הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין תאים דנדריטיים למחקרי הדמיה באמצעות גבישי ננו נקודות Q. זה מושג על ידי בידוד תאי מח עצם תחילה ממורן, עצם הירך והשוקה. לאחר מכן, תרביות תאי מח עצם מוגדרות כדי להקל על התמיינות התאים לתאים דנדריטיים בנוכחות CSF מהונדס גנטית.

לאחר מכן התאים הדנדריטים מתאוששים מתרביות תאי מח העצם לאחר שמונה ימים. השלב האחרון של ההליך הוא לצבוע את התאים בגבישי Q ננו פלואורסצנטיים. בסופו של דבר, ניתן לדמיין תאים דנדריטיים מוכתמים בבהירות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

היתרון העיקרי בשימוש בטכנולוגיה זו בהשוואה לשיטות אחרות כמו שימוש בתאים דנדריטיים עם תג GFP, הוא שגבישי ננו נקודות Q שומרים על הקרינה שלהם גם לאחר צביעה בממיסים אורגניים כמו אצטון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח אצל ביולוגים של תאים דנדריטיים, כגון תכונות נדידה של תאים אלה במחלות שונות או בהקשר של מחלות שונות. מי שתדגים את הליך הצביעה תהיה מריה עלי, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.

לאחר ההקרבה, נתחו בזהירות את השוקה ועצם הירך משני עכברים מבלי לחתוך את קצות העצם. לאחר מכן השתמש בנייר טישו כדי לנקות את כל הרקמות המחוברות מהעצמות, היזהר לא לשבור אותן. במכסה מנוע של בטיחות ביולוגית.

ממלאים צלחת פטרי בגודל 35 מילימטר באתנול 70%, ואז טובלים את העצמות באתנול למשך 10 דקות. לאחר עיקור העצמות, החזירו אותן מהאתנול ותנו להן להתייבש באוויר במשך חמש דקות בצלחת פטרי חדשה. כעת, חותכים את עצם הירך באמצע ואת השוקה בקצה הדק ביותר שלהם.

להחדיר לחלק הפנימי של העצמות מיליליטר אחד של מדיום RPMI באמצעות מזרק סטרילי. אוספים את מתלה התא בצינור של 15 מיליליטר ושוטפים אותו פעמיים עם מדיום RPMI על ידי צנטריפוגה של 10 דקות ב-300 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה עם רוטור דלי מתנדנד. לאחר השטיפה האחרונה, יש להחיות את התאים בשני מיליליטר של ליזיס CK, לחצץ ולדגור למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על מנת לחסל כדוריות דם אדומות.

לאחר מכן, הוסף 13 מיליליטר RPMI בתוספת 10% FBS ושטוף את התאים פעמיים נוספות במדיום זה עם אותן הגדרות צנטריפוגה כמו קודם. ספור את התאים והתאם את הריכוז לפעמיים 10 עד התאים החמישיים למיליליטר. עם RPMI בתוספת 10% FBS הוסף עכברים רקומביננטיים G-M-C-S-F לריכוז סופי של 20 ננוגרם למיליליטר.

לאחר מכן הוסף 10 מיליליטר של תרחיף זה לצלחת פטרי באיכות מיקרוביולוגית סטרילית של 10 סנטימטר ותרבות. תרחיף התאים בחממת פחמן דו חמצני. שלושה ימים לאחר מכן, הוסף עוד 10 מיליליטר RPMI בתוספת 10% FBS עם 20 ננוגרם למיליליטר של עכברים רקומביננטיים G-M-C-S-F לכל אחת מהצלחות המוכנות.

שלושה ימים נוספים לאחר מכן, החזר 10 מיליליטר של תרחיף תאים מכל צלחת פטרי, צנטריפוגה של התאים באותם תנאים והשהה מחדש את הכדור באותו נפח של RPMI בתוספת 10% FBS כפי שהוחזר מצלחות הפטרי וחידש את המלאי בעכברים רקומביננטיים חדשים G-M-C-S-F. לבסוף, החזירו את תרחיף התאים לכל צלחת פטרי מקורית ותרבו את התאים במשך יומיים נוספים באינקובטור הפחמן הדו חמצני. לאחר שמונה ימים בתרבית, שחזר את התאים הצפים והדבקים באופן רופף על ידי שטיפת כלי הפטרי במדיום טרי.

לאחר מכן סמן את התאים שנאספו עם ערכת תיוג התאים Q tracker 6 55 תוך הקפדה על הוראות היצרן לתייג חמש פעמים 10 עד שישית של dcs שמקורם במח עצם עכברים עם גבישי Q nano בריכוז של 10 ננו מולארי. ראשית מערבבים חמישה מיקרוליטר מכל אחד ממרכיבי הערכה A ו-B בצינור אינור, ומדגרים את התערובת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של RPMI בתוספת 10% FBS, וסובב את הצינור למשך 30 שניות.

לאחר מכן, הוסף חמש כפול 10 לחמישית. Dcs מושעה ב-0.5 מיליליטר RPMI בתוספת 10% FBS לצינור ה-einor ודוגר על התאים בתמיסת D ב-37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים ב-RPMI בתוספת 10% FBS באותם תנאים כמו קודם, והשעו מחדש את הגלולה ב-RPMI.

איור זה מציג דוגמה לתצלום מיקרו פלואורסצנטי של dcs. מיד לאחר התיוג, טיפה של תאים מסומנים הונחה על מגלשת זכוכית וכוסה על ידי פתק כיסוי. לאחר מכן הדגימות הוערכו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

באיור זה, ניתן לראות תצלום מיקרו פלואורסצנטי של dcs לאחר 48 שעות, התבגרות במבחנה. Dcs תורבבו במשך 48 שעות עם 100 ננוגרם למיליליטר, LPS ו-20 ננוגרם למיליליטר, TNF אלפא על תאי תרבית שקופיות בחממת פחמן דו חמצני. לאחר מכן נשטפו הדגימות עם PBS קבוע באצטון, כתם נגד עם DPI והוערכו באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט.

dcs מסומנים שהבשילו במבחנה נותחו על ידי זרימה ציטומטרית Q נקודה תאים מוכתמים נותנים אות חזק ב-FL שלושת ערוץ Q לעשות מוכתמים ולא מוכתמים. בנוסף נצבעו DCS בנוגדנים ספציפיים כנגד סמני התבגרות, CD 86 ו-CD 40, ותאי ביקורת איזוטיפ נותחו לאחר מכן על ידי ציטומטריית זרימה. בנוסף, רמות IL 6 ותחמוצת החנקן נקבעו בסופרנטנטים של DCS בצבע Q בוגר ובקרות.

כאן מוצגת דמות מייצגת של DCS מסומן ברקמה מנותחת מסומנת. dcs בוגרים הוזרקו תוך ורידי לשישה עכברים שחורים C 57. שלושה ימים לאחר מכן, העכברים הוקרבו והטחול נאסף.

הצמד קפוא מוטבע ב-OCT ושמונה חלקי מיקרון הוכנו באמצעות קריוסטט. לאחר מכן תוקנו הדגימות באצטון, כתם נגדי עם DPI, והוערכו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ביצוע נהלים אלה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תנוחת אנטיגן או התבגרות עם גירויים שונים על מנת לענות על שאלות נוספות כגון נדידת תאים דנדריטיים בתגובה לגירויי התבגרות שונים.