Name: מערכת culturing איריס תאים פיגמנט אפיתל לחקר התחדשות עדשה של ניוט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: למד שיטת תרבית תאי אפיתל פיגמנט איריס מניוטים לחקר התחדשות עדשה. השיטה כוללת בידוד תאים, תרבית של שבועיים והשתלה לעין מקבלת. ניתוח היסטולוגי מעיד על יכולת התחדשות מבטיחה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH Ey10540 ללטף.

1. איריס תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף העיניים של 7 סלמנדרות (הרדים ב 0.1% אתיל חומצה 3-aminobenzoate מתאן sulfonic שהוכנו PBS) וכן מקום מגנזיום סידן חופשי הנקס פתרון (CMF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה כפפות עבודה למכסה המנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר כדורי העין Lugol's-EtOH למשך 3 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 פעמים ב CMF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עיניים הנקס ולהתחיל לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח אירוס-הקרנית מורכבת להסיר הרשתית העצבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מתחמי לתוך תבשיל חדש של הנקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות # 15 אזמל, מתחמי נפרד לחצאים הגבי ו הגחון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שברי קשתית (הגחון הראשונה) ומניחים בצלחת המכילה 1 מ"ל L-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15% (150 UL) נפח dispase (7.5 יחידות / ריכוז מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 27 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות (צלחת לעטוף עם parafilm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד תאים IPE מ stroma (טריפסין מקום פתרון בשעה 27 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים IPE לתוך צינור 1.5 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל"ד 1000 ב RT (טמפרטורת החדר) למשך 2 דקות, להסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 1 מ"ל הנקס צנטריפוגות ב 1000 סל"ד ב RT במשך 2 דקות, להסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ"ל פתרון טריפסין, דגירה עבור 2 שעות 27 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1000 סל"ד ב RT במשך 2 דקות, להסיר טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ"ל L-15 לשטוף, צנטריפוגה בסל"ד 1000 למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ul 800 L-15, pipet לאט למעלה ולמטה ~ 10 פעמים (יותר מ 12 פעמים מקטין הדבקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים IPE בצלחת 24 קולגן גם לדגור מצופה על 27 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות (בדרך כלל, 4 הגבי ו 4 בארות הגחון מתקבלים 7 סלמנדרות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה תאים מתאימים transfection גן או טיפול עם גורמים כדי לקבוע את תפקידם או גרימת הפרעה התחדשות העדשה. </li></ol> 2. צבירה של תאים איריס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי צלחות המכיל תאים איריס להוסיף 20μl של פתרון dispase עד בינוני 400 מערבולת μl, בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות על 27 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet בעדינות מעלה ומטה כדי לסלק תאים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום התאים לתוך צינור Eppendorf ספין 2 דקות בסל"ד 1000 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני לשטוף ידי הוספת L-15 שלם 1 מ"ל, ספין 2 דקות בסל"ד 1000 ב RT, להסיר בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2000-7000 התאים לכל המצרפי. הוסף ul 200 L-15 לכל המצרפי לתוך צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאים (200 μl) לתוך צינורות חדשים Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין בסל"ד 1000 דקות 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 48 שעות ב 27 ° C. </li></ol> 3. השרשה של תאים Aggregrated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך בקרנית העין סלמנדרה ולהסיר את העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת העדשות, המקום המצרפי תא IPE ממש מתחת רקמת הקרנית בצד הגחוני של העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סלמנדרות נשמרים למשך חודש כדי לאפשר להם לחדש את העדשה. </li></ol> 4. והטבעה של העין ניוט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העיניים סלמנדרה מושתל עם במצטבר ולמקם אותו פוספט בופר סליין (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן ב paraformaldehyde 4% ב 4 ° C למשך לפחות 4 שעות או למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי ב-PBS, 4 ° C למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את זה עם מלח 0.85%: 4 ° C, 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרחץ מלוחים / אתנול (1:1): RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף באתנול 70%: RT, 15 דקות. חזור על זה פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף באתנול 85% אתנול ו 95% ב RT, 30 דקות כל אחד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי ב 100% אתנול: RT, 30 דקות. חזור על זה פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 מעלות צלזיוס או להמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי ב קסילן 100%: RT, 30 דקות. חזור על זה פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו עם קסילן / פרפין (1:1): 60 ° C, 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו עם פרפין 100%: 60 ° C, 20 דקות. חזור על זה עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ הטבעה תבניות. </li></ol> 5. חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 15 מיקרומטר חלקים של העין מוטבע באמצעות microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הסעיפים עין בשקופית מצופה ג'לטין ולהשאיר אותה בשקופית חם. </li></ol> 6. הכתמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שקופיות קסילן במשך 10 דקות. חזור על זה עוד פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה ב: 100%, 95%, 80%, 70%, אתנול 30% עבור כל 1 דקה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים DI לרגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי ב PBS במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי ב PBST (0.2% טריטון X-100 ב PBS) במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי ב PBS במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום חסימת פתרון (נוגדן עיזים 10% משני) במשך שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום הנוגדן העיקרי בין לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף נוגדן ראשוני PBS במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי ב PBST במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי ב PBS במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום נוגדנים משני 2 שעות בחושך (1:100 דילול ב PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי ב-PBS, PBST, ו pbs במשך 15 דקות כל אחד, ואז הר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 7. נציג תוצאות: הליך זה של culturing סלמנדרה irתאים נוצל כדי לחקור את פוטנציאל התחדשות של הגבי לבין תאים IPE הגחון. יתר על כן, אפשר גם ללמוד גנים מסוימים שתורמים כלפי מנגנון התחדשות העדשה בעין סלמנדרה. כאשר תאים בתרבית כבר 2 שבועות (איור 1) הם יכולים להיות transfected ידי הגנים לבחון את תפקידם של התחדשות העדשה. עניין מיוחד הם גנים שעשויים לגרום הקשתית הגחון. מאז תאים הגחון קשתית לא יכול transdifferentiate העדשה (איור 2) הפונקציה אינדוקטיבי של הגן מועמד ניתן ללמוד. בעבר, השימוש בטכניקה זו הראינו כי כאשר שש 3 באה לידי ביטוי על פני בנוכחות אינדוקציה החומצה הרטינואית העדשה נצפתה מן הגחון איריס 6. באיור 3 ניתן לראות כי במצטבר הגחון איריס הולידה עדשה בוגרת הבדיל (ראש חץ), לא שונה מאשר עדשות המארח של איריס הגבי (חץ). <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. א) תאים הגב איריס פיגמנט אפיתל בתרבית במבחנה לתקופה של 2 שבועות. ב) הגחון התאים בקשתית פיגמנט אפיתל בתרבית במבחנה לתקופה של 2 שבועות. שים לב פיגמנטציה נמשכת עד לשלב זה הן הגבי ו הגחון התאים בקשתית. <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. התחדשות היכולת של התאים בתרבית IPE. א) עדשה אינדוקציה מן המצרפי הגבי תא IPE (ראש חץ). מארח העדשה אינדוקציה מן איריס הגבי (חץ), די: איריס הגבי, vi: איריס הגחון, le: אפיתל העדשה, אם: סיבי העדשה. ב) העדר אינדוקציה העדשה המצרפי הגחון תא IPE (ראש חץ). מארח העדשה אינדוקציה מן איריס הגבי (חץ). <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. אינדוקציה עדשה מ המצרפי הגחון transfected עם שישה-3 ו שטופלו החומצה הרטינואית. מארח העדשה אינדוקציה מן איריס הגבי (חץ). עדשה אינדוקציה מן המצרפי הגחוני (ראש חץ).

<ol><li>Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration in vertebrates.</a> Dev Biol. 221, 273-284 (2000).</li>
<li>Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newt%27s+eye+view+of+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A newt's eye view of lens regeneration.</a> Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).</li>
<li>Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+regeneration+at+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Eye regeneration at the molecular age.</a> Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).</li>
<li>Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+between+dorsal+and+ventral+iris+in+lens+producing+potency+in+normal+lens+regeneration+is+maintained+after+dissociation+and+reaggregation+of+cells+from+the+adult+newt%2C+Cynops+pyrrhogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).</li>
<li>Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+system+for+functional+gene+analysis+in+adult+amphibian+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration.</a> Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).</li>
<li>Grogg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+inhibition-driven+regulation+of+six-3+underlies+induction+of+newt+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration.</a> Nature. 438, 858-862 (2005).</li>
<li>Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+Newt+Lens+Regeneration%3A+Specific+Control+of+Proliferation+and+Evidence+for+miRNA+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking.</a> PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).</li>
<li>Madhavan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Maki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-type+linker+histone+B4+is+required+for+transdifferentiation+of+somatic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo.</a> FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה הקימה במערכת במבחנה ללמוד התחדשות מנגנוני העדשה סלמנדרות. מאז אגרגטים (הגבי או הגחון פעל בנאמנות שלהם בהתנהגות vivo במהלך רגנרציה בטכניקה זו יכולה להקל על מאמץ אדיר נדרש transgenesis ב סלמנדרות והוא יכול לשמש למטרות רווח של הפונקציה, כמו גם אובדן של ניסויים פונקציה 7,8,9. כמו כן , אגרגטים או אירוסים בכללותו יכול בקלות להיות מטופלים עם גורמי גדילה ולבחון את השפעתם כמתואר בפרוטוקול זה. לדוגמה את התפקיד של BMP מסלול נחקרה באמצעות טכניקה זו 6.

<table><tbody><tr><td>לוגול&amp;rsquo;התמיסה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6146</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מתנסולפונית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>דיספאז (Dispase)</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין 1:250</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>L-15 (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4386</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין סולפט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>100x, 15160</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone (תמיסת amphotericin B)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>פלטה בעלת 24 בארות מצופה קולגן</td><td>BD Biosciences</td><td>354408</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת culturing איריס תאים פיגמנט אפיתל לחקר התחדשות עדשה של ניוט

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

סלמנדרות כמו סלמנדרה ו האמביסטומה להחזיק את היכולת להתחדש רבים של חלקים שאבדו שלה הגוף כגון גפיים, זנב עם חוט השדרה עיניים, מוח, לב, הלסת 1. באופן ספציפי, סלמנדרות ייחודיים ביכולתה העדשה התחדשות. לאחר הסרת העדשות, תאים IPE של הקשתית הגב transdifferentiate לתאי העדשה ולבסוף טופס עדשה חדשה בעוד כחודש 2,3. מאפיין זה של התחדשות לעולם לא הוצגו על ידי התאים הגחון איריס. פוטנציאל התחדשות של תאים קשתית ניתן ללמוד על ידי ביצוע השתלות של תאים במבחנה IPE תרבותי. עבור התרבות, התאים הגבי ו הגחון איריס מבודדים הראשון בעין ותרבותי בנפרד עבור פרק זמן של שבועות 2 (איור 1). תאים אלה בתרבית הם reaggregated ו מושתל חזרה העין סלמנדרה. מחקרים שנעשו בעבר הראו כי reaggregate הגבי שומרת יכולת להרכיב עדשות שלה בעוד המצרפי הגחון אינו טופס עדשה, השחזור, וכך בתהליך vivo (איור 2) 4,5. שיטה זו של קביעת פוטנציאל התחדשות של תאים הגבי ו הגחון איריס שימושית מאוד ללמוד את התפקיד של גנים וחלבונים המעורבים התחדשות העדשה.

ב סלמנדרה, העדשה מחדש תמיד מתוך איריס הגבי על ידי transdifferentiation של תאים פיגמנט אפיתל קשתית (IPEs). כאן אנו מתארים את הליך הגבי ו הגחון התרבות תאים סלמנדרה פטרוכימיים ההשתלה שלהם לעין סלמנדרה. התאים המושתלים נלמדים מכן על ידי חתך רקמות אימונוהיסטוכימיה.

סלמנדרות, כגון טריטון ואקסולוטל, בעלות את היכולת לה 재생ר חלקים רבים אבודים מגופן, כגון גפיים, הזנב עם חוט השדרה, עין, מוח...

המטרה הכללית של הליך זה היא לגדל תאי אפיתל פיגמנטיים של הקשת כדי לחקור את התחדשות העדשה בטריטון. דבר זה מושג תחילה על ידי הרדמה של טריטון בתמיסת שינה והוצאת העיניים.השלב השני של הפרוצדורה הוא בידוד תאי אפיתל פיגמנטיים של הקשת מרקמת העין, תחילה על ידי הסרת רקמת הרשתית, ולאחר מכן חיתוך של חלקי קשתית מהקרנית לחצאים דורסליים (גביים) וונטרליים (בטניים). תאי הקשת מופרדים לאחר מכן מהסטרומה ומגודלים in vitro למשך שבועיים. לאחר שבועיים של תרבית, תאי ה-IPE מרוכזים ואז מושתלים לתוך רקמה מקבלת שעברה אופטימיזציה.לאחר חודש של החלמה, היסטולוגיה חושפת את פוטנציאל התחדשות העדשה של תאי IPE גבונים ובטניים. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית בשלבי תרבית התאים וההשתלה, שקשים ללמידה כיוון שהם דורשים מאה מיומנויות של מיקרו-דיסקציה וניתוחים. התחילו בהרדמה של לפחות שבעה עכברים עירומים באמצעות 0.1% Ethel three amino benzoate methane sul acid, הסירו את עיניהם בניתוח באמצעות פינצטה ומספריים כירורגיים על ידי חיתוך העפעף יחד עם הלחמית. לאחר מכן, חתכו את העצב האופטי.כעת העבירו במהירות את העיניים שהוצאו למנדף וסטריליזציה שלהן באתנול של lugo למשך שלוש שניות. לאחר מכן, שטפו את העיניים פעמיים בתמיסת Hank ללא סידן ומגנזיום. העבירו אותן לתמיסת hanks רעננה והמשיכו בניתוח.באמצעות סקלפל, בצעו חתך בעין. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לגזור מסביב לשולי הקרנית. הסירו את העדשה וחתכו את שארית רקמת הרשתית יחד עם הלובנה.העבירו את קומפלקסי הקשת והקרנית לצלוחית עם תמיסת hanks טרייה באמצעות סכין מנתחים מספר 15. הפרידו את הקומפלקסים לחצאיהם הדורסליים והוונטרליים. ניתן לזהות את הקשת הדורסלית והוונטרלית לפי נוכחות של נקודות שחורות על הסקלרה בצד הדורסלי, וחתך בצורת V בקשת הוונטרלית.הפרידו את הקשתית הגחונית (ventral iris) מהקשתית הגבנית (dorsal iris). אספו את חלקי הקשתית לצלחון של 35 מילימטר המכיל 1 מיליליטר של תמיסת L 15. שמרו את החצאים הגבניים והגחוניים בצלחונים נפרדים.כעת הוסיפו 150 µL של תמיסת dispa לצלחות, והדגירו אותן למשך שעתיים בטמפרטורה של 27 °C. כדי לאסוף תאי IPE מהסטרומה, קלפו בעדינות את תאי ה-IPE מכל רגעי הרקמה שנאספו בעזרת פינצטה.בשלב הבא, העבירו את תאי ה-IPE למבחנה של 1.5 מיליליטר וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 1000 RPM למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, והסירו את הנוזל העליון (supernatant). השהו מחדש את המשקע במיליליטר אחד של תמיסת Hanks, וחזרו על הסבב בצנטריפוגה כדי להפריד את התאים. הסירו את תמיסת ה-Hanks והשהו מחדש את המשקע.במיליליטר אחד של תמיסת טריפסין בריכוז 1:250, הדגרימו למשך שעתיים בטמפרטורה של 27 °C. כדי לשטוף את התאים, בצעו צנטריפוגה והסירו את הטריפסין. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת L 15 ובצעו צנטריפוגה שוב; חזרו על השטיפה פעם נוספת והחליפו ב-800 µL של L 15 טרי, והעבירו בעדינות את התאים לתמיסה באמצעות פיפטה. כעת, זרעו את התאים בלוחות 24 בארות מצופים בקולגן.התבניות הרגילות משבעה Ns הן ארבע בארות של תאים גביים (dorsal) וארבע בארות של תאים בטניים (ventral). דגרו את הפיתה למשך שבועיים בטמפרטורה של 27 °C לאחר שבועיים. כפי שמוצג כאן, ניתן להוות (transfect) את ה-IPE עם גנים כדי לבחון את תפקודם ברגנרציה של עדשה.תרבית דו-שבועית זו של תאי IPE ונטרליים מציגה מורפולוגיה זהה לזו של התאים דורסליים. שימו לב שהפיגמנטציה נשמרת עד לשלב זה הן בתאי הקשת הדורסליים והן בתאים הוונטרליים. לפני השתלת תאי ה-IPE, יש לצבור אותם על ידי הוספת 20 µL של dyse ב-400 µL של מצע תרבית טרי לתאים, לסובב את הצלחת בעדינות ולהשאיר את התאים למשך הלילה באינקובטור בטמפרטורה של 27 °C.ביום למחרת, השתמש בפיפטינג עדין כדי לשחרר את התאים, ולאחר מכן העבר אותם למבחנות של 1.5 milliliter. כעת שטוף את התאים על ידי סנטריפוגציה של המבחנות והחלפת הנוזל העליון ב-1 milliliter של L 15. חזור על שלב זה פעמיים. השתמש ב-10 microliters של תגלי התאים כדי לחשב את מספר התאים בשיטות סטנדרטיות.לאחר החישוב, הכינו 3000 עד 5,000 תאים ב-200 µL של L 15 לכל אגרגט. כעת סבבו את התאים בצנטריפוגה והדגירו אותם למשך 48 שעות. בטמפרטורה של 27 °C ניתן כעת להשתיל את התאים בחיה מקבלת.התחילו בהרדמה של דגיג בוגר בתמיסת שינה עד להפסקת התנועה. כעת, השתמשו בלהב סקאלפל כדי ליצור חריץ בקרניית העין. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, הסירו את העדשה.לאחר הסרת העדשה, מקם את צבר תאי ה-IPE ממש מתחת לרקמת הקרנית בצדו הגבתי (ventral) של העין. כעת החזר את הסלמנדרה למכל separate ונחה אותה להחלים. במהלך זמן זה, טיפל בסלמנדרה בזהירות כדי למנוע פגיעה ברקמה המחלימה.התאים המושתלים זקוקים לחודש כדי להתחדש לעדשה חדשה. לאחר חלוף חודש, הוצא את העיניים החדשות המושתלות בתאי האגרגט וקבע את הרקמה. באמצעות פרוטוקול התייבשות סטנדרטי, ניתן להטמיע את הרקמה המקובעת בתבניות הטמעה המתאימות לחיתוך של פלחים בעובי 15 מיקרומטר, אשר ייחתכו וייצבעו כראוי.לאחר השתלת האגרגט לתוך עין חדשה, האגרגט מתאי ה-IPE הגביים משרה היווצרות עדשה חדשה. השראת עדשת המארח מהקשת הגבית נצפתה גם בעין עם השתבל הבטני. לא נצפתה השראת עדשה מהאגרגט שהוכן מתאי ה-IPE הבטניים; כאשר הגן six 3 מובע באופן יתר, נצפתה השראת עדשה מהאגרגט הבטני בנוכחות חומצה רטינואית.בנוסף, נצפתה השראה של עדשה במארח מהקשת הגבית של העין לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום התחדשות העדשה לבחון את תפקידם של גנים שונים באופן מחודש.

a-system-for-culturing-iris-pigment-epithelial-cells-to-study-lens

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מדגים את לנתיחה ו הדגירה של הרשתית ארנב החלקיקים בתיווך העברת גנים של פלסמידים או קידוד ה-GFP מגוון רחב של סמנים subcellular לתאי הגנגליון ברשתית.

תרבות Organotypic של הרשתית הארנב למבוגרים

Explants האזור המרכזי של עכברוש העדשה epithelia להבדיל סינכרוני כאשר בתרבית בנוכחות של FGF-2. מיקרוסקופיה immunofluorescence של תרבויות כאלה יכולים מספק מידע רומן על ביטוי גנים ואירועים איתות הקשורים בידול סופנית.

הכנה והתרבות של עדשה Explants עכברוש אפיתל ללימוד בידול Terminal

אנו מספקים שיטה לשחזור עבור monolayers culturing ומחוברות של העובר תאים אנושיים אפיתל הפיגמנט ברשתית (hfRPE) תאים התערוכה מורפולוגיה, פיזיולוגיה, קוטביות, וחלבון וביטוי גנים דפוסים של רקמת יליד מבוגר. עבודה זו הורחבה במודל חיה של מחלות עיניים שונות.

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

בסרטון זה אנו מראים הליך להשגת תאי אפיתל פיגמנט עיני ממודל ארנב. התאים מסייעים בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למחלות ניווניות ברשתית.

בידוד תאי IPE ו-RPE: טכניקה להשגת תאי אפיתל פיגמנט עיני מעין ארנב

סרטון זה מדגים את ההליך לבידוד אפיתל פיגמנט הרשתית, או RPE, תאים ותאי אפיתל פיגמנט קשתית, או IPE, מעיני בקר שנקטפו. ניתן לגדל את התאים המבודדים בתרבית כדי לחקור את תפקידם בטיפול במחלות עיניים.

בידוד תאי RPE ו-IPE מעין בקר: הליך לקציר ותרבית תאי אפיתל פיגמנטיים ראשוניים של בקר

מתואר כאן הקמת מודל ניתוח קטרקט מדומה ex vivo רלוונטי מבחינה קלינית שניתן להשתמש בו כדי לחקור מנגנונים של תגובת הפגיעה של רקמות אפיתל בתוך המיקרו-סביבה הטבעית שלהן.

הקמת קלינית רלוונטי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את culturing תאי (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית, על הממברנה של גיל ו/או חולה אנוש ברוך. שיטה זו מתאימה ללמוד RPE בהתנהגות התא על מטריצה חוץ-תאית פרוץ.

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

כאן מוצג פרוטוקול לבידוד וזיהוי תאי אפיתל ראשוניים של איריס ושל פיגמנט רשתית מיונקים שונים (עכברים, חולדות, ארנב, חזיר וחזירים). השיטה מתאימה באופן אידיאלי לחקר גישות ריפוי גנטי עיניות במגוון סטים עבור ניתוחי ex vivo ובמחקרי vivo הניתנים להעברה לבני אדם.

בידוד, תרבות והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנט ראשוני של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי

כתב יד זה מתאר פרוטוקול וידאו מפורט לגידול תאי אפיתל ראשוניים של עדשה (LECs), במטרה לשפר את יכולת השחזור ולסייע במחקר בקטרקט ובפסיפיקציה של קפסולה אחורית (PCO). הוא מציע הוראות שלב אחר שלב על דיסקציה של עדשות, בידוד LECs ותיקוף, ומשמש כמדריך רב ערך, במיוחד עבור מצטרפים חדשים בתחום.

אופטימיזציה של תרבית תאי אפיתל בעדשה הראשית של עכבר: מדריך מקיף לטריפסיניזציה

הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים הדמיה חדשה של הר שלם להדמיית מבנים היקפיים בעדשת העין עם שיטות לכימות תמונה. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש במחקרים כדי להבין טוב יותר את הקשר בין מבנים מיקרוסקולריים של עדשה לבין התפתחות/תפקוד עדשה.

הדמיה של תושבת שלמה כדי להמחיש ולכמת את מבנה העדשה ההיקפית, המורפולוגיה של התא והארגון

תפקיד עדשת העין למקד אור על הרשתית תלוי בשקיפות הרקמה, בביומכניקה ובמקדם השבירה. סקירה זו מדגישה את הארכיטקטורה התלת-ממדית של העדשה ודנה במנגנונים המורכבים השומרים על הומאוסטזיס הרקמות.

עדשת העיניים ביונקים בפוקוס: התפתחות, אנטומיה, פיזיולוגיה, שקיפות, ביומכניקה ואתגרים הקשורים לגיל

למד שיטת תרבית תאי אפיתל פיגמנט איריס מניוטים לחקר התחדשות עדשה. השיטה כוללת בידוד תאים, תרבית של שבועיים והשתלה לעין מקבלת. ניתוח היסטולוגי מעיד על יכולת התחדשות מבטיחה.

מערכת culturing איריס תאים פיגמנט אפיתל לחקר התחדשות עדשה של ניוט

גלה סרטונים נוספים