טכניקות מעבדה אספטיים: העברות נפח עם טפטפות ו Micropipettors סרולוגיות

הדגמה זו מציגה טכניקות מעבדה אספטית להעברת נפחים באמצעות פיפטות סרולוגיות ומיקרופיפטות על שולחן המעבדה. יש לעבוד בתוך השטח הסטרילי שנוצר על ידי להבת מבער בנזן. בחר את מכשיר העברת הנפחים המתאים ליישום.

לאחר מכן, השתמש בהם כראוי מבלי לפגוע בסטריליות שלהם, תוך שמירה על סטריליות של ריאגנטים וחומרי תרבית, ושאיבת נוזלים בדיוק רב ובאופן משולב. הליכים אלו חיוניים לצמצום מקורות זיהום ולהבטחת דיוק בניסויים בסיסיים. בתחילה, קיים קושי בכיוון מדויק וקריאה נכונה של המכשירים, וכן בתיאום התנועות מול המכשירים וחומרי המעבדה מבלי לפגוע בסטריליות של הנוזלים המועברים.

תרגול טכניקה ספטית במעבדה הוא חיוני להצלחת הניסוי בעבודה עם דגימות חיות, לכן הקדישו את הזמן ללמידת נהלים אלו עד שיהפכו לטבע שני. בעת העבודה על שולחן המעבדה, ד"ר Chris Reddy, רכז המעבדה שלי, ידגים את הפרוטוקולים. יש לשטוף תמיד את הידיים ביסודיות עם סבון אנטיספטי ומים חמימים לפני תחילת כל הליך מעבדתי. ראשית, הרטיבו את הידיים תחת מים חמימים זורמים.

לאחר מכן, יש למרוח את הסבון ולהפיצו היטב בתנועות נמרצות. שפשפו את הידיים תוך יצירת חיכוך בכל המשטחים, כולל האגודלים, גב האצבעות, גב כפות הידיים ותחת הציפורניים. לאחר מכן, שטפו היטב כדי להסיר שאריות סבון וייבשו באמצעות מגבות נייר ממתקן.

לבסוף, באמצעות נייר סופג נקי, סגרו את הברז ופנו את שולחן העבודה במעבדה. לאחר מכן, הוציאו מגבון חיטוי לח מהמכל ונגבו את כל השטח. הניחו לחומר החיטוי להתאדות באמצעות תאורת הצתה.

מבער בנזן. כווננו את הלהבה כך שייווצר קונוס כחול במרכז. סדרו את כל הציוד הדרוש לפרוצדורה בסמוך לאזור הסטרילי של ספסול המעבדה.

בנוסף, ודאו שכל החומרים מסומנים כראוי. קיימים סוגים רבים של פיפטות סרולוגיות, מפלסטיק או מזכוכית, חד-פעמיות או רב-פעמיות, עם פקק או ללא פקק. הגדלים השונים מכויילים עם פקקים המשמשים כמחסום למניעת מילוי יתר של הפיפטה.

שימו לב שפיפטות סרולוגיות מכויילות גם הן בשתי דרכים. פיפטות TD המסומנות בטבעות כפולות בחלקן העליון מכויילות כך שנפח הקצה אינו נמסר. הדבר אינו מוצג כאן, אך פיפטות TC חייבות להינשף (blown out) מכיוון שהן מכויילות למסירת כל הנפח. תוך שימוש בטכניקה אספטית עם פיפטה סרולוגית מפלסטיק סטרילית העטופה בנפרד, התחילו מהקצה האטום והסירו בזהירות את הנייר.

אין להסיר את כל השרוול. במקום זאת, הגנו על קצה ידית הפיפטה – רק על החלק העליון של הפיפטה שמעל סימוני המדידה – וחברו עזר לפיפטה, כגון פומפה או פיפטור, לקצה העליון של הפיפטה הסרולוגית. החזיקו את העזר לפיפטה ביד אחת והסירו את שרוול הנייר מהפיפטה הפלסטית ביד השנייה.

עבור פיפטות סרולוגיות מזכוכית המאוחסנות במכלים ממתכת, שחררו את החלק העליון של המכל והסירו את המכסה; עקרו באמצעות להבה את הקצוות הפתוחים של המכסה ושל המכל. לאחר מכן, הניחו את המכסה על צדו על משטח העבודה החיטוי. החזיקו את המכל במצב אופקי ונערהו כך שקצותיהן של פיפטה אחת או שתיים יבלטו החוצה.

השאירו בלטה של כאינץ'. הניחו את המיכל על צדו והוציאו פיפטה אחת מבלי לגעת בשאר הפיפטות. שמרו על קצה הפיפטה נקי ממגע עם ידיים ומשטחים שאינם סטריליים.

המשיכו בחיבור של עזר הפיפטה. לאחר מכן, העבירו את השליש התחתון של פיפטת זכוכית דרך החרוט הכחול בלהבת מבער בונסן למשך אחת עד שלוש שניות. כעת הסירו את הפקק של הבקבוק המכיל מצע סטרילי.

החזיקו את הבקבוק בין קמיץ האצבע לכף היד של יד אחת, תוך הפעלת עזר הפפיטה באמצעות האגודל, האצבע והאצבע האמצעית של אותה יד. ביד השנייה, החזיקו את הבקבוק בזווית של 45 מעלות והעבירו את שפת הבקבוק דרך הלהבה של מבער בנזן. הכניסו את קצה הפפיטה הסטרילי לתוך המצע. לאחר מכן, בצעו שאיבה באמצעות עזר הפפיטה תוך בקרת הזרימה לפי סימני המדידה.

עקבו אחר הנפח שנשאב לפיפט כדי לקרוא את הנפח במדויק. החזיקו את הפיפט בצורה אנכית והביטו במניסקוס הנוזל ישירות בגובה העיניים. פעם נוספת, העבירו את שפת הבקבוק דרך להבת מבער בונסן.

לאחר מכן סגרו את הפקק. הניחו את בקבוק המצע בצד. לאחר מכן קחו מבחנה סטרילית ובאופן אספטי.

הסר את הפקק כפי שתואר קודם לכן. צור סביבת עבודה סטרילית על ידי שריפת שולי השפופרת בלהבה. העבר את המצע מהפיפט לשפופרת תוך בקרה על זרימת הדגימה כדי למנוע נתזים.

עקרו את שפת המבחנה בעזרת להבה. שוב, החזירו את הפקק והניחו את המבחנה בצד. כעת הסירו את עזר הפפיטה, השליכו פפיטות פלסטיק למכל ייעודי לפסולת חדה, והטבילו פפיטות זכוכית בתמיסת אקונומיקה 10%.

פיפט מיקרו מאפשר מדידה וחלוקה מדויקת של נפחים זעירים באמצעות מכשירים בגדלים שונים עבור טווחי נפחים ספציפיים. מבחנות וטיפים פלסטיים שעברו סטריליזציה מראש. השתמש גם במטלית חיטוי לחה כדי לנקות את פיפטות המיקרו.הערה.

ה-Volter מציג שלושה מספרים שיש לפרש ביחס לסוג המיקרופיפט, כאשר הדיוק משתקף בחלוקה הקטנה ביותר. לדוגמה, ה-P 20 משמש לנפחים שבין 2.0 ל-20.0 מיקרוליטר. המספר העליון בשחור מייצג עשרות של מיקרוליטר.

המספר השחור השני מציין את הנפח במיקרוליטרים. המספר האדום מסמן עשיריות של מיקרוליטר, כך שכל סימן של חלוקה שווה למרווח של 0.02 µL. ראשית, סובבו את כפתור הכיוונון כדי להגדיר את נפח הדיספנסר כפי שמופיע במד הנפח המספרי.

בעת הורדת הגדרת הנפח במיקרופיפטור, סובב לאט את גלגל האגודל כלפי מטה עד לסימון המדרגה. בעת הגדלת הגדרת הנפח, סובב כלפי מעלה כך שתעבור את סימון המדרגה הרצוי בשליש סיבוב. לאחר מכן, סובב לאט את גלגל האגודל כלפי מטה כדי להגיע לנפח המתוכנן.

השתמשו תמיד בטיפים מפלסטיק סטריליים לשימוש חד-פעמי. התקיפו טיפ בצורה הדוקה על קצה גליל המיקרופיפטור. לחצו כלפי מטה וסובבו מעט כדי להבטיח איטום הרמטי.

החזיקו את המיקרופיפט במצב אנכי. שימו לב כי למיקרופיפט יש שלושה מצבים: מצב מנוחה, עצירה ראשונה ועצירה שנייה.

לחץ על כפתור הדחיפה של הבוכנה ממצב המנוחה עד לעצירה הראשונה כדי לדחוס אוויר בנפח השווה לנפח שהגדרת. כעת, טבול את הטיפ בנוזל תוך כדי לחיצה על כפתור הדחיפה עד לעצירה הראשונה. שחרר את כפתור הדחיפה באיטיות כדי לשאוב את הנוזל לתוך הטיפ.

כאשר לחצן הלחיצה מגיע למצב המנוחה, המתינו זמן מספיק כדי שהנוזל יישאב אל תוך הטיפ. לאחר מכן, הוציאו את הטיפ מהנוזל. ודאו באופן ויזואלי את כמות הנוזל שנשאבה לטיפ, וודאו שאין בועות אוויר.

הנח את הטיפ בזווית של 10 עד 45 מעלות כנגד דופן המבחנה אליה מוזרם הנוזל. כעת, לחץ באיטיות על כפתור הדחיפה של הבוכנה עד למעצור הראשון, כדי להוציא את הנוזל.

לאחר רגע, לחצו על כפתור הדחיפה עד לעצירה השנייה כדי להוציא שאריות נוזל. לאחר מכן, הוציאו את הטיפ מהנוזל ושחררו את הבוכנה חזרה למצב המנוחה. לבסוף, השליכו את הטיפים למכל ייעודי לפסולת חדה על ידי לחיצה על כפתור הפליטה של המיקרו-פיפט.

ראשית, כבו את מבער בנזן. לאחר פינוי כל הציוד והריאגנטים, נגבו את המשטחים החיצוניים של כלי המעבדה במטלית חיטוי לפני העברתם למקום אחסונם. לאחר מכן, הניחו זכוכיתיות מזוהמות וחומרים מסוכנים במיכלי הפסולת המתאימים.

יש לנגב שוב את כל אזור העבודה, ולאפשר לחומר החיטוי להתאדות. לבסוף, יש לשטוף את הידיים היטב בסבון אנטיספטי ובמים חמים. ללא שימוש בטכניקה אספטית, התרביות עלולות להידבק בזיהומים ולהוביל לעיכוב בניסויים.

העברה אספטית של נוזלים באמצעות פיפטות סרולוגיות היא חיונית להרביית תרביות חיידקים טהורות, כגון הכנה זו של 25 milliliter של e coli. בנוסף, פיפטות סרולוגיות מקלות על העברה אספטית של נוזלים למבחנות סטריליות. דוגמה זו מציגה תרבית טהורה לעומת תרבית מזוהמת של e coli בהעברה נקודתית של מצע גידול למבחנות.

לעיתים נדרשים נפחים מדויקים. במקרה זה, ניכרת העברה לא מדויקת של מצע. דוגמה זו מראה נפח שגוי של בופר שהועבר.

במקום להעביר 12.5 µL, הסטודנט העביר 125 µL. למרות שהמספרים הוגדרו באופן זהה על גבי בורר הנפח, נבחר מיקרו-פיפט לא מתאים למשימה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו ידע מעשי על יישום טכניקה סטרילית בפרוצדורות מעבדה שגרתיות, כגון העברת תמיסות ותרביות באמצעות פיפטות סרולוגיות ומיקרו-פיפטות, מבלי לפגוע בסטריליות שלהן.

המטרה היא שהליכי זהירות, כגון שריפת זכוכית, טיפי פיפט, מבחנות תרבית ובקריקים, כמו גם עבודה בתוך גבולות של שטח סטרילי על שולחן המעבדה, יהפכו להרגל בכל ניסוי. כמו כן, חיוני למדוד ולחלק נפחים מדויקים בעת ביצוע ניסויים. למידה של שימוש נכון במכשירי העברת נפחים אלו תשפר את מהימנות התוצאות הניסוייות.