Trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להקים ולתחזק מודל של זיהום טבעי ב-Hain. ראשית, עכברים מודבקים בביצי *Tricurulus mirrors* באמצעות זקיפה רבבית (oral gavage). לאחר 21 ימים, בעלי החיים המודבקים מושמדים (euthanized) ונדגמים דם, קשרי לימפה מזנטריים, גרגירים צואתיים, מעיים הגסות ועיקריים (ceca).

באמצעות דגימות אלו, ניתן לנתח את התגובה החיסונית שנוצרה נגד tricks. Mirrors. ניתן לנתח דגימות סרום באמצעות ELISA כדי לזהות נוגדנים ספציפיים ל-TRA.

ניתן לבצע גרייה חוזרת (restimulation) in vitro של תאי קשרי לימפה כדי לנתח תגובות חיסוניות תאיות. ניתן להשתמש ב-Western blot של כדורי צואה להערכת תכולת חלבונים, וניתן לבצע ניתוח ביטוי גנים באמצעות אנליזת QPCR של המעי הגס. לבסוף, ניתן להשתמש בקצה העקום (cecum) לבדיקות היסטולוגיה, בעוד שניתן להשתמש בשאר העקום כדי לקבוע את עומס התולעים בעכברים מזוהמים.

בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות אם עכבר הוא עמיד או רגיש לזיהום ב-trais MOUs, וניתן לאפיין את התגובה החיסונית שהופעלה נגד הטפיל. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון אילו גורמים שולטים בהפעלה של תאי T helper, וכן אילו חלבונים נדרשים לדיפרנציאציה של תאי TH two. ניתן להרבות ביצי Trauss MOUs בעכברים עם חסר חיסוני או בזנים רגישים גנטית כגון a KR, כאשר 35 ימים לאחר ההדבקה ניתן לאסוף את הביצים מעכברים שהורדמו.

חשוף את פני השטח הגבתיים של החיה ושטוף את בטנו של העכבר באתנול באמצעות פינצטה ומספריים סטריליים. אחוז בעור הבטן ובצע חתך קטן. חשוף את תוכן הבטן, זהה את המעי העיוור ואת המעי הגס הפרוקסימלי, ולאחר מכן הסר אותם.

העבירו את האיברים לצלחית פטרי בקוטר 10 סנטימטר המכילה DMEM מועשר, עם פניצילין וסטRepartition streptomycin. לאחר מכן, חתכו את העקום ואת המעי הגס הפרוקסימלי, כדי לחשוף את הלומן ואת התולעים באמצעות פינצטה. הניחו את האיברים הפתוחים בכלי זכוכית המכיל PBS ונערו בעדינות כדי לשטוף את הצואה.

לאחר שטיפת העקום, העבירו אותו למנת Petri נקייה והשתמשו בפינצטה קמורית חלקה כדי לשלוף בעדינות את התולעים. העבירו את כל התולעים מכל עכבר לבאר אחת של פלטת שש בארות (six Well plate) המכילה 5 mL של DMEM מועשר באנטיביוטיקה. הניחו את פלטת שש הבארות יחד עם נייר סופג לח בתוך מכל Tupperware והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות כדי לאפשר לתולעים להטיל ביצים.

לאחר דגירה זו, השתמשו בפינצטה כדי להוציא את התולעים מהבאר המקורית ופזרו אותן לשתי בארות חדשות המכילות DMEM. חלוקת התולעים באופן זה תמקסם את השחזור של ביצים באמצעות פיפטה. אספו את המצע שנותר, המכיל אנטיגן מופרש וביצים, מהבאר המקורית והעבירו אותו לפקת Falcon של 15 milliliter.

סובב את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 3000 RPM למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוצא ושמור את הנוזל העליון המכיל את האנטיגן בן ארבע השעות, ושטוף את המשקע שבמבחנה במים סטריליים. הנח שוב את פלטת ששת הבארים המכילה את התולעים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius והדגר אותה למשך הלילה, עד למחרת בבוקר.

לאחר השלכת התולעים, אספו את תכולת הבארות כפי שהודגם קודם לכן וסובבו את הנוזל העליון (supernatant) כדי לבודד את הביצים. שמרו את הנוזל העליון המכיל את האנטיגן מהלילה הקודם והשעיקו מחדש את הביצים במים. כפי שנעשה קודם לכן, שלבו ביצים אלו עם הביצים שהתקבלו מהדגירה של ארבע שעות.

סננו את הביצים דרך מסננת של 70 מיקרון כדי להסיר שאריות תולעים. לאחר מכן, העבירו אותן לבקראק ריבועית של 75 סנטימטר. כסו את הבקראק בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מאור ואחסנו את הביצים למשך שש שבועות בטמפרטורת החדר.

פעולה זו תאפשר לביצים להבשיל ולעבור עובריות לאחר ששה שבועות. יש לשטוף את הביצים, להוציא את המים על ידי ערבוב ולספור את הביצים החיות. ניתן לראות זאת כאן.

כדוגמה לביצה עוברית חיונית וביצה שאינה חיונית, השתמשו בריכוז אקסטר של 50 ל-50 µL. בנקודה זו, ניתן לאחסן את הביצים בטמפרטורה של 4 °C לפני הדבקת העכברים. ודאו שאתם מרעידים היטב את התמיסה המכילה את הביצה.

העבירו את הכמות הרצויה של האינוקולום למבחנה עם מכסה נסנאפ (snap cap) בנפח 14 מיליליטר והפכו את המבחנה כדי לערבב. שאבו 200 microliters של ביצים לתוך מחט הזנה בגודל מתאים לגודל החיה, המחוברת למזרק של one milli liter. קבעו את העורף של העכבר והחדירו את הביצים באמצעות זריקה פומית (oral gavage).

החזירו את העכבר המודבק לכלובו ואפשרו לזיהום להתפתח במשך 21 ימים. לאחר 21 ימים, השתמשו במזרק שאינו מכיל הפרין כדי לדגום דם מהעכברים המודבקים באמצעות דקירה של הלב (cardiac puncture). לאחר ביצוע המתת חסד באמצעות פחמן דו-חמצני, ניתן לאחסן את דגימות הדם בטמפרטורה של 4°C.

לבידוד סרום וניתוח של IgGs ו-IgE ספציפיים ל-tra באמצעות ELISA. חשוף את חלל הבטן של העכבר כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי לשלוף את המעי העיוור בעזרת מספריים או זוג פינצטות נוסף.

דחפו את המעי הדק ימינה כדי לחשוף את קשרי הלימפה של המזנטרום (mesenteric lymph nodes). הסירו בעדינות את קשרי הלימפה, תוך הקפדה לא לחתוך את המעיים, והעבירו אותם לשפופרת Falcon של 15 milliliter המכילה שני milliliters של מצע גידול. ניתן יהיה להאכיל מאוחר יותר את תאי קשרי הלימפה in vitro עם עלה (supernatant) של אנטיגן S שגודל במשך ארבע שעות בתרביות תולעים, וזאת כדי לנתח את התגובה החיסונית התאית לטפיל.

לאחר איסוף קשרי הלימפה, כרית את העיוור (secum) והמעי הגס כפי שמתואר קודם לכן. בעזרת פינצטה, שחרר גרגירי צואה מהמעי הגס הדיסטלי והנח אותם במבחנה של 2 mL המכילה חמצן; ניתן לשמור את הגרגרים בטמפרטורה של 20-°C ולנתח את תכולת החלבון באמצעות Western blot. בעזרת מספריים, גזור כ-1 cm מהמעי הגס הפרוקסימלי והנח במבחנה המכילה RNA. שמור לאחר מכן בטמפרטורה של 4°C.

גזרו כחמישה מילימטרים מקצה העקום (cecum), תוך כדי החזקת קצה העקום בעזרת פינצטה. השתמשו במזרק של שלושה מיליליטר ובמחט gauge 22 כדי לשטוף את הדגימה ב-PBS. לאחר מכן, העבירו אותה למבחנה עם מכסה מסוג snap cap בנפח של חמישה מיליליטר המכילה 4% paraldehyde.

ניתן לשמור את דגימת העקום שקובעה בפראלדהיד בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ולהשתמש בה לניתוח היסטולוגי. הניחו את שאר העקום בצלחת פטרי והקפיאו במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי להרוג את התולעים. לצורך ספירה קלה יותר של התולעים, הפשיתו את העקום והניחו אותו, באמצעות מספריים, בצלחת פטרי המכילה כחמישה מיליליטר של מים.

גזרו את המעי העיוור כדי לחשוף את הלומן ונערו אותו כדי לאסוף את הצוואה לתוך צלחת. הניחו את המעי העיוור הנקי בתוך צלחת פטרי נקייה המכילה מים והשתמשו בפינצטה מעוקלת וחלקה כדי לגרד את תאי האפיתל של המעי. העבירו את המעי העיוור לצלחת פטרי חדשה המכילה מים וקרעו את הרקמה לחתיכות קטנות.

בחנו את הצואה, את תאי האפיתל של המעי ואת רקמת העקום תחת מיקרוסקופ דיסקציה וספרו את התולעים, תוך הסרתן בזמן הספירה והצבתן בצלחת נקייה. כך צריכות להיראות התולעים בעקום לפני ואחרי הבידוד, כפי שמוצג כאן. בעקבות זיהום של tragus mirrors, עכברים מסוג black six מסוגלים לשלוט בטפילים, בעוד שעכברים מסוג KR מפתחים עומס טפילי מוגבר.

באופן דומה, עכברי A KR רגישים מפתחים titers גבוהים משמעותית של IgG ספציפי ל-TRA מאשר עכברי black six, כפי שנקבע ב-Eliza של הסרום. בניסוי זה, אנליזה של Western blot גילתה כי כמות החלבון realm beta הספציפי לתאי הגביע הייתה מוגברת בצואה של עכברי black six, אך לא של עכברי A KR בעקבות זיהום. אנליזה היסטולוגית של העקום הדיסטלי מראה היפרפלזיה של תאי הגביע וייצור ריר בעכברי TRAs MOUs עמידים ובעכברי black six מזוהמים, אך לא בעכברי A KR רגישים.

לאחר צפייה בסרטון זה, יהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להרביה ביצי trismus, להדביק עכברים ניסויים, ולקצור את רקמות המעי, המזו, קשרי הלימפה האנטריים ודם לצורך ניתוח זיהום בעכברים רגישים או עמידים.