הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב
2 ביוני 2011
תאים דנדריטים ספיגת אנטיגנים ולנדוד אל האיברים החיסונית להציג אנטיגנים לתאי T מעובד. Qdot ננו תיוג מספק אות ניאון ארוכת טווח ויציבה. זה מאפשר מעקב של תאים דנדריטים לאיברים שונים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
המטרה הכללית של הליך זה היא להכין תאי דנדריטים למחקרי דימוי באמצעות ננו-גבישים של נקודות קוונטום (Q dot). זאת מושג תחילה על ידי בידוד תאי מחית עצם מהחumerus, הפמורס והטיביות. לאחר מכן, מקימים תרביות של תאי מחית עצם כדי להקל עלהתמיינות התאים לתאי דנדריטים בנוכחות GM CSF.
לאחר שמונה ימים, מחלצים את התאים הדנדריטיים מתרביות תאי מח העצם. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא צביעת התאים באמצעות ננו-גבישים פלואורסצנטיים של Q. לבסוף, ניתן להדגים תאים דנדריטיים שנצבעו בצורה חזקה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
היתרון המרכזי בשימוש בטכנולוגיה זו בהשוואה לשיטות אחרות, כמו שימוש בתאי דנדריטיים המסומנים ב-GFP, הוא שגבישי ננו של Q dot שומרים על הפלורסצנציה שלהם גם לאחר צביעה בממסים אורגניים כגון אצטון. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של תאים דנדריטיים, כגון תכונות הנדידה של תאים אלו במחלות שונות או בהקשר של מחלות שונות. את הליך הצביעה תדגים מריה עלי, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלי.
לאחר ההקרבה, נתחו בזהירות את השוקיים (tibia) והירכיים (femurs) משני עכברים, ללא חיתוך של קצות העצמות. לאחר מכן, השתמשו בנייר סופג כדי לנקות את כל הרקמות הצמודות לעצמות, תוך הקפדה שלא לשבור אותן. בצעו את הפעולה תחת מ 빠르게 מabilis (biosafety hood).
מלאו צלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר ב-70% ethanol, ולאחר מכן השקיעו את העצמות ב-ethanol למשך 10 דקות. לאחר עיקור העצמות, הוציאו אותן מה-ethanol והניחו להן להתייבש באוויר במשך חמש דקות בצלחת פטרי חדשה. כעת, חתכו את ה-femur במרכזו ואת ה-tibia בקצה הדק ביותר שלה.
הזריקו לתוך העצמות 1 mL של מצע RPMI באמצעות מזרק סטרילי. אספו את תרחיף התאים לשפופרת של 15 mL ושטפו אותו פעמיים עם מצע RPMI על ידי סבב צנטריפוגה של 10 דקות ב-300 ×g בטמפרטורה של 4 °C בצנטריפוגה בעלת רוטור של דליים נדנדים (swinging bucket rotor). לאחר השטיפה האחרונה, השעיו מחדש את התאים ב-2 mL של באפר CK lysis, והדגירו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר תאי דם אדומים.
בשלב הבא, הוסיפו 13 milliliters של RPMI בתוספת 10%FBS ושטפו את התאים פעמיים נוספות במדיום זה, תוך שימוש בהגדרות הצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן. ספרו את התאים והתאימו את הריכוז ל-2 × 10⁵ תאים ל-milliliter. ב-RPMI בתוספת 10%FBS, הוסיפו recombinant murine G-M-C-S-F לריכוז סופי של 20 nanograms ל-milliliter.
לאחר מכן, העבירו 10 milliliters של תרחף זה לצלח פטרי סטרילי באיכות מיקרוביולוגית בקוטר 10 centimeter והדרימו את תרחף התאים באינקובטור פחמן דו-חמצני. לאחר שלושה ימים, הוסיפו לכל אחת מהצלחות שהוכנו 10 milliliters נוספים של RPMI בתוספת 10%FBS עם 20 nanograms per milliliter של recombinant murine G-M-C-S-F.
שלושה ימים לאחר מכן, השבו 10 milliliters של תרחיף תאים מכל פטרית פטרי, סובבו את התאים בצנטריפוגה תחת אותם תנאים והשביו את המשקע בנפח זהה של RPMI בתוספת 10%FBS כפי שהושב מהפטרייה, והוסיפו recombinant murine G-M-C-S-F חדש. לבסוף, החזירו את תרחיף התאים לכל פטרית פטרי מקורית והדגירו את התאים למשך יומיים נוספים באינקובטור הפחמן הדו-חמצני. לאחר שמונה ימים של תרבית, השבו את התאים הצפים והתאים בעלי ההיצמדות הרפויה על ידי שטיפת פטריות הפטרי במצע טרי.
לאחר מכן, סמנו את התאים שנאספו באמצעות ערכת סמון התאים Q tracker 6 55, בהתאם להוראות היצרן, כדי לסמן 5×10⁶ תאי DCs ממחולקת גרמיים של עכבר באמצעות גבישי Q nano בריכוז של 10 nM. ראשית, ערבבו 5 µL מכל אחד מרכיבי הערכה A ו-B בתוך פוליפאוטוב (Eppendorf tube), והדגרו את התערובת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של RPMI עם 10% FBS, וערבבו את המבחנה במכשיר וורטקס למשך 30 שניות.
בשלב הבא, הוסף 5×10⁵ תאי Dcs המושעים ב-0.5 milliliters של RPMI פלוס 10%FBS למבחנה, ודגור את התאים בתמיסת ה-D בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 60 דקות. לאחר מכן, שטוף את התאים פעמיים ב-RPMI פלוס 10%FBS תחת אותם תנאים כפי שבוצע קודם לכן, והשעה מחדש את המשקע ב-RPMI.
איור זה מציג דוגמה של מיקרוגרפ פלואורסצנטי של dcs. מיד לאחר הסימון, הונחה טיפה של תאים מסומנים על גשמיית זכוכית וכוסתה באמצעות כיסוי זכוכית. לאחר מכן, הדגימות נבחנו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
באיור זה ניתן לראות תצלום מיקרוסקופי פלואורסצנטי של dcs לאחר 48 שעות של הבשלה במעבדה (in vitro). ה-Dcs תורגדו למשך 48 שעות עם 100 nanograms per milliliter של LPS ו-20 nanograms per milliliter של TNF alpha בתאי תרבית על סלייד בתוך אינקובטור פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, הדגימות נשטפו ב-PBS, קובעו באמצעות אצטון, צבעו ב-DPI ונבחנו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Dcs מסומנים שהבשילו in vitro נותחו באמצעות ציטומטריה של זרימה; תאים שצבעו ב-Q dot נתנו אות חזק בערוץ FL 3, לעומת תאים שצבעו ב-Q do ותאים שלא נצבעו. ה-Dcs נצבעו בנוסף באמצעות נוגדים ספציפיים לסמני הבשלה, CD 86 ו-CD 40, ובקרות איזוטייפ; התאים נותחו לאחר מכן באמצעות ציטומטריה של זרימה. בנוסף, נקבעו רמות של IL six וחנקן חמצני (nitric oxide) בסופרנטנטים של DCS בשליים שצבעו ב-Q ובקרות.
כאן מוצגת דמות מייצגת של DCS מסומן ברקמה חתוכה. dcs בוגרים הוזרקו תוך-ורידית לעכברי C 57 black six. שלושה ימים לאחר מכן, העכברים הוקרבו והטחולים נאספו.
הדגימות הוקפאו במהירות ב-OCT ונחתכו לפרוסות בעובי של שמונה מיקרון באמצעות קריוסטט. לאחר מכן, הדגימות קובעו באמצעות אצטון, עברו צביעה נגדית עם DPI ונבחנו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. התהליך בוצע לפי פרוצדורות אלו.
ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון חשיפה לאנטיגן או הבשלה באמצעות גירויים שונים, על מנת להשיב על שאלות נוספות, כגון נדידת תאי דנדריטיים בתגובה לגירויי הבשלה שונים.
סקירה כללית
מחקר זה מתואר פרוטוקול להכנת תאים דנדריטיים לצורך דימות באמצעות ננו-גבישי Qdot. השיטה מאפשרת ויזואליזציה של תאים דנדריטיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ומספקת תובנות לגבי תכונות הנדידה שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- תאי דנדריטיים ממלאים תפקיד מכריע בתגובה החיסונית על ידי הצגת אנטיגנים לתאי T.
- ננו-גבישים מסוג Qdot מספקים אות פלואורסצנטי יציב למעקב אחר תאים.
- שיטה זו משפרת את חקר התנהגותם של תאים דנדריטיים בהקשרים של מחלות שונות.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא לספק את אותה רמה של יציבות פלואורסצנטית.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לסימון תאי דנדריטיים באמצעות ננו-גבישים של Qdot.
- סיוע במעקב אחר תאים דנדריטיים in vivo.
- בחינת תכונות הנדידה של תאים דנדריטיים במודלים שונים של מחלות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד תאי מחול מחולו של עכברים.
- תרבית תאים עם GM-CSF לצורך התמיינות לתאים דנדריטיים.
- צביעה של תאים דנדריטיים באמצעות ננו-גבישים מסוג Qdot.
- ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריה של זרימה.
תוצאות עיקריות
- תאי דנדריטיים שסומנו בהצלחה הפגינו אותי פלואורסצנציה חזקים.
- הוכח כי לננו-גבישים של Qdot יציבות גבוהה יותר בהשוואה לתגי GFP.
- בוצע ויזואליזציה של הבשלה ונדידה של תאים דנדריטיים in vitro ו-in vivo.
- סופקו תובנות לגבי מנגנוני התגובה החיסונית המערבים תאים דנדריטיים.
מסקנות
- טכניקת השיוך של Qdot יעילה לחקר הדינמיקה של תאים דנדריטיים.
- שיטה זו יכולה להעמיק את ההבנה של התנהגות תאים דנדריטיים במגוון מחלות.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בגישה זו כדי לחקור גירויי הבשלה שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
סימון של תאים דנדריטיים באמצעות ננו-גבישים מסוג Qdot מאפשר פלואורסצנציה יציבה וארוכת טווח למעקב אחר נדידת תאי מערכת החיסון במודלים פרה-קליניים. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בפיתוח אימונותרפיה על ידי אספקת ויזואליזציה אמינה של הדינמיקה של תאים מציגי אנטיגן. השיטה מגבירה את הביטחון בניבוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי התאמה לצפייה ישירה בהתנהגות של תאים דנדריטיים במערכות רלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של נתיבי הגירה של תאי דנדריטיים והצגת אנטיגנים במודלים של מחלות.
- ערך תפעולי: מספק סימון פלואורסצנטי יציב שנשמר במהלך קיבוע וחשיפה לממסים, ובכך מפחית את אובדן האות במהלך עיבוד הרקמה.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף פונקציונלי של תכשירים ביולוגיים המבוססים על תאים דנדריטיים על ידי מעקב אחר מיקום in vivo ומצב הבשלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תוצאות פלואורסצנציה מדידות להערכת מצבי הבשלה והפעלה של תאי דנדריטיים.
- ערך תפעולי: תואם לפלטפורמות של ציטומטריה זרימה ומיקרוסקופיה, מה שמאפשר סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של תרכובות אימונומודולטוריות.
- מוכנות הבדיקה: מייצר סדרות סטנדרטיות של תאים דנדריטיים מסומנים המתאימות לבדיקות פרופיל חיסוני הדירות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מסייע במעקב אחר הגירה של תאים דנדריטיים מרקמות פריפריאליות לאיברים לימפואידיים, תוך מידול של השגחה חיסונית.
- ערך תפעולי: מאפשר מחקרי דימוג אורך במודלים של עכברים להערכת תגובות חיסוניות המושרות על ידי חיסון או עזרים (adjuvants).
- המשכיות תרגומית: תומך במחקרים המותאמים לסמנים ביולוגיים על ידי קשירת המיקום של התאים הדנדריטיים לתוצאות חיסוניות תפקודיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת בתהליך הגילוי, החל משלב אישור המטרה המוקדם ועד לאפיון חיסוני פרה-קליני, ומאפשרת ויזואליזציה של דינמיקת תאי דנדריטיים כמדד תפקודי בסריקה של מודולטורים חיסוניים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות הנוגעות לתפקוד תאי דנדריטיים בלכידת אנטיגנים, נדידה והפעלת תאי T.
- סריקה: מאפשר הכנה סטנדרטית של תאים דנדריטיים מסומנים לצורך סריקת תרכובות ואפיון של מודולטורים אימונולוגיים.
- אנליטיקה: מספק תוצאות כמותיות של פלואורסצנציה וציטומטריה של זרימה להשוואת הבשלה והפעלה של תאים דנדריטיים בתנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין התנהגות תאים דנדריטיים in vitro לדפוסי תנועה in vivo במודלים עכבריים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לסימון תאי מערכת החיסון שניתן להשתמש בה שוב במגוון פרויקטים לגילוי אימונותרפיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתגובות חיסוניות המתווכות על ידי תאים דנדריטיים באמצעות מעקב יציב וארוך טווח.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות בין מעבדות באמצעות פרוטוקול סימון סטנדרטי ושונות מינימלית בין סדרות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשכיות הפיתוח (go/no-go) בפיתוח אימונותרפיה, על ידי אספקת ראיות חזותיות ישירות למעורבות המטרה ולתנועת תאי חיסון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד וסדרי עדיפויות של מועמדים מותאמים לסיכון, בהתבסס על פרופילי הגירה ומודולציה מאושרים של תאים דנדריטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים ראשוניות, בטכניקה סטרילית ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי בגישה לערכות סימון Qdot, לציטומטרים זורמים ולמכשיר קריוסטט לחיתוך רקמות.
- מחייב סטנדרטיזציה של תזמון התמיינות התאים וריכוז הסימון בין המשתמשים.
- התאמה למודלים של תאי דנדריטיים אנושיים עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי הציטוקינים ויעילות הסימון.
- מגבלות מעשיות כוללות התגבשות פוטנציאלית של Qdots בריכוזים גבוהים וצורך בטיטרציה מדויקת כדי למנוע ציטוטוקסיות.
