מערכת culturing איריס תאים פיגמנט אפיתל לחקר התחדשות עדשה של ניוט
22 ביוני 2011
ב סלמנדרה, העדשה מחדש תמיד מתוך איריס הגבי על ידי transdifferentiation של תאים פיגמנט אפיתל קשתית (IPEs). כאן אנו מתארים את הליך הגבי ו הגחון התרבות תאים סלמנדרה פטרוכימיים ההשתלה שלהם לעין סלמנדרה. התאים המושתלים נלמדים מכן על ידי חתך רקמות אימונוהיסטוכימיה.
המטרה הכללית של הליך זה היא לגדל תאי אפיתל פיגמנטיים של הקשת כדי לחקור את התחדשות העדשה בטריטון. דבר זה מושג תחילה על ידי הרדמה של טריטון בתמיסת שינה והוצאת העיניים.
השלב השני של הפרוצדורה הוא בידוד תאי אפיתל פיגמנטיים של הקשת מרקמת העין, תחילה על ידי הסרת רקמת הרשתית, ולאחר מכן חיתוך של חלקי קשתית מהקרנית לחצאים דורסליים (גביים) וונטרליים (בטניים). תאי הקשת מופרדים לאחר מכן מהסטרומה ומגודלים in vitro למשך שבועיים. לאחר שבועיים של תרבית, תאי ה-IPE מרוכזים ואז מושתלים לתוך רקמה מקבלת שעברה אופטימיזציה.
לאחר חודש של החלמה, היסטולוגיה חושפת את פוטנציאל התחדשות העדשה של תאי IPE גבונים ובטניים. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית בשלבי תרבית התאים וההשתלה, שקשים ללמידה כיוון שהם דורשים מאה מיומנויות של מיקרו-דיסקציה וניתוחים. התחילו בהרדמה של לפחות שבעה עכברים עירומים באמצעות 0.1% Ethel three amino benzoate methane sul acid, הסירו את עיניהם בניתוח באמצעות פינצטה ומספריים כירורגיים על ידי חיתוך העפעף יחד עם הלחמית. לאחר מכן, חתכו את העצב האופטי.
כעת העבירו במהירות את העיניים שהוצאו למנדף וסטריליזציה שלהן באתנול של lugo למשך שלוש שניות. לאחר מכן, שטפו את העיניים פעמיים בתמיסת Hank ללא סידן ומגנזיום. העבירו אותן לתמיסת hanks רעננה והמשיכו בניתוח.
באמצעות סקלפל, בצעו חתך בעין. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לגזור מסביב לשולי הקרנית. הסירו את העדשה וחתכו את שארית רקמת הרשתית יחד עם הלובנה.
העבירו את קומפלקסי הקשת והקרנית לצלוחית עם תמיסת hanks טרייה באמצעות סכין מנתחים מספר 15. הפרידו את הקומפלקסים לחצאיהם הדורסליים והוונטרליים. ניתן לזהות את הקשת הדורסלית והוונטרלית לפי נוכחות של נקודות שחורות על הסקלרה בצד הדורסלי, וחתך בצורת V בקשת הוונטרלית.
הפרידו את הקשתית הגחונית (ventral iris) מהקשתית הגבנית (dorsal iris). אספו את חלקי הקשתית לצלחון של 35 מילימטר המכיל 1 מיליליטר של תמיסת L 15. שמרו את החצאים הגבניים והגחוניים בצלחונים נפרדים.
כעת הוסיפו 150 µL של תמיסת dispa לצלחות, והדגירו אותן למשך שעתיים בטמפרטורה של 27 °C. כדי לאסוף תאי IPE מהסטרומה, קלפו בעדינות את תאי ה-IPE מכל רגעי הרקמה שנאספו בעזרת פינצטה.
בשלב הבא, העבירו את תאי ה-IPE למבחנה של 1.5 מיליליטר וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 1000 RPM למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, והסירו את הנוזל העליון (supernatant). השהו מחדש את המשקע במיליליטר אחד של תמיסת Hanks, וחזרו על הסבב בצנטריפוגה כדי להפריד את התאים. הסירו את תמיסת ה-Hanks והשהו מחדש את המשקע.
במיליליטר אחד של תמיסת טריפסין בריכוז 1:250, הדגרימו למשך שעתיים בטמפרטורה של 27 °C. כדי לשטוף את התאים, בצעו צנטריפוגה והסירו את הטריפסין. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת L 15 ובצעו צנטריפוגה שוב; חזרו על השטיפה פעם נוספת והחליפו ב-800 µL של L 15 טרי, והעבירו בעדינות את התאים לתמיסה באמצעות פיפטה. כעת, זרעו את התאים בלוחות 24 בארות מצופים בקולגן.
התבניות הרגילות משבעה Ns הן ארבע בארות של תאים גביים (dorsal) וארבע בארות של תאים בטניים (ventral). דגרו את הפיתה למשך שבועיים בטמפרטורה של 27 °C לאחר שבועיים. כפי שמוצג כאן, ניתן להוות (transfect) את ה-IPE עם גנים כדי לבחון את תפקודם ברגנרציה של עדשה.
תרבית דו-שבועית זו של תאי IPE ונטרליים מציגה מורפולוגיה זהה לזו של התאים דורסליים. שימו לב שהפיגמנטציה נשמרת עד לשלב זה הן בתאי הקשת הדורסליים והן בתאים הוונטרליים. לפני השתלת תאי ה-IPE, יש לצבור אותם על ידי הוספת 20 µL של dyse ב-400 µL של מצע תרבית טרי לתאים, לסובב את הצלחת בעדינות ולהשאיר את התאים למשך הלילה באינקובטור בטמפרטורה של 27 °C.
ביום למחרת, השתמש בפיפטינג עדין כדי לשחרר את התאים, ולאחר מכן העבר אותם למבחנות של 1.5 milliliter. כעת שטוף את התאים על ידי סנטריפוגציה של המבחנות והחלפת הנוזל העליון ב-1 milliliter של L 15. חזור על שלב זה פעמיים. השתמש ב-10 microliters של תגלי התאים כדי לחשב את מספר התאים בשיטות סטנדרטיות.
לאחר החישוב, הכינו 3000 עד 5,000 תאים ב-200 µL של L 15 לכל אגרגט. כעת סבבו את התאים בצנטריפוגה והדגירו אותם למשך 48 שעות. בטמפרטורה של 27 °C ניתן כעת להשתיל את התאים בחיה מקבלת.
התחילו בהרדמה של דגיג בוגר בתמיסת שינה עד להפסקת התנועה. כעת, השתמשו בלהב סקאלפל כדי ליצור חריץ בקרניית העין. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, הסירו את העדשה.
לאחר הסרת העדשה, מקם את צבר תאי ה-IPE ממש מתחת לרקמת הקרנית בצדו הגבתי (ventral) של העין. כעת החזר את הסלמנדרה למכל separate ונחה אותה להחלים. במהלך זמן זה, טיפל בסלמנדרה בזהירות כדי למנוע פגיעה ברקמה המחלימה.
התאים המושתלים זקוקים לחודש כדי להתחדש לעדשה חדשה. לאחר חלוף חודש, הוצא את העיניים החדשות המושתלות בתאי האגרגט וקבע את הרקמה. באמצעות פרוטוקול התייבשות סטנדרטי, ניתן להטמיע את הרקמה המקובעת בתבניות הטמעה המתאימות לחיתוך של פלחים בעובי 15 מיקרומטר, אשר ייחתכו וייצבעו כראוי.
לאחר השתלת האגרגט לתוך עין חדשה, האגרגט מתאי ה-IPE הגביים משרה היווצרות עדשה חדשה. השראת עדשת המארח מהקשת הגבית נצפתה גם בעין עם השתבל הבטני. לא נצפתה השראת עדשה מהאגרגט שהוכן מתאי ה-IPE הבטניים; כאשר הגן six 3 מובע באופן יתר, נצפתה השראת עדשה מהאגרגט הבטני בנוכחות חומצה רטינואית.
בנוסף, נצפתה השראה של עדשה במארח מהקשת הגבית של העין לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום התחדשות העדשה לבחון את תפקידם של גנים שונים באופן מחודש.
סקירה כללית
מחקר זה מפרט שיטה לתרבית של תאי אפיתל פיגמנטיים של הקשתית (IPEs) מטרפדונים, במטרה לחקור את התחדשות העדשה. הפרוצדורה כוללת בידוד והשתלה של תאים אלו לעין של הטרפדון, ולאחריהם ניתוח היסטולוגי להערכת היווצרות העדשה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה רגנרטיבית
- טכניקות תרביות תאים
רקע
- לסלמנדרות יש את היכולת לה再生 עדשות מהתאים של הקשת הגבית.
- תאי אפיתל פיגמנטיים של הקשת (IPEs) ממלאים תפקיד מכריע בתהליך רגנרציה זה.
- הבנת המנגנונים של רגנרציית העדשה יכולה לספק תובנות עבור הרפואה הרגנרטיבית.
- מחקרים קודמים הראו את הפוטנציאל של IPEs ביצירת עדשות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לתרבית של IPEs גביים ובטניים מטרטון.
- בחינת יכולות התחדשות העדשה של תאים אלו בתרבית.
- מתן הדגמה חזותית של טכניקות תרבית התאים וההשתלה.
שיטות שהשתמשו בהן
- הרדמה והסרה כירורגית של עיני טריטון.
- בידוד תאי IPE ממרכיבי קשתית גבונים ובטניים.
- תרבית in vitro של תאי IPE למשך שבועיים.
- השתלה של תאי IPE מצברים אל תוך עיני טריטון רסיפיינט.
תוצאות עיקריות
- ניתוח היסטולוגי העלה רגנרציה מוצלחת של העדשה מהשתלות של IPE גבי.
- לא נצפתה השראה של עדשה מתאי IPE בטניים, אלא אם כן גנים ספציפיים בויעו ביטוי יתר.
- המחקר הדגים את חשיבותם של IPEs גביים בהיווצרות העדשה.
- תאי IPE שעברו טרנספקציה שימרו את המורפולוגיה והפיגמנטציה שלהם במהלך התרבית.
מסקנות
- השיטה שבוצעה יעילה לחקר התחדשות העדשה בטרטון.
- מחקרים עתידיים יכולים לבחון את הגורמים הגנטיים המשפיעים על התחדשות העדשה.
- טכניקה זו עשויה לסייע בהבנת תהליכי התחדשות במינים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של מסלולי התחדשות העדשה על ידי אספקת מערכת in vitro הניתנת לשחזור לבחינת התפקוד של תאי אפיתל פיגמנטיים של הקשת הגב (dorsal) לעומת הבטן (ventral). היא תומכת בתיקוף מטרות בביולוגיה רגנרטיבית באמצעות בידוד משתנים השולטים ביכולת הטרנס-דיפרנציאציה. המערכת מציעה ערך ניבוי לתיעדוף מטרות גנטיות ומולקולריות בצינורות גילוי פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי בדיקת היכולת להיווצרות עדשה של תאי IPE מזן תרביות גבי (dorsal) ובטני (ventral).
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות בדיקות של רכיב מחדש (reaggregation) והשתלה המשחזרות את פוטנציאל הרגנרציה in vivo.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי זיהוי המניפולציות הגנטיות המשחזרות את התפקוד הרגנרטיבי באגרגטים של IPE בטני.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצר אגרגטים סטנדרטיים של IPE המתאימים לסריקת תרכובות או סריקה גנטית במערכת רלוונטית למחלה.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה של השראת עדשה כקריאה תפקודית לאחר השתלה והחלמה.
- יכולת הרחבה (Scalability): תומך בתהליכי זריעה בלוחות רב-בארים ואגרגציה לבדיקה מקבילה של תנאים ניסיוניים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תהליך רגנרטיבי בעל פולריות גבית-בטנית (dorsal-ventral) ברורה, ומספק תובנות לגבי רמזים מיקומיים בתיקון רקמות.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאים מתרביות in vitro לתוצאות in vivo באמצעות תיקוף היסטולוגי של היווצרות העדשה.
- הסרת סיכונים מכניסטית: מבהירה תרומות ספציפיות של גנים לרגנרציה, כגון תפקידם של six3 וחומצה רטינואית בתכנות מחדש של IPE ונטראלי.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת תיקוף של מטרות רגנרציה המבוסס על היפותזה, לפני המעבר לאופטימיזציית מוביל או למחקרי יעילות פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים באמצעות בידוד תאי IPE לבדיקת פוטנציאל של טרנס-דיפרנציאציה תחת תנאים מבוקרים.
- סינון: מספקת אגרגטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת משנים גנטיים או פרמקולוגיים של התחדשות העדשה.
- אנליטיקה: מייצרת נקודות סיום היסטולוגיות המאפשרות השוואה של יכולת ההתחדשות בין קבוצות ניסוייות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פנוטיפים in vitro לשחזור רקמות in vivo, ובכך תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון.
- שימוש חוזר בארגון: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לחקר מנגנוני התחדשות תחת הפרעות גנטיות או סביבתיות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק תובנה מכיניסטית לגבי פלסטיות תאי הקשת ומפחית עמימות בתיקוף מטרות עבור רגנרציה.
- ערך תפעולי: מספק נהלי תרבית תאים והשתלה סטנדרטיים וניתנים להרחבה, עם לוחות זמנים מוגדרים של שבועיים לתרבית וחודש אחד להחלמה.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי אישור אם התערבויות מולקולריים משחזרות תפקוד רגנרטיבי בסוגי תאים שאינם מאפשרים זאת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מטרות מותאם סיכונים, בהתבסס על יכולתן להשרות היווצרות עדשה באגרגטים של IPE ונטראלי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה, בדיסקציה של רקמות ובטיפול סטרילי בתאים לצורך בידוד ואגרגציה של הקשתית.
- תלוי בשימוש בצלחות מצופות קולגן, מצע L15, טריפסין וחומרי דיסוציאציה להשגת תנובה עקבית של תאי IPE.
- מחייב פרוטוקולי אגרגציה סטנדרטיים תוך שימוש בצבע ודגירה מבוקרת כדי להבטיח היווצרות רפרודוקבילית של כדור תאים (pellet).
- דורש מומחיות בעיבוד היסטולוגי ובחיתוך רקמות להערכת תוצאות התחדשות העדשה חודש לאחר ההשתלה.
- מוגבל על ידי זמינותם של פרטי סלמנדרה (newt) והאתגר הטכני של הפרדה גב-בטן (dorsal-ventral) של הקשתית על בסיס סימנים אנטומיים.
