Name: Trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: למדו כיצד להקים מודל זיהום טבעי ב-Trichuris muris באמצעות מתן פומי של ביצי תולעת לעכברים. חקירת התגובות החיסוניות מסייעת להבנת מנגנוני החסינות מסוג Th2 והדלקת במעיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (MSH-95368, 89773 ו MOP-MOP-106,623 עד CZ) וקרן קנדה עבור חדשנות. SCM הוא הנמען של האגודה CIHR / הקנדי של אחווה לגסטרואנטרולוגיה דוקטורט. CZ הוא חוקר חדש CIHR.

1. הפצת Trichuris ביצים muris <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור קבוצות חדשות של ביצים Trichuris muris, להדביק 20-30 עכברים immunodeficient (למשל NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) או 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - / -)) או עכברים רגישים מבחינה גנטית ( למשל. AKR / י) כי הם 6-8 שבועות עם כ 300 ביצים Trichuris muris ידי gavage הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 32-35 ימים להקריב את העכברים בחנק CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הצד הגחוני של העכבר רטובה את הבטן עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים שימוש לתפוס את עור הבטן לעשות חתך קטן בעזרת מספריים. חותכים את העור כדי לחשוף את תכולת הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את cecum ואת המעי הגס הפרוקסימלי, ולהסיר אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את cecum ואת המעי הגס הפרוקסימלי של צלחת פטרי המכילה 10 ס"מ השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) עם 500 U / ml פניצילין 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין (P / S). חותכים את cecum לפתוח לחשוף את לומן ואת תולעים. בעזרת מלקחיים cecum מקום בכוס של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) וללחוץ בעדינות כדי להסיר את הצואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור cecum אל צלחת פטרי באמצעות מלקחיים מעוקל חלקה (Roboz RS-5047) בעדינות לשלוף תולעים למקם אותם היטב של צלחת 6 היטב המכיל 5 MLS ש DMEM + P / </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה עבור כל העכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 6 צלחת היטב במיכל פלסטיק עם מגבת נייר לחה כדי לשמור על לחות לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות להסיר תולעים באמצעות מלקחיים מעוקל חלקה לפצל אותם לתוך 2 בארות חדשות של צלחת 6 היטב DMEM המכיל 5 מ"ל + P / S. קציר את תוכן היטב את המקום המקורי של צינור 15 בז מ"ל. ספין צינור ב 3000 סל"ד ולהסיר ובמילואים supernatant כמו אנטיגן 4 שעה (יכול לשמש restimulation התא לאחר PBS דיאליזה, שם התשואות חלבון טיפוסי הם 10-20 מ"ג לכל 20 עכברים) ו resuspend ביצה המכילים גלולה במי ברז autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת 6 גם חזרה 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר להיפטר התולעים. קציר את התוכן של בארות לתוך צינור בז ספין בסל"ד 3000 דקות 5. הסר supernatant ובמילואים כמו אנטיגן לילה (ניתן להשתמש Trichuris Ag ELISAs אלוטיפ נוגדן ספציפי לאחר PBS דיאליזה, שם התשואות חלבון טיפוסי הם 10-20 מ"ג לכל 20 עכברים) ו המכילות ביצים resuspend גלולה במי ברז autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 4 שעות וביצים לילה ולסנן את הביצים דרך המסננת 70μm להסיר שאריות תולעים מכן להעביר לתוך בקבוקון 75 ס"מ 2. שמור את הבקבוק במקום חשוך מכוסה בנייר כסף במשך 6 שבועות בטמפרטורת החדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביצים במי ברז autoclaved ו resuspend בגיל 50 ביצים קיימא μl 50. כדי לעשות זאת, צנטריפוגה ביצים בסל"ד 3000 דקות 5 ו resuspend במים 50 מ"ל ~ ברז סטרילי. הסר 50 ביצים μl מקום בשקופית זכוכית. באמצעות הגדלה 40X לספור את מספר הביצים embryonated קיימא μl 50. מדולל ביצים לתת 50 ביצים קיימא μl 50. לקבלת תמונות של ביצי קיימא עיין מחקר שנערך על ידי Kopper ו מנספילד 16. </li></ol> 2. דלקת חריפה של עכברי הניסוי עם Trichuris muris ביצים (200 ביצים / עכבר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים resuspend ביסודיות להסיר נפח מספיק כדי לטפל במספר של עכברים X 2 (למשל עבור 10 עכברים לוקחים 200 μl x 10 x 2 = עכברים MLS 4 ביצים) וגם למקם אותם שפופרת 14 מ"ל הצמד כובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הצמד 14 מ"ל צינור כובע לערבב. מביא 200 μl של ביצים לתוך מזרק 1 מ"ל על מחט בגודל המתאים האכלה (עבור עכברים במשקל 25 גרם השתמשנו 18 מד 1 1 / 2 "מחטים). בעורפו ב יד אחת על העכבר בעזרת היד השנייה לנהל את הביצים על ידי gavage אוראלי . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 21 ימים. </li></ol> 3. ניסיוני קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 21 להקריב את העכברים באמצעות ה-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם מעכברים ידי לנקב לב, בתוך מזרק ללא heparinized, ולאחסן ב 4 ° C. למחרת לבודד בסרום להקפיא ב -20 ° C. סרום ניתן להשתמש לצורך זיהוי של Trichuris ספציפי IgGs ו IgE על ידי ELISA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הצד הגחוני של העכבר רטובה את הבטן עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים שימוש לתפוס את עור הבטן לעשות חתך קטן בעזרת מספריים. חותכים את העור ואת קרום הבסיסי לחשוף את תכולת הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את המעי הדק, cecum והמעי הגס. תפוס את cecum עם מלקחיים ולשלוף של חלל הבטן. עם זוג נוסף של מלקחיים לדחוף המעי הדק מעל ימינה לחשוף את בלוטות לימפה mesenteric (mLNs). הסר את mLNs נזהרים שלא לחתוך את המעיים ומכניסים 15 מ"ל בז המכיל 2 MLS של התקשורת. אם תרצה אלה יכולים להיות מעובדים restimulated במבחנה (4x10 6 / מ"ל 1 מ"ל ב 24 צלחות היטב עם αCD3/CD28 מיקרוגרם / מ"ל 1 או עם 50μg/ml 4H Trichuris Ag) עבור 72 שעות לניתוח ציטוקינים על ידי ELISA ו-F תאייםנמוך cytometry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את cecum והמעי הגס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לדחוף החוצה כדורי צואה מן המעי הגס הדיסטלי מקום ובכל צינור 2 Axygen מ"ל. להקפיא ב -20 ° C. כדורי צואה ניתן לנתח על ידי כתם המערבי לביטוי של resistin כמו β-מולקולה (RELM-β). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקצה של cecum (~ 0.5 ס"מ). כדי להסיר צואת להחזיק קצה cecum עם מלקחיים ולשטוף עם PBS באמצעות מזרק 3 מ"ל ו - 22-מחט מד בצלחת פטרי. מקום paraformaldehyde 4% טרי צינור 5 מ"ל פלקון כובע הצמד. חנות ב 4 ° C. אלה יכולים להיות מוטבע פרפין, מחולק רכוב על שקופיות לניתוח היסטולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חתיכת המעי הגס הפרוקסימלי (~ 1 ס"מ) של RNA. שים מדגם לתוך צינור 2 Axygen מ"ל עם RNAlater 500 μl. חנות ב 4 ° C. דגימות אלו ניתן לנתח ביטוי mRNA על ידי qPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שאר cecum בצלחת פטרי שכותרתו להקפיא ב -20 ° C. </li></ol> 4. ספירת Trichuris muris תולעים cecum <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר cecum מהמקפיא ומניחים בצלחת פטרי המכילות ~ 5 מ"ל מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים, חותכים לפתוח cecum לחשוף את לומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את cecum עם מלקחיים במרץ לנער את cecum להסיר את מרבית הצואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת cecum אל צלחת פטרי אחר המכיל מים באמצעות מלקחיים מעוקל חלק בעדינות לגרד את IECs הרקמה הבסיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת cecum כדי בצלחת פטרי חדשה המכילה מים במרץ לגרד רקמות הנותרים עם מלקחיים, קורעת את הרקמה לחתיכות קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ לנתח כדי לספור את כל התולעים בכל 3 של בצלחות פטרי. כפי שאתם מוצאים תולעת להסיר אותו בצלחת כדי להבטיח את התולעת אותו לא נספר פעמיים. אם תולעים פגומים (שבורות כלומר במחצית) לספור רק מסתיים עבה או דק כדי לקבל מספר מדויק. </li></ol> 5. נציג תוצאות המודל muris Trichuris זיהום מאפשר לחוקרים לכמת נטל טפיל התגובה החיסונית מערכתית, כמו גם בהיסטולוגיה לבחון את התגובה הדלקתית בתוך cecum הדיסטלית. כאשר לומן של cecum שנקטפו חשוף, תולעים Trichuris ניתן המנויים באמצעות מיקרוסקופ לנתח (איור 1A-B). פרמטרים של חסינות Trichuris כוללים גם אלוטיפ נוגדן מעבר IgG1 (המשויך חסינות מסוג Th2) אצל בעלי חיים עמידים, IgG2a (המשויך חסינות מסוג Th1) בבעלי חיים רגישים (תרשים 1C). הביטוי של הגביע תא ספציפי חלבון resistin כמו מולקולות β (RELM-β) מזוהה עם אישור של Trichuris והוא לזיהוי על ידי ניתוח כתם המערבי (איור 2). החלק הדיסטלי של cecum יכול להיות מוכתם תקופתיים חומצה שיף (PAS) כדי להעריך את התא הגביע התגובות והיקף דלקת מעיים בתגובה לזיהום (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. כימות חסינות Trichuris muris. (א) עמיד (B6) עכברים לגרש muris Trichuris על ידי 21 יום שלאחר זיהום. לעומת זאת, רגישים (AKR / J) עכברים נדבקים כרוני עם Trichuris, וכתוצאה מכך הקמת טפיל. כל עמודה מייצגת את הממוצע ± SEM של 4-8 חיות לכל קבוצה. (ב) תולעים נספרים באמצעות מיקרוסקופ לנתח. הפאנל למעלה מראה תולעים בבידוד, לוח התחתונה מראה תולעים בנוכחות IECs ובצואה. (ג) Trichuris ספציפי titres IgG2a נקבעים על ידי ELISA של נסיוב מדוללת (01:02 דילול, החל מהשעה 1:20 דילול ומסתיים 1:2560) על צלחות מצופה אנטיגן הפרשה Trichuris (O / N Ag, 5 מיקרוגרם / מ"ל). רגישים AKR / י עכברים בעלי רמות גבוהות במיוחד של IgG2a Trichuris ספציפיים בסרום מאשר B6 עכברים עמידים. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. חיסול של Trichuris muris קשורה ביטוי הגביע תאים ספציפיים לחלבון RELM β-7. RELM-β הייצור ניתן להבחין בין כדוריות צואה מן עמידים Trichuris נגועים (B6), אבל לא רגישים (AKR / J) עכברים ידי ניתוח כתם המערבי. נתיב כל נציג של חיה אחת, (N) = תמים, (TM) = 21 יום Trichuris עכברים נגועים. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. בדיקה היסטולוגית של זיהום cecum דיסטלי הבאים Trichuris. סעיפים 5-7 מיקרומטר של cecum דיסטלי מוכתם PAS. תא וגביע היפרפלזיה ייצור ליחה ניכרות עמיד (B6), אבל לא רגישים (AKR / J) עכברים הבאים זיהום Trichuris.

<ol><li>Cliffe, L. J., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Trichuris+muris+system%3A+a+paradigm+of+resistance+and+susceptibility+to+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The Trichuris muris system: a paradigm of resistance and susceptibility to intestinal nematode infection.</a> Adv. Parasitol. 57, 255-307 (2004).</li>
<li>Else, K. J., Finkelman, F. D., Maliszewski, C. R., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-mediated+regulation+of+chronic+intestinal+helminth+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Cytokine-mediated regulation of chronic intestinal helminth infection.</a> J. Exp. Med. 179, 347-351 (1994).</li>
<li>Bancroft, A. J., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1+and+Th2+cells+and+immunity+to+intestinal+helminths%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1 and Th2 cells and immunity to intestinal helminths.</a> Chem. Immunol. 71, 192-208 (1998).</li>
<li>Bancroft, A. J., McKenzie, A. N., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+IL-13+in+resistance+to+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A critical role for IL-13 in resistance to intestinal nematode infection.</a> J. Immunol. 160, 3453-3461 (1998).</li>
<li>Helmby, H., Takeda, K., Akira, S., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+%28IL%29-18+promotes+the+development+of+chronic+gastrointestinal+helminth+infection+by+downregulating+IL-13%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin (IL)-18 promotes the development of chronic gastrointestinal helminth infection by downregulating IL-13.</a> J. Exp. Med. 194, 355-364 (2001).</li>
<li>Owyang, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+25+regulates+type+2+cytokine-dependent+immunity+and+limits+chronic+inflammation+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 25 regulates type 2 cytokine-dependent immunity and limits chronic inflammation in the gastrointestinal tract.</a> J. Exp. Med. 203, 843-849 (2006).</li>
<li>Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELM%CE%B2%2FFIZZ2+is+a+goblet+cell-specific+immune-effector+molecule+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">RELMβ/FIZZ2 is a goblet cell-specific immune-effector molecule in the gastrointestinal tract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 13596-13600 (2004).</li>
<li>Datta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+in+intestinal+tissue+that+are+regulated+after+infection+with+an+intestinal+nematode+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes in intestinal tissue that are regulated after infection with an intestinal nematode parasite.</a> Infect. Immun. 73, 4025-4033 (2005).</li>
<li>Cliffe, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+intestinal+epithelial+cell+turnover%3A+a+new+mechanism+of+parasite+expulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Accelerated intestinal epithelial cell turnover: a new mechanism of parasite expulsion.</a> Science. 308, 1463-1465 (2005).</li>
<li>Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+weapons+in+the+war+on+worms%3A+identification+of+putative+mechanisms+of+immune-mediated+expulsion+of+gastrointestinal+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">New weapons in the war on worms: identification of putative mechanisms of immune-mediated expulsion of gastrointestinal nematodes.</a> Int. J. Parasitol. 36, 723-733 (2006).</li>
<li>Finkelman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+regulation+of+host+defense+against+parasitic+gastrointestinal+nematodes%3A+lessons+from+studies+with+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine regulation of host defense against parasitic gastrointestinal nematodes: lessons from studies with rodent models.</a> Annu. Rev. Immunol. 15, 505-533 (1997).</li>
<li>Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+helminth+infection%3A+immunopathology+and+resistance+during+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Enteric helminth infection: immunopathology and resistance during intestinal nematode infection.</a> Chem. Immunol. 66, 41-61 (1997).</li>
<li>Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+intestinal+muscle+contraction+by+interleukin-9+%28IL-9%29+or+IL-9+neutralization%3A+correlation+with+worm+expulsion+in+murine+nematode+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Modulation of intestinal muscle contraction by interleukin-9 (IL-9) or IL-9 neutralization: correlation with worm expulsion in murine nematode infections.</a> Infect. Immun. 71, 2430-2438 (2003).</li>
<li>Khan, W. I., Blennerhasset, P., Ma, C., Matthaei, K. I., Collins, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat6+dependent+goblet+cell+hyperplasia+during+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stat6 dependent goblet cell hyperplasia during intestinal nematode infection.</a> Parasite Immunol. 23, 39-42 (2001).</li>
<li>Akiho, H., Blennerhassett, P., Deng, Y., Collins, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+IL-4%2C+IL-13%2C+and+STAT6+in+inflammation-induced+hypercontractility+of+murine+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of IL-4, IL-13, and STAT6 in inflammation-induced hypercontractility of murine smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282, 226-2232 (2002).</li>
<li>Kopper, J. J., Mansfield, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+improved+methods+for+delivery+of+Trichuris+muris+to+the+laboratory+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Development of improved methods for delivery of Trichuris muris to the laboratory mouse.</a> Parasitol. Res. 107, 1103-1113 (2010).</li>
<li>Bancroft, A. J., Else, K. J., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-level+infection+with+Trichuris+muris+significantly+affects+the+polarization+of+the+CD4+response%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Low-level infection with Trichuris muris significantly affects the polarization of the CD4 response.</a> Eur. J. Immunol. 24, 3113-3118 (1994).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי האוניברסיטה של ​​קולומביה הבריטית.

פרוטוקול זה פרטים מנה ברמה גבוהה חריפה Trichuris muris זיהום אשר יכול להיות שונה כפי שנדרש על ידי החוקר. למשל, בעכברים אפשר להקריב ורקמות שנקטפו בימים שונים. כדי לקבוע כי העכברים הקימו בהצלחה נטל תולעת מלא הם יכולים להקריב ביום 14, ובשלב זה כל העכברים צריכים לשאת בנטל של כ 200 תולעים. עכברים יכולים גם להיות נגועים עבור 32 ימים שבהם כל תולעת זוהה תגיע לבגרות יישאר עם מארח למשך חייו. בנוסף, הפרוטוקול ניתן להתאים מודל זיהום כרוני Trichuris muris. כדי לעשות זאת, מנה ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> האכלת בעלי חיים מחטים (18 x ½ 1 &quot;) </td><td> פופר </td><td> 7912 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים מעוקל חלקות </td><td> Roboz </td><td> RS-5047 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Prkdc SCID Il2r gtm1Wjl / SzJ (NSG) </td><td> ג&#39;קסון מעבדות </td><td> 005557 </td><td> אלה הם העכברים השתמשנו, לעומת זאת, כל העכברים immunodeficient או זן רגיש צריך לעבוד. </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Qiagen </td><td> 76104 </td><td></td></tr><tr><td> 2 מ&quot;ל צינורות </td><td> Axygen </td><td> MCT-200-C </td><td></td></tr><tr><td> 15 צינורות מ&quot;ל </td><td> בז </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 6 צלחות טוב </td><td> בז </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים המדע </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> α-RELMβ נוגדן </td><td> PeproTech Inc </td><td> 0694270Rb </td><td></td></tr></tbody></table>

trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris הוא פתוגן טבעי של עכברים דומה ביולוגית antigenically למינים של Trichuris כי להדביק בני אדם ובעלי חיים 1. ביצי התולעת ניתנים על ידי gavage אוראלי, בוקעות במעי הדק הדיסטלי, לפלוש לתאי האפיתל במעי (IECs) כי קו מאורות של cecum ואת המעי הגס הפרוקסימלי ועל התבגרות תולעים שחרור ביצים לתוך הסביבה 1. מודל זה הוא כלי רב עוצמה לבחון את הגורמים CD4 + T שליטה עוזר (ה &#39;) בתא ההפעלה, כמו גם שינויים באפיתל המעי. התגובה החיסונית המתרחשת זנים טהורים עמידים, כגון C57BL / 6 BALB / c, מאופיין ציטוקינים Th2 מקוטב (IL-4, IL-5 ו-IL-13) וגירוש של תולעים בזמן Th1 הקשורים ציטוקינים (IL -12, IL-18, IFN-γ) לקדם דלקות כרוניות AKR רגישים מבחינה גנטית / עכברים J 2-6. ציטוקינים Th2 לקדם שינויים פיזיולוגיים אצל microenvironment המעי כולל תחלופה מהירה של IECs, התמיינות תאים הגביע, גיוס ושינויים בחדירות אפיתל והתכווצות שרירים חלקים, אשר כולם היו מעורבים בגירוש תולעת 7-15. כאן אנו פרט פרוטוקול עבור הפצת Trichuris ביצים muris אשר ניתן להשתמש בהם בניסויים הבאים. כמו כן אנו מספקים מדגם ניסיוני הקציר עם הצעות ניתוח שלאחר זיהום. בסך הכל, פרוטוקול זה יספק לחוקרים את הכלים הבסיסיים לביצוע muris זיהום Trichuris העכבר מודל אשר יכול לשמש כדי לענות על שאלות הנוגעות נטייה Th במערכת העיכול, כמו גם פונקציות מפעיל החיסונית של IECs.

זיהום Trichuris muris הוא מודל מעיים של חסינות Th2 שבו עכברים עמיד ליצור תגובת Th2 מגן עכברים רגישים ליצור תגובה פתולוגית Th1.

Trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים

*Trichuris muris* הוא פתוגן טבעי של עכברים, והוא דומה ביולוגית ואנטיגנית למינים של *Trichuris* המדביקים בני אדם ובעלי חיים למשק1. ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להקים ולתחזק מודל של זיהום טבעי ב-Hain. ראשית, עכברים מודבקים בביצי *Tricurulus mirrors* באמצעות זקיפה רבבית (oral gavage). לאחר 21 ימים, בעלי החיים המודבקים מושמדים (euthanized) ונדגמים דם, קשרי לימפה מזנטריים, גרגירים צואתיים, מעיים הגסות ועיקריים (ceca).באמצעות דגימות אלו, ניתן לנתח את התגובה החיסונית שנוצרה נגד tricks. Mirrors. ניתן לנתח דגימות סרום באמצעות ELISA כדי לזהות נוגדנים ספציפיים ל-TRA.ניתן לבצע גרייה חוזרת (restimulation) in vitro של תאי קשרי לימפה כדי לנתח תגובות חיסוניות תאיות. ניתן להשתמש ב-Western blot של כדורי צואה להערכת תכולת חלבונים, וניתן לבצע ניתוח ביטוי גנים באמצעות אנליזת QPCR של המעי הגס. לבסוף, ניתן להשתמש בקצה העקום (cecum) לבדיקות היסטולוגיה, בעוד שניתן להשתמש בשאר העקום כדי לקבוע את עומס התולעים בעכברים מזוהמים.בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות אם עכבר הוא עמיד או רגיש לזיהום ב-trais MOUs, וניתן לאפיין את התגובה החיסונית שהופעלה נגד הטפיל. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון אילו גורמים שולטים בהפעלה של תאי T helper, וכן אילו חלבונים נדרשים לדיפרנציאציה של תאי TH two. ניתן להרבות ביצי Trauss MOUs בעכברים עם חסר חיסוני או בזנים רגישים גנטית כגון a KR, כאשר 35 ימים לאחר ההדבקה ניתן לאסוף את הביצים מעכברים שהורדמו.חשוף את פני השטח הגבתיים של החיה ושטוף את בטנו של העכבר באתנול באמצעות פינצטה ומספריים סטריליים. אחוז בעור הבטן ובצע חתך קטן. חשוף את תוכן הבטן, זהה את המעי העיוור ואת המעי הגס הפרוקסימלי, ולאחר מכן הסר אותם.העבירו את האיברים לצלחית פטרי בקוטר 10 סנטימטר המכילה DMEM מועשר, עם פניצילין וסטRepartition streptomycin. לאחר מכן, חתכו את העקום ואת המעי הגס הפרוקסימלי, כדי לחשוף את הלומן ואת התולעים באמצעות פינצטה. הניחו את האיברים הפתוחים בכלי זכוכית המכיל PBS ונערו בעדינות כדי לשטוף את הצואה.לאחר שטיפת העקום, העבירו אותו למנת Petri נקייה והשתמשו בפינצטה קמורית חלקה כדי לשלוף בעדינות את התולעים. העבירו את כל התולעים מכל עכבר לבאר אחת של פלטת שש בארות (six Well plate) המכילה 5 mL של DMEM מועשר באנטיביוטיקה. הניחו את פלטת שש הבארות יחד עם נייר סופג לח בתוך מכל Tupperware והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות כדי לאפשר לתולעים להטיל ביצים.לאחר דגירה זו, השתמשו בפינצטה כדי להוציא את התולעים מהבאר המקורית ופזרו אותן לשתי בארות חדשות המכילות DMEM. חלוקת התולעים באופן זה תמקסם את השחזור של ביצים באמצעות פיפטה. אספו את המצע שנותר, המכיל אנטיגן מופרש וביצים, מהבאר המקורית והעבירו אותו לפקת Falcon של 15 milliliter.סובב את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 3000 RPM למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוצא ושמור את הנוזל העליון המכיל את האנטיגן בן ארבע השעות, ושטוף את המשקע שבמבחנה במים סטריליים. הנח שוב את פלטת ששת הבארים המכילה את התולעים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius והדגר אותה למשך הלילה, עד למחרת בבוקר.לאחר השלכת התולעים, אספו את תכולת הבארות כפי שהודגם קודם לכן וסובבו את הנוזל העליון (supernatant) כדי לבודד את הביצים. שמרו את הנוזל העליון המכיל את האנטיגן מהלילה הקודם והשעיקו מחדש את הביצים במים. כפי שנעשה קודם לכן, שלבו ביצים אלו עם הביצים שהתקבלו מהדגירה של ארבע שעות.סננו את הביצים דרך מסננת של 70 מיקרון כדי להסיר שאריות תולעים. לאחר מכן, העבירו אותן לבקראק ריבועית של 75 סנטימטר. כסו את הבקראק בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מאור ואחסנו את הביצים למשך שש שבועות בטמפרטורת החדר.פעולה זו תאפשר לביצים להבשיל ולעבור עובריות לאחר ששה שבועות. יש לשטוף את הביצים, להוציא את המים על ידי ערבוב ולספור את הביצים החיות. ניתן לראות זאת כאן.כדוגמה לביצה עוברית חיונית וביצה שאינה חיונית, השתמשו בריכוז אקסטר של 50 ל-50 µL. בנקודה זו, ניתן לאחסן את הביצים בטמפרטורה של 4 °C לפני הדבקת העכברים. ודאו שאתם מרעידים היטב את התמיסה המכילה את הביצה.העבירו את הכמות הרצויה של האינוקולום למבחנה עם מכסה נסנאפ (snap cap) בנפח 14 מיליליטר והפכו את המבחנה כדי לערבב. שאבו 200 microliters של ביצים לתוך מחט הזנה בגודל מתאים לגודל החיה, המחוברת למזרק של one milli liter. קבעו את העורף של העכבר והחדירו את הביצים באמצעות זריקה פומית (oral gavage).החזירו את העכבר המודבק לכלובו ואפשרו לזיהום להתפתח במשך 21 ימים. לאחר 21 ימים, השתמשו במזרק שאינו מכיל הפרין כדי לדגום דם מהעכברים המודבקים באמצעות דקירה של הלב (cardiac puncture). לאחר ביצוע המתת חסד באמצעות פחמן דו-חמצני, ניתן לאחסן את דגימות הדם בטמפרטורה של 4°C.לבידוד סרום וניתוח של IgGs ו-IgE ספציפיים ל-tra באמצעות ELISA. חשוף את חלל הבטן של העכבר כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי לשלוף את המעי העיוור בעזרת מספריים או זוג פינצטות נוסף.דחפו את המעי הדק ימינה כדי לחשוף את קשרי הלימפה של המזנטרום (mesenteric lymph nodes). הסירו בעדינות את קשרי הלימפה, תוך הקפדה לא לחתוך את המעיים, והעבירו אותם לשפופרת Falcon של 15 milliliter המכילה שני milliliters של מצע גידול. ניתן יהיה להאכיל מאוחר יותר את תאי קשרי הלימפה in vitro עם עלה (supernatant) של אנטיגן S שגודל במשך ארבע שעות בתרביות תולעים, וזאת כדי לנתח את התגובה החיסונית התאית לטפיל.לאחר איסוף קשרי הלימפה, כרית את העיוור (secum) והמעי הגס כפי שמתואר קודם לכן. בעזרת פינצטה, שחרר גרגירי צואה מהמעי הגס הדיסטלי והנח אותם במבחנה של 2 mL המכילה חמצן; ניתן לשמור את הגרגרים בטמפרטורה של 20-°C ולנתח את תכולת החלבון באמצעות Western blot. בעזרת מספריים, גזור כ-1 cm מהמעי הגס הפרוקסימלי והנח במבחנה המכילה RNA. שמור לאחר מכן בטמפרטורה של 4°C.גזרו כחמישה מילימטרים מקצה העקום (cecum), תוך כדי החזקת קצה העקום בעזרת פינצטה. השתמשו במזרק של שלושה מיליליטר ובמחט gauge 22 כדי לשטוף את הדגימה ב-PBS. לאחר מכן, העבירו אותה למבחנה עם מכסה מסוג snap cap בנפח של חמישה מיליליטר המכילה 4% paraldehyde.ניתן לשמור את דגימת העקום שקובעה בפראלדהיד בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ולהשתמש בה לניתוח היסטולוגי. הניחו את שאר העקום בצלחת פטרי והקפיאו במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי להרוג את התולעים. לצורך ספירה קלה יותר של התולעים, הפשיתו את העקום והניחו אותו, באמצעות מספריים, בצלחת פטרי המכילה כחמישה מיליליטר של מים.גזרו את המעי העיוור כדי לחשוף את הלומן ונערו אותו כדי לאסוף את הצוואה לתוך צלחת. הניחו את המעי העיוור הנקי בתוך צלחת פטרי נקייה המכילה מים והשתמשו בפינצטה מעוקלת וחלקה כדי לגרד את תאי האפיתל של המעי. העבירו את המעי העיוור לצלחת פטרי חדשה המכילה מים וקרעו את הרקמה לחתיכות קטנות.בחנו את הצואה, את תאי האפיתל של המעי ואת רקמת העקום תחת מיקרוסקופ דיסקציה וספרו את התולעים, תוך הסרתן בזמן הספירה והצבתן בצלחת נקייה. כך צריכות להיראות התולעים בעקום לפני ואחרי הבידוד, כפי שמוצג כאן. בעקבות זיהום של tragus mirrors, עכברים מסוג black six מסוגלים לשלוט בטפילים, בעוד שעכברים מסוג KR מפתחים עומס טפילי מוגבר.באופן דומה, עכברי A KR רגישים מפתחים titers גבוהים משמעותית של IgG ספציפי ל-TRA מאשר עכברי black six, כפי שנקבע ב-Eliza של הסרום. בניסוי זה, אנליזה של Western blot גילתה כי כמות החלבון realm beta הספציפי לתאי הגביע הייתה מוגברת בצואה של עכברי black six, אך לא של עכברי A KR בעקבות זיהום. אנליזה היסטולוגית של העקום הדיסטלי מראה היפרפלזיה של תאי הגביע וייצור ריר בעכברי TRAs MOUs עמידים ובעכברי black six מזוהמים, אך לא בעכברי A KR רגישים.לאחר צפייה בסרטון זה, יהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להרביה ביצי trismus, להדביק עכברים ניסויים, ולקצור את רקמות המעי, המזו, קשרי הלימפה האנטריים ודם לצורך ניתוח זיהום בעכברים רגישים או עמידים.

trichuris-muris-infection-model-type-2-immunity-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

דגמים ניסיוניים של מחלות מעי דלקתיות אפשרו לנו לבחון את התגובות מורכב החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות הקשורים בפתוגנזה. באמצעות הניקוד היסטולוגית, כימות של תומכי ציטוקינים דלקתיים ופעילות myeloperoxidase, אפשר להתחיל להעריך את התגובות הללו לראות מחלות מעי דלקתיות.

חקירת דלקת מעיים במודל DSS-Induced של IBD

ileus לאחר הניתוח (POI) הוא סיבוך של ניתוח בטן מוביל לתחלואה ואשפוז ממושך. בגלל אסטרטגיות מניעות או טיפול חסרות מחקר התעצם הוא הכרחי. לכן הקמנו מודל עכבר סטנדרטי וריאלי כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של POI וללמוד אפשרויות טיפוליות פוטנציאליות.

הערכה תפקודית של תנועתיות מעיים ודלקת דופן מעי במכרסמים: ניתוח בדגם סטנדרטי של מניפולצית מעיים

זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר ללמוד זיהומים חיידקיים enteric כמו גם לארח תגובות וקוליטיס חיסוניים בעכברים. פרוטוקול זה מתאר מדידה של יושרת מכשול, עומס הפתוגן ופגיעת היסטולוגית מאפשרת אפיון היסודי של תרומות פתוגן ומארח לקוליטיס המדבק העכברי.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; דגם עכבר: תרומות הפתוגן ומארח לומדים קוליטיס המדבק

מודלים של בעלי החיים הוכיחו להיות כלי רב ערך בהגדרת מנגנונים ספציפיים מארח ופתוגן שתורמים להתפתחות של דלקת כרונית. כאן אנו מתארים מודל עכבר של זיהום אוראלי עם הפתוגן האנושי Porphyromonas gingivalis ומתודולוגיות פרט כדי להעריך את ההתקדמות של דלקת באתרים מקומיים ומערכתיים.

מודל של עכברים של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים ומערכתיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברה מאמצת של תאי Tגבוהים CD4+CD45RB סינגניים לנמענים חסרי תאי T ו-B. מאפיינים קליניים והיסטופתולוגיים מחקים מחלות מעי דלקתיות אנושיות. שיטה זו מאפשרת לחקור את התחלת דלקת המעי הגס והתקדמות המחלה.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

במודל קוליטיס מונע אנטיגן זה, תאי OT-II CD4+ T המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום הועברו באופן מאומץ לעכברי RAG-/- המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בפגוציטים חד-גרעיניים (MPS). המארחים אותגרו עם Escherichia coli (E.coli) המבטא את חלבון האובאלבומין (OVA) שהתמזג לחלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP).

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

כאן מוצג פרוטוקול כדי לחקות את הכניסה של נגזר בקטריאלי תרכובות לאחר פריצה מכשול המעי. מינון נמוך לא קטלני של ליפופוליסכריד היה מוזרק מערכתית עכברים, אשר היו במעקב במשך 24 שעות לאחר ההזרקה. הביטוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים נקבע במספר נקודות זמן הטחול, הכבד, המעי הגס.

זריקות של ליפופוליסכריד לתוך עכברים לחקות כניסה של מוצרים מיקרוביאלית נגזר לאחר פריצה מכשול המעי

מאתר למעי הגס דיסטלי מספק מודל מאתר הסחה האנושי קוליטיס, קוליטיס בעיקר לימפוציטית קטע המעי הגס נכללו הנחל צואה.

מאתר למעי הגס הדיסטלי, מודל הרומן של הסחה קוליטיס בעכברים C57BL/6

פרוטוקול זה מתאר מודל העכבר של סלמונלה פיברוזיס המעי מונחה הדומה הסימנים העיקריים מפתח פתולוגי של מחלת קרוהן כולל דלקת קיר ופיברוזיס. שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך גורמים מארחים לשנות את התוצאות הפיברוטיות באמצעות עכברים מוטציה המתוחזקות על C57Bl/6 רקע גנטי.

סלמונלה כרונית זיהום דלקת מעיים פיברוזיס

בפרוטוקול זה מתואר מודל קוליטיס אימוץ של תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים. תאי CD4+ T מבודדים מעכברים מהונדסים CBir1 TCR. אלה הם ספציפיים עבור מיקרוביוטה המעי immunodominant אנטיגן CBir1 flagellin, אשר מועבר לתוך המטופל Rag1-/- עכברים, המוביל דלקת מעיים.

אינדוקציה של דלקת מעיים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR תאי CD4 + TCR מהונדסים לעכברים חיסוניים

הפרוטוקול המפורט שלנו מתאר את היצירה והשימוש במודל מעי על שבב מתקדם, המדמה רירית מעיים אנושית עם מבנים תלת-ממדיים וסוגי תאים שונים, ומאפשר ניתוח מעמיק של תגובות חיסוניות ותפקודים תאיים בתגובה להתיישבות מיקרוביאלית.

מודל מעי-על-שבב חיסוני לניתוח תגובות חיסוניות של רירית המעי

למדו כיצד להקים מודל זיהום טבעי ב-Trichuris muris באמצעות מתן פומי של ביצי תולעת לעכברים. חקירת התגובות החיסוניות מסייעת להבנת מנגנוני החסינות מסוג Th2 והדלקת במעיים.

Trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים

גלה סרטונים נוספים