בשנת vivo לייזר Axotomy ב C. elegans
19 במאי 2011
פרוטוקול לחתוך נוירונים ג elegans עם לייזר פעמו MicroPoint מוצג. אנו מתארים הקמת המערכת, משתק תולעים ניתוק שכותרתו נוירונים. היתרונות כוללים מערכת יחסית בעלות נמוכה ויכולת לנתק תהליכים עצביים או תאים לכרות In vivo.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לחתוך במדויק את הנוירונים של CL בשילוב עם לייזר in vivo. דבר זה מושג על ידי הרכבת מערכת ה-taxotomy, מיקוד מדויק, יישור וכיוון של הספק הלייזר. כאשר תולעים מקובעות על תבנית מיקרוסקופ, ניתן לחתוך את הנוירונים שלהן תוך שליטה מרחבית וזמנית מדויקת.
המידה שבה נוירונים קטועים מתחדשים נמדדת לאחר מכן על ידי דירוג של קונוסי צמיחה ו/או על ידי מעקב אחר אורכי הנוריטים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון לייזר פמטו-שנייה, הוא שלייזר פולס נקודתי מיקרוסקופי הוא מערכת חסכונית, קלה להקמה ולתחזוקה, וניתנת להתאמה בקלות למגוון רחב של יישומים, למרות שבדרך כלל אנו מיישמים שיטה זו כדי לחקור התחדשות של נוירוני מוטור GABA. ניתן להשתמש במערכת גם כדי להשמיד סוגי תאים אחרים, כגון שרירי עור, או סינפסות נוירונליות ספציפיות.
שיטה זו דורשת מערכת לייזר בנקודת מיקרו (micro point laser system). הלייזר מותקן ביציאת הפלואורסצנציה האפי-פלאנרית (epi fluorescence port) של מיקרוסקופ תרכוב, וכולל מסנן דיכרואי בודד התואם לפלואורופור בתאים המיועדים לחיתוך, מחולל פולסים ודוושה להפעלת הלייזר. לכל הפחות, המיקרוסקופ צריך להיות מצויד בעדשת אובייקטיב שמן 100x ב-1.4 NA ובעדשת אובייקטיב 4x.
השתמשו בשולחן עבודה ממוטור (motorized stage) עם תפעול באמצעות ג'ויסטיק, המותקן על שולחן אוויר לצורך תאורה. מקור אור עם מוליך אור ומנגנון תריס מחובר ללייזר נקודתי זעיר (micro point laser). מנגנון התריס שימושי להפחתת עוצמת התאורה באופן בלתי תלוי בלייזר.
מצלמה המחוברת למחשב דורשת קצב פריימים של לפחות 16 hertz ויכולת פעולה טובה בתנאי תאורה מופחתים. המחשב דורש תוכנת דימיון, כגון Nikon elements, לצפייה בנוירונים, להפעלת המצלמה ולשליטה בשולחן המיקרוסקופ הממונע. כאשר המערכת מורכבת במלואה, המשתמש יכול למקד את המיקרוסקופ ביד אחת, להזיז את השולחן ביד השנייה, להפעיל את הלייזר באמצעות דום רגל, וליהנות מראות ברורה של התמונה על המסך.
חיתוך נוירונים באורגניזם בגודל של גרגיר חול יכול להיות מאתגר. כדי להשיג זאת, הלייזר חייב להיות ממוקד באופן הדוק בשלושה ממדים. התחל במיקוד מישור Z.
דחפו פנימה את מסנן הצפיפות הניטרלית ND 16 כדי להנחית את הלייזר בזמן הפוקוס לצורך מיקוד מדויק יותר, על ידי דחיפתם של both ND 16 ושל ארבעת המסננים הפלואורסצנטיים. לאחר מכן, הגדירו את לייזר המיקרו-נקודה לפולס אחד באמצעות המפסק למצב select, ולאחר מכן העבירו את גלגל המסננים למסנן החסימה (barrier filter) בעל המעבר הארוך המתאים. כעת, הניחו סלייד עם מראה על הבמה ובצעו פוקוס על חורי סיכה (pinholes) בתוכו באמצעות עדשה פי 4 ואור שעובר (transmitted light).
לאחר קבלת פוקוס, הוסיפו טיפה של שמן אימרסיה לשקף ובצעו פוקוס מחדש על חורי הפין (pinholes) באמצעות עדשה אובייקטיבית פי 100. לאחר מכן, השתמשו במנוף החלפת נתיב האור כדי לפתוח את תריס המצלמה ואת תריס הלייזר. אם קשה להשיג פוקוס מדויק, הפחיתו את עוצמת האור המועבר עד ששוליהם של חורי הפין יהיו חדות.
כדי לבדוק את המיקוד, השתמשו בדוושה להפעלת הלייזר. אם מישור Z ממוקד כראוי, חור קטן אמור להופיע במראה. כעת מקדו את המיקרוסקופ מעט מעל למישור של השקופית המראתית והפעילו את הלייזר שוב.
פעולה זו אמורה ליצור חור קטן אף יותר מהירירות הראשונה או לא להשאיר סימן כלל. תוצאות דומות אמורות להיראות בעת מיקוד מתחת לשקףית המראה. עם זאת, אם נוצר חור גדול יותר, יש למקד מחדש את הלייזר באמצעות טבעת המיקוד בראש האבלציה.
לבסוף, ודא שהחור עדיין מיושר כראוי עם סימני הפסיילה (cross hairs) בעין. בשימוש עקבי, מיקוד מישור Z דורש כיוון לעיתים רחוקות בלבד. כדי למקד את הלייזר במישור XY, בצע חור נוסף במראה, ולאחר מכן היכנס לתוכנה ב-Nikon elements.
הפעילו את מצב הלכידה החיה (live capture) בתפריט הרכישה (acquire). בסרגל כלי המדידה, בחרו בעורך ה-ROI, בחרו בכלי הצלב הכפול וגררו את קווי הצלב כדי ליישר אותם עם מרכז החור החדש. לחצו על שמירת ROI ולאחר מכן צאו מהעורך כדי להמשיך בלכידה החיה.
כדי לשלוט בבמה באמצעות העכבר, הפעילו את הגדרת ה-XY של העכבר. כעת הלייזר ממוקד. החזירו את מסנני הצפיפות הניטרלית (neutral density filters) למצבם המקורי והגדירו את פולסי הלייזר מאחד ל-10 לשימוש עתידי.
ראשית, הכין תמיסה של 3% molten aros בתוך תמיסת M nine ומזוג כ-5 milliliters לתוך מבחנה של 50 milliliters. הנח את המבחנה במקלח מים בטמפרטורה של 55 עד 65 degrees Celsius ושמור את השארית לשימוש עתידי. כעת השתמש בשתי שקופיות מכוסות בתוויות סימון.
הדביקו זוג תזריות נקיות וטיפה של אגרוז כדי ליצור רקה שניתן להניח עליה את התולעים. לאחר 30 שניות, כשהאגרוז יתגבש, טפטפו בעזרת פיפטה 3 עד 5 µL של חלקיקי פוליסטירן בקוטר 0.05 עד 0.1 µm על הרקה. בתוך 10 דקות, סדרו במהירות 5 עד 10 תולעים טרנסגניות על החלקיקים בעזרת מחט פלטינה, כך שהנוירונים המסומנים שלהן יהיו גלויים למשקיף. כדי למנוע נזק לתולעים, הניחו בזהירות זכוכית כיסוי סטנדרטית על התולעים.
הזזה של התכריס. תכריס התולעים מוכן כעת לביצוע טקסונומיה. באמצעות העדשה, אתרו את התולעים תחת הגדלה של 4x, בצעו פוקוס מחדש עם עדשה של 100x, כבו את התאורה המועברת, הדליקו את הפלואורסצנציה והעבירו את הנתיב האופטי למצלמה.
השתמשו בעכבר כדי למרכז את הנוירון על סימון הצלב. כעת הפעילו את הלייזר באמצעות דום הרגל. עוצמת לייזר נכונה תנתק את הנוירון באחד או שני פולסים.
עוצמת לייזר גבוהה מדי תגרום לנזק היקפי או ליצירת חור בתולעת; כדי לכוון את עוצמת הלייזר, יש להזיז את לוחת הניחות (attenuator plate). אם עוצמת הלייזר נחלשת, ניתן לכוון את מיקום לוחת הניחות כדי להמשיך בחיתוך. עם זאת, סביר להניח שזהו סימן לכך שיש להחליף את ה-Kumar in four 40 בתא ה-D של הלייזר כאשר הפעולה מבוצעת כהלכה.
טקסונומיה בלייזר יוצרת קרע קטן בנוירון. במקרים מסוימים, עלול להיווצר צלקת קטנה מסביב לאתר הפגיעה. בפועל, נחתכים בין נוירון אחד לשלושה לבעל חיים, אך אין לכך הגבלה תיאורטית.
בסיום הפעולה, השב את התולעים על ידי הסרת לביבת הזכוכית בתנועה אנכית ישירה למעלה, תוך הקפדה שהתולעים יישארו על פד ה-agro rose. אין להחליק את לביבת הזכוכית החוצה. השתמש בפינצטה בעלת קצה דק כדי לגזור את הפד מסביב לתולעים.
הניחו את הפד על מצע NGM שזרעו לאחרונה ומכיל OP 50, ושחררו את התולעים באמצעות 10 µL של M9 סטרילי. בין שמונה ל-48 שעות לאחר ה-exotomy ניתן להעריך את הרגנרציה; לשם כך, הצמידו מחדש את התולעים הבריאות ל-3 עד 5 µL של חרוזי פוליסטירן והדמינו את הנוירונים שלהן במיקומי הנוירונים שהותרו. נשאר קטע עצבי (stump) דיסטלי לאתר החיתוך. הן הקטעים הדיסטליים והן הפרוקסימליים נסוגים בתחילה לאחר החיתוך, אך הרגנרציה צפויה להתרחש מהקטע הפרוקסימלי.
ניתן להעריך את הרגנרציה על פי היווצרותה של קונית צמיחה (growth cone). לחלופין, ניתן לעקוב אחר אורך הנויריט ולהשוואתו; בדרך כלל 60% עד 70% מנוירוני ה-GABA יוצרים קוניות צמיחה תוך 24 שעות מהחיתוך. אם הלייזר אינו חותך כראוי, סביר להניח שהדבר נובע מכך שהלייזר אינו ממוקד או כי יש להחליף את הצבע בתא הצבע.
בנוסף, אם תבחינו שהתולעים נעות, הדבר נובע ככל הנראה מכך שפד ה-agros לח מדי. מצאנו כי יש להמתין כ-30 שניות לפני הנחת התולעים על הפדים כדי למנוע בעיה זו. כמו כן, ניתן לנסות להשתמש במיקרו-בידס (microbeads) בגודל קטן יותר כדי לקבע את התולעים.
לבסוף, אם אתם מבחינים כי לאקסונים יש מראה מחובב (beaded appearance), סביר להניח שהדבר נובע מכך שפד ה-agros יבש מדי. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הגדרת מערכת הלייזר למסנקטורה (micro point laser system), הרכבת תולעים לצורך טקסונומיה, חיתוך נוירונים בודדים והערכת הרגנרציה העוקבת.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לחיתוך נוירונים ב-C. elegans באמצעות לייזר פולסי MicroPoint. השיטה מאפשרת חיתוך מדויק של נוירונים מסומנים in vivo, ומספקת גישה יעילה מבחינת עלות וניתנת להתאמה ליישומים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביולוגיה של התא
רקע
- הטכניקה מתמקדת ברגנרציה של נוירונים מוטוריים מסוג GABA.
- היא מספקת שיטה לחיתוך נוירונים in vivo בדיוק גבוה.
- שיטות קיימות, כגון לייזרים בפס של פמטושנייה, הן יקרות ומורכבות יותר.
- מערכת הלייזר MicroPoint קלה יותר להקמה ולתחזוקה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לחיתוך מדויק של נוירונים ב-C. elegans.
- מדידת הרגנרציה של נוירונים שנחתכו.
- הדגמת הרב-גוניות של מערכת הלייזר MicroPoint.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הרכבת מערכת ה-taxotomy באמצעות לייזר MicroPoint.
- קיבוע של C. elegans על תבנית מיקרוסקופ.
- מיקוד וכיוון מדויקים של הלייזר.
- מדידת התחדשות נוירונים באמצעות דירוג של קונוסי צמיחה.
תוצאות עיקריות
- ניתוק מוצלח של נוירונים עם נזק היקפי מינימלי.
- יכולת לחתוך מספר נוירונים לכל בעל חיים.
- הוכחה של התחדשות נוירונים לאחר אבלציה.
- התאמת השיטה לסוגי תאים אחרים.
מסקנות
- מערכת הלייזר MicroPoint היא כלי בעל ערך למחקר בתחום מדעי המוח.
- שיטה זו מאפשרת בקרה מדויקת בחיתוך נוירונים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב למגוון מחקרי תאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים מדויקים של פגיעה עצבית in vivo חיוניים לצמצום סיכונים בתהליך תיקוף המטרות בתוכניות למחלות נוירודגנרטיביות. שיטת ה-laser axotomy זו מאפשרת הערכה כמותית וניתנת לשחזור של התחדשות אקסונים במערכת שניתן לשלוט בה גנטית, ובכך היא מספקת תובנות מכניסטיות לגבי נתיבי תיקון. על ידי אספקת פלטפורמה יעילה כלכלית וניתנת להרחבה למחקרי פגיעה והתחדשות עצבית, היא מסייעת בקבלת החלטות מוקדמות בשלב הגילוי לגבי מטרות המשפיעות על חוסן ותיקון עצבי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטי
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השפעות גנטיות ופארמקולוגיות על התחדשות אקסונים במעגל נוירונלי מוגדר.
- ערך תפעולי: משתמש במערכת לייזר פולס מהסוג MicroPoint, הזמינה באופן נרחב, לצורך ניתוק נוירונלי עקבי ובדיוק גבוה.
- ערך ניבוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מטרות על ידי קישור בין מודולציה של גן או נתיב לבין תוצאות התחדשות מדידות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות לבדיקה: מייצר מודלים סטנדרטיים של פגיעה עצבית המתאימים לסריקה של משני גנטיים או מולקולות קטנות המשפיעות על התחדשות.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה של התחדשות באמצעות התווצרות של קוני גדילה או מעקב אחר אורך נוריטים, מה שמאפשר השוואות מבוססות נתונים.
- יכולת הרחבה: מקל על ביצוע אקסוטומיה למספר רב של נוירונים בתולעים רבות בכל ניסוי, ובכך מעלה את התפוקה לצורך אנליזה פנוטיפית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלות: מספק פלטפורמה מכניסטית לחקר מסלולי רגנרציה שמורים שניתן להחיל על מודלים של מחלות נוירודגנרטיביות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין גילוי מטרות גנטיות ב-C. elegans לבין תיקוף במערכות פרה-קליניות מסדר גבוה יותר.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר האם מטרה מסוימת פועלת באופן תא-אוטונומי בנוירונים כדי להשפיע על יכולת הרגנרציה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ותומכת בתיקוף המטרה באמצעות סריקה פנוטיפית של תוצאי רגנרציה לפני המעבר לזיהוי מועמדים מובילים (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקה תפקודית של מסלולי תיקון עצביים על ידי השראה של פגיעה מבוקרת באקסונים ומעקב אחר הרגנרציה.
- סריקה: מייצרת מודלים של פגיעה הניתנים למדידה ולשחזור לצורך הערכת השפעות של תרכובות או השפעות גנטיות על תגובות רגנרטיביות.
- אנליטיקה: מייצרת נקודות קצה מדידות, כגון שכיחות של קוני גדילה והתארכות נוריטים, להשוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: תומכת בהסקרה בין-מינית של מנגנוני רגנרציה שזוהו בתולעים למודלים של יונקים.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה מודולרית וסתגלנית למחקרי פגיעות עצביות, הישימה במגוון פרויקטים של מדעי המוח.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק בהירות מכניסטית לגבי מנגנוני תיקון נוירונליים ותיקוף מטרות בניוון עצבי.
- ערך תפעולי: מציע חלופה משתלמת וניתנת לשחזור למערכות לייזר פמטו-שנייה עבור אקסוטומיה in vivo.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בהחלטות go/no-go על ידי הפחתת העמימות בפנוטיפים של רגנרציה המודולים על ידי מטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על תיקוף פונקציונלי במודל של פגיעה נוירונלית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבטיחות לייזר, יישור אופטי ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה להפעלה אמינה.
- נדרשת מערכת לייזר פועם מסוג MicroPoint, מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם עדשה שומנית 100x, ובמה ממונעת למניפולציה של תולעים.
- סטנדרטיזציה של קיבוע התולעים והגדרות הספק הלייזר נחוצה כדי להשיג אקסוטומיה (axotomy) הדירה בין משתמשים וניסויים שונים.
- ההתאמה לסוגי נוירונים שונים תלויה בסימון פלואורסצנטי ובנגישות של הנוירונים המטרה in vivo.
- מגבלות מעשיות כוללות נזק פריפריאלי פוטנציאלי כתוצאה מהספק לייזר שאינו מיושר, ושונות בדירוג הרגנרציה ללא הערכה עיוורת.
