוא שלייזר פולס נקודתי מיקרוסקופי הוא מערכת חסכונית, קלה להקמה ולתחזוקה, וניתנת להתאמה בקלות למגוון רחב של יישומים, למרות שבדרך כלל אנו מיישמים שיטה זו כדי לחקור התחדשות של נוירוני מוטור GABA. ניתן להשתמש במערכת גם כדי להשמיד סוגי תאים אחרים, כגון שרירי עור, או סינפסות נוירונליות ספציפיות.שיטה זו דורשת מערכת לייזר בנקודת מיקרו (micro point laser system). הלייזר מותקן ביציאת הפלואורסצנציה האפי-פלאנרית (epi fluorescence port) של מיקרוסקופ תרכוב, וכולל מסנן דיכרואי בודד התואם לפלואורופור בתאים המיועדים לחיתוך, מחולל פולסים ודוושה להפעלת הלייזר. לכל הפחות, המיקרוסקופ צריך להיות מצויד בעדשת אובייקטיב שמן 100x ב-1.4 NA ובעדשת אובייקטיב 4x.השתמשו בשולחן עבודה ממוטור (motorized stage) עם תפעול באמצעות ג'ויסטיק, המותקן על שולחן אוויר לצורך תאורה. מקור אור עם מוליך אור ומנגנון תריס מחובר ללייזר נקודתי זעיר (micro point laser). מנגנון התריס שימושי להפחתת עוצמת התאורה באופן בלתי תלוי בלייזר.מצלמה המחוברת למחשב דורשת קצב פריימים של לפחות 16 hertz ויכולת פעולה טובה בתנאי תאורה מופחתים. המחשב דורש תוכנת דימיון, כגון Nikon elements, לצפייה בנוירונים, להפעלת המצלמה ולשליטה בשולחן המיקרוסקופ הממונע. כאשר המערכת מורכבת במלואה, המשתמש יכול למקד את המיקרוסקופ ביד אחת, להזיז את השולחן ביד השנייה, להפעיל את הלייזר באמצעות דום רגל, וליהנות מראות ברורה של התמונה על המסך.חיתוך נוירונים באורגניזם בגודל של גרגיר חול יכול להיות מאתגר. כדי להשיג זאת, הלייזר חייב להיות ממוקד באופן הדוק בשלושה ממדים. התחל במיקוד מישור Z.דחפו פנימה את מסנן הצפיפות הניטרלית ND 16 כדי להנחית את הלייזר בזמן הפוקוס לצורך מיקוד מדויק יותר, על ידי דחיפתם של both ND 16 ושל ארבעת המסננים הפלואורסצנטיים. לאחר מכן, הגדירו את לייזר המיקרו-נקודה לפולס אחד באמצעות המפסק למצב select, ולאחר מכן העבירו את גלגל המסננים למסנן החסימה (barrier filter) בעל המעבר הארוך המתאים. כעת, הניחו סלייד עם מראה על הבמה ובצעו פוקוס על חורי סיכה (pinholes) בתוכו באמצעות עדשה פי 4 ואור שעובר (transmitted light).לאחר קבלת פוקוס, הוסיפו טיפה של שמן אימרסיה לשקף ובצעו פוקוס מחדש על חורי הפין (pinholes) באמצעות עדשה אובייקטיבית פי 100. לאחר מכן, השתמשו במנוף החלפת נתיב האור כדי לפתוח את תריס המצלמה ואת תריס הלייזר. אם קשה להשיג פוקוס מדויק, הפחיתו את עוצמת האור המועבר עד ששוליהם של חורי הפין יהיו חדות.כדי לבדוק את המיקוד, השתמשו בדוושה להפעלת הלייזר. אם מישור Z ממוקד כראוי, חור קטן אמור להופיע במראה. כעת מקדו את המיקרוסקופ מעט מעל למישור של השקופית המראתית והפעילו את הלייזר שוב.פעולה זו אמורה ליצור חור קטן אף יותר מהירירות הראשונה או לא להשאיר סימן כלל. תוצאות דומות אמורות להיראות בעת מיקוד מתחת לשקףית המראה. עם זאת, אם נוצר חור גדול יותר, יש למקד מחדש את הלייזר באמצעות טבעת המיקוד בראש האבלציה.לבסוף, ודא שהחור עדיין מיושר כראוי עם סימני הפסיילה (cross hairs) בעין. בשימוש עקבי, מיקוד מישור Z דורש כיוון לעיתים רחוקות בלבד. כדי למקד את הלייזר במישור XY, בצע חור נוסף במראה, ולאחר מכן היכנס לתוכנה ב-Nikon elements.הפעילו את מצב הלכידה החיה (live capture) בתפריט הרכישה (acquire). בסרגל כלי המדידה, בחרו בעורך ה-ROI, בחרו בכלי הצלב הכפול וגררו את קווי הצלב כדי ליישר אותם עם מרכז החור החדש. לחצו על שמירת ROI ולאחר מכן צאו מהעורך כדי להמשיך בלכידה החיה.כדי לשלוט בבמה באמצעות העכבר, הפעילו את הגדרת ה-XY של העכבר. כעת הלייזר ממוקד. החזירו את מסנני הצפיפות הניטרלית (neutral density filters) למצבם המקורי והגדירו את פולסי הלייזר מאחד ל-10 לשימוש עתידי.ראשית, הכין תמיסה של 3% molten aros בתוך תמיסת M nine ומזוג כ-5 milliliters לתוך מבחנה של 50 milliliters. הנח את המבחנה במקלח מים בטמפרטורה של 55 עד 65 degrees Celsius ושמור את השארית לשימוש עתידי. כעת השתמש בשתי שקופיות מכוסות בתוויות סימון.הדביקו זוג תזריות נקיות וטיפה של אגרוז כדי ליצור רקה שניתן להניח עליה את התולעים. לאחר 30 שניות, כשהאגרוז יתגבש, טפטפו בעזרת פיפטה 3 עד 5 µL של חלקיקי פוליסטירן בקוטר 0.05 עד 0.1 µm על הרקה. בתוך 10 דקות, סדרו במהירות 5 עד 10 תולעים טרנסגניות על החלקיקים בעזרת מחט פלטינה, כך שהנוירונים המסומנים שלהן יהיו גלויים למשקיף. כדי למנוע נזק לתולעים, הניחו בזהירות זכוכית כיסוי סטנדרטית על התולעים.הזזה של התכריס. תכריס התולעים מוכן כעת לביצוע טקסונומיה. באמצעות העדשה, אתרו את התולעים תחת הגדלה של 4x, בצעו פוקוס מחדש עם עדשה של 100x, כבו את התאורה המועברת, הדליקו את הפלואורסצנציה והעבירו את הנתיב האופטי למצלמה.השתמשו בעכבר כדי למרכז את הנוירון על סימון הצלב. כעת הפעילו את הלייזר באמצעות דום הרגל. עוצמת לייזר נכונה תנתק את הנוירון באחד או שני פולסים.עוצמת לייזר גבוהה מדי תגרום לנזק היקפי או ליצירת חור בתולעת; כדי לכוון את עוצמת הלייזר, יש להזיז את לוחת הניחות (attenuator plate). אם עוצמת הלייזר נחלשת, ניתן לכוון את מיקום לוחת הניחות כדי להמשיך בחיתוך. עם זאת, סביר להניח שזהו סימן לכך שיש להחליף את ה-Kumar in four 40 בתא ה-D של הלייזר כאשר הפעולה מבוצעת כהלכה.טקסונומיה בלייזר יוצרת קרע קטן בנוירון. במקרים מסוימים, עלול להיווצר צלקת קטנה מסביב לאתר הפגיעה. בפועל, נחתכים בין נוירון אחד לשלושה לבעל חיים, אך אין לכך הגבלה תיאורטית.בסיום הפעולה, השב את התולעים על ידי הסרת לביבת הזכוכית בתנועה אנכית ישירה למעלה, תוך הקפדה שהתולעים יישארו על פד ה-agro rose. אין להחליק את לביבת הזכוכית החוצה. השתמש בפינצטה בעלת קצה דק כדי לגזור את הפד מסביב לתולעים.הניחו את הפד על מצע NGM שזרעו לאחרונה ומכיל OP 50, ושחררו את התולעים באמצעות 10 µL של M9 סטרילי. בין שמונה ל-48 שעות לאחר ה-exotomy ניתן להעריך את הרגנרציה; לשם כך, הצמידו מחדש את התולעים הבריאות ל-3 עד 5 µL של חרוזי פוליסטירן והדמינו את הנוירונים שלהן במיקומי הנוירונים שהותרו. נשאר קטע עצבי (stump) דיסטלי לאתר החיתוך. הן הקטעים הדיסטליים והן הפרוקסימליים נסוגים בתחילה לאחר החיתוך, אך הרגנרציה צפויה להתרחש מהקטע הפרוקסימלי.ניתן להעריך את הרגנרציה על פי היווצרותה של קונית צמיחה (growth cone). לחלופין, ניתן לעקוב אחר אורך הנויריט ולהשוואתו; בדרך כלל 60% עד 70% מנוירוני ה-GABA יוצרים קוניות צמיחה תוך 24 שעות מהחיתוך. אם הלייזר אינו חותך כראוי, סביר להניח שהדבר נובע מכך שהלייזר אינו ממוקד או כי יש להחליף את הצבע בתא הצבע.בנוסף, אם תבחינו שהתולעים נעות, הדבר נובע ככל הנראה מכך שפד ה-agros לח מדי. מצאנו כי יש להמתין כ-30 שניות לפני הנחת התולעים על הפדים כדי למנוע בעיה זו. כמו כן, ניתן לנסות להשתמש במיקרו-בידס (microbeads) בגודל קטן יותר כדי לקבע את התולעים.לבסוף, אם אתם מבחינים כי לאקסונים יש מראה מחובב (beaded appearance), סביר להניח שהדבר נובע מכך שפד ה-agros יבש מדי. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הגדרת מערכת הלייזר למסנקטורה (micro point laser system), הרכבת תולעים לצורך טקסונומיה, חיתוך נוירונים בודדים והערכת הרגנרציה העוקבת.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

לייזר axotomy ואחריו הדמיה זמן לשגות היא דרך רגיש assay את ההשפעות של...

בניית מערכת בתקציב נמוך לייזר Axotomy לחקר התחדשות אקסון ב ג elegans</em

סרטון זה מציג שיטה של פציעה בלייזר, המשמשת לגרימת פציעות מדויקות מאוד באפידרמיס התולעת. פרוטוקול הדגימה הוא ממחקר של תגובה ותיקון פצעים.

פגיעה בלייזר אפידרמיס: גרימת נזק מקומי לבחינת תהליכי תיקון ב- C. elegans

סרטון זה מתאר את השיטה לפצוע אקסונים בעוברים של דגי זברה באמצעות שתי אקסוטומיות לייזר פוטונים וצפייה בהתאוששות אקסונלית מפציעה.

אקסוטומיה של לייזר דו-פוטון: שיטה לפצוע אקסונים בעוברים של דגי זברה ולצפות בהתאוששות אקסונלית

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים...

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

שני פוטונים הדמיה, מצמידים את nanodissection לייזר, הם כלים שימושיים ללמוד תהליכים ניווניים ומשובים במערכת העצבים המרכזית עם הרזולוציה subcellular. פרוטוקול זה מראה כיצד לתייג, תמונה, ולנתח סיבי טיפוס בודדים בקליפת המוח הקטן in vivo.

Nanosurgery הלייזר של האקסונים Cerebellar<em&gt; בVivo</em

העור הבוגר של C. elegans הוא מודל ניתן למעקב למחקרים על תגובות פצע אפיתל, כולל סגירת פצע, היווצרות צלקות וחסינות מולדת.

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב C. elegans

אבלציה בלייזר היא טכנולוגיה ישימה לחקר התחדשות במערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מתאר שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר לאבלציה בלייזר והדמיית זמן-לשגות של התחדשות תאים interneuromast בקו רוחבי של דגי הזברה.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

מתואר פרוטוקול המשתמש במיקרו-דיסקציה של לייזר כדי לבודד רקמות נמטודה בודדות לריצוף RNA. הפרוטוקול אינו דורש ערכות כלים גנטיות ספציפיות למינים, מה שמאפשר להשוות פרופילי ביטוי גנים בין מינים שונים ברמה של דגימות של רקמה אחת.

מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים

למד כיצד לבצע חיתוך נוירונים מדויק ב-C. elegans באמצעות לייזר MicroPoint in vivo. שיטה זו מאפשרת חיתוך מרחבי וזמני מדויק של נוירונים מתויגים, ומסייעת לחוקרים לחקור התחדשות נוירונים GABA מוטוריים ביעילות ובעלות נמוכה.

בשנת vivo לייזר Axotomy ב C. elegans

גלה סרטונים נוספים