בידוד באף גזע תאים חוש הריח של מכרסמים או בני אדם

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי גזע אולפקטוריים (ריח) מהאף של חולדות או בני אדם, במטרה לזהות anomalias מולקולריות או לתקן מוח פתולוגי או פגוע מטראומה. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף כירורגי של ביופסיות מהרירית האולפקטורית מחלל האף. לאחר מכן, מסירים את האפיתל האולפקטורי ואת תאי הגזע האפיתליאליים שלו כדי להתמקד בתאי גזע אקטומזנכימליים ב-Lamin propria שמתחתם, ולאחר מכן מבודדים תאים אלו על ידי דיסוציאציה של רקמת מכרסמים, או איסוף תאים שצמחו מחוץ לשתלים אנושיים שגודלו תחת לוחות כיסוי מזכוכית.

השלב הסופי של הפרוצדורה הוא גידול ספירות של תאי גזע תוך השראה לדיפרנציאציה לתאים דמויי נוירונים. בסופו של דבר, ביצוע explan של כל הרירית האולפקטורית, תאי גזע אינדיבידואליים. ניתן להשתמש בספירות צפות או בתאים דמויי נוירונים לצורך זיהוי סמנים מולקולריים במחלות מוח או לתיקון נזקים למערכת העצבים.

אנו מתארים את שיטתה לבידוד תאי גזע אפים של בני אדם ומכרסמים מהרירית האולפקטורית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שתאי הגזע שייכים לרקמה עצבית, הם נגישים בקלות בכל פרט חי, וניתן להשתמש בהם לאבחון או לתיקון של מוח פתולוגי. כמנתח אף-אוזן-גרון, ביצעתי מאות ביופסיות של האף עבור מחקרים קליניים.

ההליך בטוח וניתן לביצוע. והאלחוש המקומי הכללי. אני מדען זוטר עם מומחיות בתרבית של תאי גזע אנושיים או של מוטות, אפים או פקטורים.

אלו מראים קצב הכנה גבוה של תאי גזע ונטייה להתמיין לסוגי תאי עצב. הוכח כי הם יעילים במודלים של בעלי חיים לאמנזיה ולמחלות ניווניות של מערכת העצבים. לפני איסוף הרירית, הכינו בתוך מנדף תרבית סטרילי 3 צלחות פטרי בקוטר 35 מילימטר עם מצע תרבית DMEM/F12.

כעת, לאחר אימות באמצעות צביטה בבהוות שהחולדה נכנסה להרדמה עמוקה עם sodium pentobarbital, בצעו המתה באמצעות עריפת ראש. בדלו את הראש והסירו את העור. הסירו את הלסת התחתונה בעזרת מספריים, ובסיוע של פינצטה, הסירו את שרירי הפנים משני הצדדים, החל מאזור החלק האחורי של השיניים החותכות.

באמצעות ה-Ron Jur, הסר את העצם המכסה את חלל האף, צד אחד בכל פעם. הטורבינות האולפקטוריות (conchae olfactoriae) יבואו למבט כאיברים בצבע כתום-חום הממוקמים בחלק האחורי של האף; הסר בעדינות את הטורבינות באמצעות פינצטה.

באמצעות מחט בכילייב 26, בודדו את הרירית האולפקטורית השוכנת על המחיצה על ידי חיתוך הרקמה לאורך שלושה קווים: קשת הפלטה הניצבת (perpendicular plate), פלטת ה-CRI ותקרת חלל האף. אספו ביופסיות משני הצדדים והעבירו אותן לצלחת פטרי מלאה ב-A-D-M-E-M ham F 12. הליך זה לא אמור להימשך יותר מ-10 דקות מרגע תחילת ההמתה.

כעת, כדי להסיר את הריר, העבירו את הביופסיות פעמיים לצלוחיות פטרי מלאות בתווך, בהתאם לוועדות האתיקה המקומיות הרלוונטיות. מנתח אף, אוזן וגרון צריך לבצע הליך זה, וכל מטופל חוץ צריך לחתום על טופס הסכמה מדעת, תוך שימוש באנדוסקופ קשיח של 0 מעלות או 30 מעלות. בחנו את שתי חללי האף והעריכו את הנוכחות המשוערת של פוליפים או כל נגע דלקתי.

יש לבחור את חלל האף המתאים ביותר בהתחשב בסטייה של המחיצה. בעזרת מקלוני צמר, יש למרוח חומר אלחוש מקומי כגון לידוקאין עם אפינפרין למשך 10 דקות עם חיתוך יסודי. באמצעות מלקחי אתמואיד יש לדגום ביופסיה של שני מילימטרים רבועים, באזור השורש של ההיבט המדיאלי של הקונכה האמצעית או על המחיצה באזור המדיאלי-דורסלי.

כאן אנו מראים את הביופסיה מאזור השורש. את הביופסיית הריח מעבירים לאחר מכן, באמצעות מחט סטרילית, לשפופרת סטרילית של שני מיליליטר המלאה ב-1 mL של DMEM hem F 12. הפכו את השפופרת כדי לוודא שהביופסיה טבולה בתווך התרבית.

הכנס את המבחנה למכלול קירור והעבר אותה למעבדה למחקר. בשלב זה, ניתן להשתמש בביופסיה כשלעצמה למחקרים מולקולריים השוואתיים המתמקדים במחלות מוח ספציפיות, או לעבד אותה לצורך ייצור תאי גזע. שטוף את הביופסיות האנושיות או של חולדות ב-DMEM ham F 12 והדגר את הביופסיות בצלחת פטרי המכילה מיליליטר אחד של dis paste.

השרויה בשני תמיסות למשך שעה אחת ב-37 degrees celsius. לאחר מכן, מסירים את אפיתל הריח של בן האדם או של חולדה מה-Lamin propria שמתחתיו באמצעות שפכטל מיקרוסקופי תחת מיקרוסקופ דיסקציה עם תאורה הפוכה מפוזרת. אפיתל הריח הוא שקוף על רקע שחור בהשוואה ל-lamin propria, שמופיע כפסים בצבע כתום-חום על רקע לבן.

האפיתל נראה אפור והלמינה פרופריה (Lamin propria) נראית חומה לאחר הטהרה; העבר את הלמינה פרופריה לצנחת פטרי מלאה ב-DMEM hem F 12. אם הרקמה היא ממכרסם, חתוך את הלמינה פרופריה לחתיכות קטנות בעזרת שתי מחטים בכיול 25 gauge. לאחר מכן, העבר את החתיכות לשפופרת של 15 milliliter מלאה ב-1 milliliter של collagenase one A, והשתמש בפ pipette פלסטית סטרילית כדי לפרק את הרקמה בתוך השפופרת.

לאחר מכן, דגרו את המבחנה למשך 10 דקות ב-37 degrees Celsius. כדי להפסיק את הדיסוציאציה, נער את המבחנה בעדינות, הוסיפו מיליליטרים של PBS נטול סידן ומגנזיום וסובבו בצנטריפוגה ב-200 Gs למשך חמש דקות. השביו את משקע התאים בתוך תווך גידול והעבירו אותם לצלחות גידול פלסטיות.

כעת, אם הרקמה היא אנושית, חתכו את הלימון באופן מתאים לשלוש עד ארבעה חלקים. הכניסו כל רצועה לבאר נפרדת בקוטר של 2 cm בתוך פלטה של 4 בארות, וכסו את הרקמה עם כיסויי זכוכית סטריליים בקוטר של 1.3 cm.

לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של מצע גידול לכל צלחת תרבית עבור כל אחד מסוגי הרקמות. יש לחדש את מצע הגידול מדי יומיים עד שלושה ימים. לאחר חמישה עד שבעה ימי גידול, תרכיבי תאי הגזע יתחילו לפלוש לצלחת התרבית.

לאחר שבועיים, התאים אמורים להגיע לקונופלואנציה. כאשר תושג קונופלואנציה, יש לבצע פסאז' ולהעביר את התאים לבקבוקי תרבית כדי להפיק ספירות של תאי גזע.

זריעה חוזרת של התאים בצפיפות של 16,000 תאים לסמ"ר לתוך בקבוקים שעברו טיפול מקדים מדי יומיים. הזנה של התאים ב-0.2 מיליליטר לסמ"ר של מצע מועשר. כעבור יומיים עד חמישה ימים, אספו את ספרוני התאים הצפים ובצעו להם זריעה חוזרת או פירוק לפני ההשתלה.

מודל חיה לטיפול תאי להבחנה של תאי גזע ריחוניים לתאים דמויי נוירונים. יש לגדל את התאים למשך 21 ימים במצע neuro basal המכיל B 27, פניצילין, סטריפטומייצין, גלוטמין וגלוטמט, ולאחר מכן להחליף את המצע מדי שלושה ימים. תאים דמויי נוירונים אמורים להופיע לאחר שבועיים עד שלושה שבועות, חמישה עד שבעה ימים לאחר הזריעה.

תאי גזע ריח אנושיים מהנחיר צמחו מתוך הרקמה המושתלת והתרבו במהירות. ניתן היה להגיע לfluence מלא תוך שבוע או שבועיים. מאפיין מפתח של תאי גזע, קינון וביטוי, הוערך כאשר הם גודלו על פוליליזין עם מצע תרבית נטול סרום המועשר ב-EGF ו-FGF two; תאי גזע הריח הולידו ספירות כאשר הספירות נזרעו בתרבית המכילה סרום.

במדיום, הם הולידו אוכלוסיות תאים המכילות כ-50% תאים המבטאים GFAP, עד 15% תאים המבטאים tubulin, ועד 5% תאים המבטאים oh four. כאשר תאים שהופקו מהספירות גודלו במדיום תרבית neuro basal מועשר, רוב האוכלוסייה הפכה לתאים דמויי נוירונים המבטאים beta three tubulin. אותם תאים דמויי נוירונים ביטאו גם map two.

כך ניתן לשנות את גורלן של תאי הגזע במהלך סמסטר אחד. טכניקה זו יכולה להפיק בקלות מיליוני תאי גזע בפחות מארבעה שבועות, ובכך לאפשר לקלינאים לבצע השתלות תאים אוטולוגיות בעתיד. ביופסיות של רירית האף יעילות מאוד לזיהוי סמנים ביולוגיים ומחלות מוח.

לאחרונה הצלחנו למצוא גנים מועמדים חדשים לאוטיזם. כבר הקמנו בנק של תאי גזע ריחוניים מאנשים עם אוטיזם ומקבוצת ביקורת, וניתן להרחיב אותו להפרעות אחרות של המוח האנושי.