התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא
August 30th, 2007
אנו מתארים פרוטוקול עבור microfabrication של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic כי ניתן להפיק הדרגתיים במרחב ובזמן ב microenvironment מוגדרים היטב. בגישה זו, המכשיר שיפוע מניבות microfluidic ניתן להשתמש כדי ללמוד נדידת תאים מכוונת, embryogenesis, ריפוי פצעים, ועל גרורות סרטניות.
שמי ג'יאנג. אני עמית פוסטר בהרווארד וב-MIT בריאות, מדע וטכנולוגיה. שמי אמיר מנצ'י ואני סטודנט לתואר ראשון במעבדת SANE בהרווארד, MIT, המחלקה למדעי הבריאות והטכנולוגיה.
שקופית זו מציגה את תהליך התוכנית כיצד לייצר את המכשיר, כך שאני פשוט SUA 50 ציפוי סיבוב על גבי אדי סיליקון ואז מניח מסכה במקום נוסף על גבי אדי סיליקון ואז חשיפה ל-uuv ומתפתח. סוף סוף נוכל להשיג, לשים את הכרית הזו על אדי הסיליקון. לאחר מכן אנחנו יכולים פשוט להטיל את ה-PDMS ואז לזחול ולאפות ולאגרוף קטן ואז אנחנו יכולים פשוט לקשור את החיבור בין מכשיר ה-PDMS לבין החיבור הישר באמצעות פלזמת החמצן.
אוקיי, אנחנו עכשיו בחדר המיקרו-ייצור בתוך המעבדה ואנחנו הולכים להתחיל ביצירת כמה שכבות PDMS. מה שאני מתכוון ב-PDMS, המונח המדעי האמיתי הוא פולימתיל סובוקסן והוא פולימר אורגני. זהו הפולימר האורגני מבוסס הסיליקון הנפוץ ביותר.
זו למעשה תערובת של שני דברים שונים היא תערובת של בסיס אלסטומר סיליקון וגם חומר ריפוי אלסטומר סיליקון. אז היחס הוא 10 של בסיס ואחד של חומר ריפוי. אנו זקוקים לכ-10 גרם של בסיס ולכן בהתאם לכך אנו זקוקים לגרם אחד של חומר ריפוי אלסטומר ואני אנסה לערבב את הבסיס הזה ואת חומר הריפוי הלביש אחד לשני.
אני אשתמש בפיפטים. אז עכשיו כשהתערובת מוכנה, אני הולך לשפוך אותה על גבי פרוסת הסיליקון. אז הרעיון הוא שלפרוסות הסיליקון האלה יש כמה דוגמאות מעליהם.
הם למעשה עוזרים לפולימר ה-PDMS הזה לקבל את הדפוס ואנחנו משתמשים בתבניות האלה כדי שיהיו לנו תעלות וחריצים או כל תבנית אחרת שאנחנו צריכים על הפולימרים האלה. אז השלב הבא הוא מכיוון שיש לנו הרבה בועות בתוך התערובת הזו, אנו הולכים לנסות לשים אותה בתוך ואקום כדי להימנע מהבועות האלה בתוך הפולימר שלנו. אני הולך להניח את ג'לי ה-PDMS על פרוסת הסיליקון בתוך תא הוואקום.
אני הולך לסגור את החדר ואני הולך לפתוח את הוואקום. לאחר שהבועות נעלמות, אולי ככמה דקות, נכניס אותו לתנור למשך הלילה, שזה בערך 70 מעלות צלזיוס וזה יגרום להן להתמצק. הדפוס שאני רוצה שתשימו לב אליו הוא שלוש מלחמות המילואים השונות הללו על מנת ליצור שיפועים כך שיהיה לנו אפס ריכוז בצד אחד ותהיה לנו כמות מסוימת של ריכוז בצד הזה ונתקדם באופן אחיד לכיוון זה ונעשה אגרוף קטן בצד השני, שיהיה המוצא שלנו במקרה הזה.
השלב הבא הוא לחתוך את אחד מהדפוסים הללו ולהעביר לצלחת פטריוט, כאשר משטחי התבנית פונים כלפי מעלה. אז אני מקווה שתוכלו לראות את שלושת הכניסה והיציאה האחת שהסברתי לכם על הדפוסים האלה. נשתמש באגרופים קטנים לכניסה שלנו כדי שנוכל להשתמש בצינורות פוליאתילן ואני הולך להשתמש באגרופים גדולים ליציאה שלי כדי לנהל מלחמת מילואים.
אז נתחיל עם המפרץ הראשון. אני הולך לעשות אגרוף, אותו דבר עם השני וגם עוד אגרוף קטן לשלישי. השלב האחרון הוא לעשות אגרוף גדול באאוטלט.
אז ברגע שנסיים, יש לנו שכבת A-P-D-M-S, שהיא השכבה העליונה ואני הולך להשתמש בשכבת זכוכית נוספת בתחתית. והמיקרו שקופיות האלה הולכות להיות השכבה התחתונה שלי במכשירי המיקרו פוליק. עכשיו אנחנו בחדר המיקרו-ייצור ויש לי אחת ושכבת PDMS אחת ואני רוצה לחבר אותן אחת לשנייה.
מה שאנחנו הולכים להשתמש בו עכשיו הוא מכונה שנקראת מנקה פלזמה. מה שהולך לקרות בתוך החדר הוא שהפלזמה עוזרת לשבור את איזון פני השטח החלש ולהחליף אותם בקבוצות כימיות תגובתיות מאוד וגם פני השטח יתבררו למעשה כהידרופיליים. מה שהולך לקרות כרגע הוא שאני הולך לקחת את תבנית ה-PDMS, שהייתה השכבה העליונה והיו בה כמה תעלות ואני אוציא את הסרט ששמתי קודם כדי למנוע חיבור אבק לתבנית שלנו.
אני הולך למקם אותו בתוך החדר. הדבר הבא שצריך לעשות הוא שיש לי שכבת זכוכית, שהיא שקופית מיקרוסקופ, וזו הולכת להיות השכבה התחתונה שלנו בתוך המכשיר. אז אני הולך למקם גם את זה בתוך החדר.
ואני סוגר את התא עד הסוף, ברגע שהוא סגור, קודם כל ואז שואב ואז אנחנו צריכים לחזור למכונה הזו בעוד כחמש דקות. מה שאני אעשה זה שאני רוצה לכבות את המכונה. אז אני מכבה קודם את המשאבה ואת החשמל לאחר מכן ואני פותח את החדר.
צליל זה נובע למעשה מהלחץ השלילי שהופעל במהלך התהליך בתוך החדר. אז אני אוציא את השכבות השונות ואני רוצה לחבר אותן יחד. מכיוון שהזכוכית היא השכבה התחתונה, אני אקח אותה ביד שמאל ואתקן אותה ואקח את שכבת ה-PDMS ומניח אותה על גבי שכבת הזכוכית שלי.
אבל מכיוון שלמעשה הדפוסים פונים כלפי מעלה כרגע, אני אהפוך את שכבת ה-PDMS. אני מניח אותו על הזכוכית לאחר לחיצה עליהם יחד. הם מחוברים בקלות רבה וחלק מהיתרון של תהליך טיפול בפלזמה זה הוא חוזק ההדבקה והקביעות.
ככה זה נראה בסוף. אז שוב, אלה המפרצונים שלנו וזה נמצא בשקע שלי ואנחנו מוכנים להמשיך לשלב הבא. הבישול הסיבי בתוך המכשיר ולאחר מכן לחממה למשך שעה ואז להוציא דגימת SIM מהחממה לאחר שעה ואז לשים את מזון תרבית הדגים ואז להכין את הפתרון.
כדי ליצור את פתרון ה- EGF, פשוט שמנו את מדיית תרבית שתי הטחנה כ- Azure מכיוון שפשוט שמנו את ה- 15 ננוגרם ל- EGF ו- 10 מיקרומולר 50 D להפעיל את הפתרון הזה קשה מאוד כדי לדמיין את שיפוע ה- EGF על פני הערוץ. ואז אנחנו פשוט לוקחים מדיה של שני מילים, מדיה וירטואלית ושמים כאן עוד שני מיליון. שתי הישיבה הללו רק תרבויות רגילות, עירוי תרבית רגיל ורגיל במכשיר.
אז אני מסיר את הבועה, אני מתחבר שוב, זו גם בועה ניידת M יורדת שוב. ואז אני פשוט משתמש ב-15 ננוגרם er EGF ו-10 מיקרו-מולרי ושני מיליון מדיה מהלקחת, הדגימה למזרק ואז אתה יודע את הבועה. ואז פשוט להחליף פתרון, לעבור בחזרה.
הפתרון הוא להיכנס למזרק מסוג הגז ולדחוף את SH במשך מספר פעמים כדי להסיר את הבועה, תמיסת מזרק כל המתגים מגיעה לכאן תחילה ואז מעבירים את המוט ואת התמיסה דרך המוט המשולש ולא וצינורות והתמיסה יוצאים מהצינור. ואז אחרי התערובת, הפתרון יוצא, אנחנו יכולים פשוט להכניס את הצינור למכשיר My Predict ואז כל שלושת הפתרונות זהים. אתה יכול פשוט להתחבר בעדינות, לחבר את הרשת של תעלת העירוי.
אז סוף סוף שניים הם מדיה תרבותית רגילה. האחת היא מדיה תרבותית עם EGF ולאשר את פרופיל השיפוע של EGF. זה התא ברשת, תא ברשת.
זה יגרום לשקע התא, כך ששיפוע ייווצר באמצעות ערוץ שלושת הרכזות ואז ייצור את הגראד בתוך אזור התא. אז בדרך כלל מה שאני רוצה זה פשוט לעשות את הישיבה בתא, מתלה תאים, להושיב את השקע, ואז אנחנו יכולים פשוט לשאוב בעדינות ברשת ואז התא זורם דרך אזור התא יושב אוטומטית והם מתיישבים על הציפוי ואז מוודאים שהתא מתפשט לחלוטין. ואחרי שנעשה, אחרי שווידאנו שהתאים מתפשטים לחלוטין, אנחנו יכולים פשוט להתחיל להחדיר ואז לחקור את נדידת התאים באמצעות מכשיר יצירת הרדיו.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לייצור מיקרו-פאבריקציה של מכשיר מיקרו-נוזלי המייצר גרדיאנט. מכשיר זה יכול ליצור גרדיאנטים מרחביים ומרחיבים בסביבה מיקרו-סביבתית מוגדרת היטב, ומקל על המחקר של תהליכים ביולוגיים שונים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרו-נוזלים
- ביולוגיה תאית
- הנדסה ביו-רפואית
רקע
- מכשירים מיקרו-נוזליים הם חיוניים לחקר התנהגות תאים בסביבות מבוקרות.
- יצירת גרדיאנטים היא חיונית להבנת נדידת תאים מכוונת ותופעות ביולוגיות אחרות.
- יישומים כוללים מחקר בהתפתחות עוברית, ריפוי פצעים ומטסטזות סרטן.
- טכניקות מיקרו-פאבריקציה הן חיוניות לפיתוח מכשירים אלו.
מטרת המחקר
- לפתח מכשיר מיקרו-נוזלי המסוגל ליצור גרדיאנטים.
- לספק פרוטוקול לחוקרים לייצור מכשירים כאלה.
- לאפשר מחקרים על תהליכים ביולוגיים שונים המושפעים מגרדיאנטים.
שיטות שימשו
- ציפוי סיבוב של SU-50 על אדים של סיליקון.
- חשיפה ל-UV דרך מסכה לצורך יצירת תבנית.
- פיתוח המכשיר המעוצב.
- הדבקה של PDMS לזכוכית באמצעות פלזמת חמצן.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול יוצר בהצלחה מכשיר מייצר גרדיאנטים תפקודי.
- הוכחת יכולת לחקר נדידת תאים מכוונת.
- יישומים פוטנציאליים בתחומים שונים של מחקר ביולוגי.
- מאפשר חקירה נוספת של תהליכים ביולוגיים מורכבים.
מסקנות
- המכשיר המיקרו-נוזלי הוא כלי חשוב לחוקרים.
- הוא מאפשר שליטה מדויקת על הסביבה המיקרו-סביבתית.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל את הטכנולוגיה הזו לתובנות ביולוגיות מתקדמות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Gradient-generating microfluidic devices enable precise spatial control of soluble factors, supporting high-confidence interrogation of cell migration and signaling pathways in early discovery. This platform enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking by providing reproducible, quantitative environments for cellular response assessment. Integration of such devices into discovery workflows accelerates portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions for cell behavior-modulating therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of cell migration in response to defined growth factor gradients.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the effects of specific soluble cues on cellular behavior.
- Facilitates functional target validation through reproducible, controlled microenvironments.
- Improves predictive confidence for pathway interrogation and early-stage go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible gradient profiles for assay development and optimization.
- Enables high-throughput, quantitative analysis of cell motility and orientation under variable conditions.
- Supports preparation of validated biological systems for downstream compound screening workflows.
- Enhances assay scalability and platform reuse across multiple cell types and targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro migration assays with disease-relevant processes such as wound healing and metastasis.
- Supports translational biomarker identification by enabling quantitative tracking of cell responses.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation for cell migration-modulating candidates.
- Reduces biological risk by enabling mechanistic insights prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic gradient platform fits within the early discovery to lead identification continuum, supporting both hypothesis-driven target validation and assay development for cell migration studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by isolating growth factor effects on cell migration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative cell tracking data to compare migration under defined gradient conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic studies with disease-relevant migration models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse cell types and soluble factors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell migration studies.
- Operational Value: Standardizes gradient generation and assay reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell migration-modulating therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication and microfluidic device operation.
- Needs access to PDMS casting, plasma bonding, and fluorescence imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of gradient profiles and cell tracking analytics.
- Adaptable to various cell types and soluble factors with protocol optimization.
- Gradient stability and device throughput may limit scalability for some applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
7:13
Application of reagents
3:20
Cutting layers of microfluidic device
6:55
Experiment: effect of EGF gradient on cell migration
3:33
Creating channel inlet and outlet
0:21
Microfabrication of microfluidic device
3:19
Assembly of microfluidic device
1:49
Patterning PDMS molds
2:20
Removing bubbles by vacuum
3:59
Bonding the microfluidic device layers
9:49
Experiment: cell migration
0:05
Introduction
0:56
Preparation of PDMS mixture
