Name: שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T09:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: למד שיטת דגימת שיער לא פולשנית לחקר אקולוגיה וגנטיקה של שימור ביונקים קטנים החמקמיקים. הטכניקה מאפשרת איסוף DNA איכותי מפיקה אמריקאית ללא הפרעה לחיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות ל אוונס, ב גריינג&#39;ר, ד Rissling, צ&#39;סים, א גודווין, Hayhurst ק וד Kuch לסיוע בתחום. ק חביב Galbreath סיפקו דגימות pika כבד מן Coola בלה העמק. תודה א Gonçalves דה סילבה ו - ק לארסן לדיונים המעניינים שתרמו לעיצוב של שיטת הדגימה פולשני זה גנטי. עבודה זו מומנה על ידי למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה דיסקברי, ו UBC מחקר Okanagan הפרט מענקים מרס השוויצרית הלאומית למדע מלגת קרן דוקטורט PBSKP3_128523 נתמך PH. מחקר זה נערך בעקבות פרוטוקול טיפול בבעלי חיים מאוניברסיטת קולומביה הבריטית (מספר תעודה: A07-0126).

1. שיער מוקש לפני הקמת מוקש, מיקום אידיאלי צריך להיות נחוש בתוך הגידול pika או מדרון שפיע. זה כולל ערימות חציר, שהם מצבורי צמחייה החיות לאסוף בסוף הקיץ, כמו גם scats טרי שנמצאו באתרים השירותים. רצועות של נייר אריזה (10-50 ס"מ אורך) הם מגולגלת כדי לספק משטח 360 מעלות דביק מסודרים בצורה אינטרנט כמו על המעטפה הכניסה ערימת השחת של pika (איור 1) או השירותים באתר. בהתאם לתצורת הסלעים, חתיכת חוט דיג ניתן להשתמש כדי לתמוך את המבנה של מוקש את השיער, אבל זה בדרך כלל לא נחוץ כאשר הכניסות הם די קטנים (&lt;30 ס"מ קוטר), תיאור מלא של השימוש חוט דיג ניתן למצוא הנרי Russello (2010) 3. מלכודות שיער נבדקים לעתים קרובות ככל האפשר, דגימות שיער שהופקדו על הקלטת (איור 2) נאספים אז שכותרתו. לאחר מועבר בחזרה למעבדה, שערות יוסרו מן הקלטת דביק באמצעות מלקחיים סטריליות והועברו לתוך צינורות קירור ומאוחסנים ב -20 ° C עד מניפולציה נוספת. דגימות שיער מקובצים יחד לאורך מוקש שיער נחשבים שייכים לאדם אחד, בעוד דוגמאות התקבצו באופן עצמאי הם הניחו להשתייך אנשים שונים. במקרה האחרון, שיער ממוקם אז צינורות שונים. הנחות אלה יכול להיות מאוחר יותר נבדק בדרך של טביעות אצבעות DNA וחישובים של הסתברות של זהות המבוססת על נתונים genotypic microsatellite. 2. מיצוי DNA מאז pika שיער דק מאוד ומכיל נורת שורש זעיר, אנו הראו בעבר כי לפחות 25 שערות נדרשים להשיג כמויות מספיקות של DNA לטוב הגברה במורד איכות PCR 3. השתמשנו במערכת ה-DNA IQ (Promega, במדיסון, וויסקונסין, ארה"ב) גרסה שונה מעט של הוראות היצרן לבידוד דנ"א דגימות שיער. ראשית, המדגם השיער הוא סובב את בצנטריפוגה מיקרו על מנת למנוע אובדן של השיער תוך פתיחת הצינור. אז הפתרון הדגירה הוא מוכן על ידי ערבוב 80 μl של פתרון הדגירה עם 10μl של DTT (1M) ו 10μl של proteinase K (18ng/ml) לתוצאות בריכוז סופי של 0.1 M ו - DTT 1.8ng/ml של דגירה ק proteinase הפתרון (100 μl) מתווסף המדגם מודגרות על 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. בינתיים, הפתרון תמוגה מוכן ידי הוספת 1 μl של DTT (1M) עבור כל 100 μl של חיץ תמוגה, וכתוצאה מכך ריכוז DTT הסופי של 0.01M. פתרון תמוגה הוכן (200 μl) הוא הוסיף אז המדגם, יחד עם 7 μl של שרף IQ DNA, vortexed למשך 3 שניות במהירות גבוהה מודגרות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. המדגם vortexed ואז למשך 2 שניות הוכנס לעמוד המגנטי, שם ההפרדה של חרוזים מגנטיים מפתרון מתרחשת. הפתרון שנותר הוא aspirated ואז מושלך, נזהר לא להפריע גלולה של שרף מגנטי. המדגם הוא טיפל אז עם 100 μl של הפתרון תמוגה מוכן, vortexed וחזר לעמוד המגנטי שבו ההפרדה מתרחשת שוב. המאגר תמוגה הוא aspirated וזנוח, וזה צעד חוזרת שלוש פעמים באמצעות חיץ לשטוף (100 μl). המדגם הוא עזב לאחר מכן לייבוש לעמוד המגנטי במשך 15 דקות. לאחר יבש, 100 μl של חיץ elution מתווסף המדגם מודגרות על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. המדגם vortexed ונוסף לעמוד המגנטי. הפתרון עכשיו המכיל את ה-DNA eluted הוא הועבר לאחר מכן צינור 1.5 Eppendorf מ"ל ו המאוחסן -20 ° C עד מניפולציות נוספות. דגימות דנ"א כבד הופק גם באמצעות מערכת IQ דנ"א המשמש כביקורת חיובית amplifications PCR. 3. PCR הגברה הדנ"א המתקבל מוקש שיער פולשנית שלנו דגימות כבד שימשו אז להגביר חבילה של סמנים מולקולריים נפוץ (microsatellite, AFLP, המיטוכונדריאלי ציטוכרום B ו ZFX / ZFY סמן sexing). PCRs בוצעו באמצעות תרמית Veriti Cycler (Applied Biosystems, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב) בנפח 25 μL המכיל: 10-20 ng DNA, 0.5 מיקרומטר של כל פריימר, 10 mM טריס-HCl (pH 8.3), 50 מ"מ KCl, 1.5 mM MgCl 2, 200 מיקרומטר dNTPs, 10 μ שור בסרום אלבומין (BSA, ניו אינגלנד Biolabs, Ipswich, מסצ'וסטס, ארה"ב) ו 0.5 U AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA (Applied Biosystems). פרמטרים רכיבה על לוקוסים microsatellite היו אופטימיזציה באמצעות רכיבה על אופניים הנגיעה התוכנית (10 דק 'ב 95 ° C, 35 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 30 של חישול, ו 45 שניות ב 72 מעלות צלזיוס, ואחריו צעד סופי ב 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות). הטמפרטורה חישול ירידה של 1 ° C לכל מחזור 60-55 ° C עד שהגיע במחזור השישי, ובשלב 29 המחזורים הנותרים המשיכו ב 55 ° C. פרמטרים רכיבה על שברי המיטוכונדריה תוארו לעיל, אלא כללה 35 מחזורים עם חישולטמפרטורה של 50 ° C. Amplified אורך קטע פולימורפיזם נערך בעקבות פרוטוקול עבור הגנום חוליות שתואר על ידי בונין 4. לבסוף, sexing מולקולרית בוצע באמצעות PCR-RFLP של ZFX / ZFY לוקוסים עם העיכול הגבלה HinfI האנזים 5. המוצרים PCR מן, AFLPs microsatellite ו ציטוכרום רצפים B נוהלו על נתח ABI 3130XL גנטי (Applied Biosystems), בעוד מתעכל ZFX / ZFX שברי נוהלו לצד סולם נ"ב 100 (ניו אינגלנד Biolabs) על 3% agarose ג'ל המכיל 2.5% ג'ל בטוח SYBR DNA כתם (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה, ארה"ב) ו דמיינו באמצעות הדמיה אדום אישי ג'ל המערכת (אלפא Innotech, סן ליאנדרו, קליפורניה, ארה"ב). Microsatellite ו AFLPs היו דמיינו באמצעות Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) ואת chromatogram הדנ"א המיטוכונדרי היה דמיינו באמצעות Sequencher v4.7 (ג'ין קוד Corporation, אן הרבור, מישיגן, ארה"ב). 4. נציג תוצאות הדנ"א שנלקחו דגימות שיער שהושגו באמצעות מוקש פולשנית שלנו שימשו PCR להגביר סוג שונים של סמנים מולקולריים. כבסיס להשוואה, חילוץ באמצעות דגימות DNA הכבד היה מוגבר לצד דגימות שיער שלנו. גרעיני לוקוסים microsatellite היו מוגבר בהצלחה לשיער והן דגימות כבד (איור 3). למרות עוצמת האות היה גדול יותר בעת השימוש דגימות כבד, זה לא להשפיע לרעה על הניקוד גנוטיפ (איור 3). תוצאות דומות הושגו כאשר באמצעות AFLPs (איור 4), רצפי DNA המיטוכונדרי (איור 5), ואת סמן ZFX / ZFY sexing מולקולרית (איור 6). <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. דוגמה מוקש שיער פולשנית שהוקמה על ערימת חציר. רצועות של נייר מגולגל אריזה ברור מסודרים אופנה אינטרנט כמו לסגור את הכניסה ערימת השחת. חתיכה של חוט דיג משמש כאן כדי לספק תמיכה נוספת עבור מוקש השיער. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. מוקש שיער מוצלח המכיל מספר רב של שיער תקוע לקלטת האריזה. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Chromatogram נציג microsatellite גרעיני (Ocp6) 8 מוצג כפי Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Chromatogram העליון התקבל על ידי ה-DNA הגברה של רקמת הכבד, והוא הטרוזיגוטיים (354/358) בשעה מוקד זה. Chromatogram התחתון מייצג אדם אחר מציג גנוטיפ הטרוזיגוטי (358/362) המבוסס על ה-DNA המופק שיער. בעוד האות של chromatogram מן המדגם שיער יש עוצמה נמוכה יותר מאשר במדגם הכבד, הבקיע גנוטיפ אינו מושפע לרעה הבדל זה האות. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. Chromatogram AFLP נציג (E31T32) מוצג כפי Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Chromatogram העליון התקבל על ידי ה-DNA הגברה של רקמת הכבד, chromatogram התחתון מייצג את ה-DNA המופק שיער. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. רצף ה-DNA המיטוכונדרי נציג chromatogram (ציטוכרום B) מוצג כפי Sequencher v4.7 (ג'ין קוד Corporation). Chromatogram העליון התקבל על ידי ה-DNA הגברה של רקמת הכבד, chromatogram התחתון מייצג את ה-DNA המופק שיער. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. Sexing נציג סמן מולקולרי (ZFX / ZFY) מוגבר של הכבד והן דגימות שיער. גישה זו נשענת על תצפית כי כרומוזום Y בעל אתר הגבלה HinfI באזור זה כי חסר כרומוזום X. לכן, נשים לייצר שני שיתוף נודדות שברים של 432 נ"ב תוך הזכרים לייצר שברי 432 נ"ב, 261 נ"ב ו - 171 נ"ב.

<ol><li>Kendall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demography+and+Genetic+Structure+of+a+Recovering+Grizzly+Bear+Population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wildlife+Manage%22%5BJournal%5D)">Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population.</a> J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).</li>
<li>Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+genetic+evaluation+of+population+size%2C+natal+philopatry%2C+and+roosting+behavior+of+non-breeding+eastern+imperial+eagles+%28Aquila+heliaca%29+in+central+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Conserv.+Genet%22%5BJournal%5D)">A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia.</a> Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).</li>
<li>Henry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+population+structure+and+ex+situ+representation+of+the+endangered+Amur+tiger%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger.</a> Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).</li>
<li>Henry, P., Russello, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+high+quality+DNA+from+elusive+small+mammals+using+low-tech+hair+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Wildlife+Res%22%5BJournal%5D)">Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares.</a> Eur J Wildlife Res. , (2010).</li>
<li>Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+amplified+fragment+length+polymorphism+%28AFLP%29+markers+in+surveys+of+vertebrate+diversity.+Method+Enzymol+395%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395.</a> , 145-145 (2005).</li>
<li>Fontanesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexing+European+rabbits+%28Oryctolagus+cuniculus%29%2C+European+brown+hares+%28Lepus+europaeus%29+and+mountain+hares+%28Lepus+timidus%29+with+ZFX+and+ZFY+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci.</a> Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).</li>
<li>Piggott, M. P., Taylor, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+collection+of+animal+DNA+and+its+applications+in+conservation+management+and+understanding+the+population+biology+of+rare+and+cryptic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Wildl.+Res%22%5BJournal%5D)">Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species.</a> Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).</li>
<li>Banks, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demographic+monitoring+of+an+entire+species+%28the+northern+hairy-nosed+wombat%2C+Lasiorhinus+krefftii%29+by+genetic+analysis+of+non-invasively+collected+material%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material.</a> Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).</li>
<li>Litvaitis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+range-wide+survey+to+determine+the+current+distribution+of+New+England+cottontails%5BTitle%5D)+AND+%22Wildlife+Soc+B%22%5BJournal%5D)">A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails.</a> Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).</li>
<li>Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nine+polymorphic+microsatellite+loci+in+the+North+American+pika%2C+Ochotona+princeps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Notes%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps.</a> Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

דגימה גנטית פולשנית הפכה חלופה אטרקטיבית כדי המסורתית שיטות לכידה לחיות מכמה סיבות. ראשית, על ידי בחשאי לאסוף חומר ביולוגי (למשל, צואה, שערות, נוצות, רוק וריר) מאוכלוסיות הבר, החוקרים יכולים ללמוד מינים אלה מבלי להפריע, טיפול, או אפילו לצפות אותם, ובכך מקטין את הסיכונים הן חיות החוקרים. שנית, דגימה גנטית פולשנית מאפשרת לביולוגים לחקור אוכלוסיות של מינים חמקמקה ונדירה, משימה יכול להוכיח קשה לחיות עם השמנה הגישות המסורתיות יותר 6. ושלישית, NGS עלולה להגדיל את גודל המדגם על ידי צמצום הפרעה לבעלי חיים, מאמצים הדגימה, עלויות, ובכך מסייעת לצמצם הטיות אומדנים של פרמטרים באוכלוסייה 7. זו הנקודה האחרונה עשויה להוכיח מכריע בהתמודדות עם מינים מאוימים, שכן ההערכות מוטה של ​​פרמטרים האוכלוסייה עלול לגרום וניהול הולם. במאמר הנוכחי אנו מתארים וידאו שיטה פשוטה, חדשנית, זולה פולשנית מדגם יונקים קטנים חמקמק, באמצעות Pika האמריקאית כדוגמה. אנו מראים כי ה-DNA המופק שיער מבצע דומה ל-DNA שנלקחו דגימות כבד ביחס microsatellite, AFLP, המיטוכונדריה וסמנים sexing, מה שהופך את שיטת הדגימה פולשנית חלופה אטרקטיבית כדי לחיות דגימה או לכידה קטלנית. באופן כללי, אנו צופים כי שיטה זו תהיה שימושית בשלב איסוף הנתונים של מחקרים גנטיים התנהגותיים האוכלוסייה קטנה של מיני יונקים נדירים או חמקמק, תוך צמצום ההשפעה על אורגניזמים תחת מחקר.

שיער מוקש: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רולס של סרט אריזה ברור (3M, סנט פול, מינסוטה, ארה&quot;ב) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דייג קו (10 £) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריוגני צינור (2ml) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי מלקחיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנקן נוזלי דיואר (אופציונלי) </li></ul> מיצוי DNA: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת ה-DNA IQ (קט # DC6701; Promega) עם רקמת והוצאה שיער Kit (קט # DC6740; Promega). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MagneSphere ההפרדה Stand טכנולוגיה מגנטית (קט # Z5342; Promega) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרו צנטריפוגות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה תנור או מים באמבטיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 מ&quot;ל Eppendorf צינורות </li></ul>

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל dna באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

פולשנית גישות דגימה גנטית הם הופכים חשובים יותר ויותר ללמוד אוכלוסיות חיות הבר. מספר מחקרים דיווחו על שימוש בטכניקות דגימה פולשנית לחקור אוכלוסייה ודמוגרפיה גנטיקה של אוכלוסיות הבר 1. גישה זו הוכיחה להיות שימושי במיוחד כאשר התמודדות עם מינים נדירים או חמקמק 2. בעוד מספר שיטות אלה פותחו שיער מדגם, צואה חומר ביולוגי אחר טורפים ובינוניות יונקים, הם נשארו בעיקר נבדק אצל יונקים קטנים חמקמק. בסרטון הזה, אנו מציגים רומן, מוקש שיער זול פולשנית מכוון יונק קטן וחמקמק, pika האמריקאית (Ochotona princeps). אנו מתארים את כללי הגדרת מוקש של השיער, אשר מורכב רצועות אריזה קלטת מסודרים אופנה אינטרנט כמו והניח לאורך נתיבי נסיעה בבית הגידול של pikas. אנו מדגימים את היעילות של המלכודת על איסוף כמות גדולה של שיער כי אז יכול להיות אסף והביא למעבדה. לאחר מכן, אנו מדגימים את השימוש במערכת ה-DNA IQ (Promega) כדי לבודד דנ&quot;א להציג את התועלת של שיטה זו כדי להגביר סמנים מולקולריים נפוץ כולל מיקרו גרעיני, הגברה אורך קטע פולימורפיזמים (AFLPs), רצפים של המיטוכונדריה (800bp) וכן sexing סמן מולקולרי. בסך הכל, אנחנו מדגימים את השירות של מוקש שיער הרומן הזה לא פולשנית כטכניקה הדגימה ביולוגים אוכלוסיית חיות הבר. אנו צופים כי גישה זו תהיה ישימה מגוון רחב של יונקים קטנים, פתיחת אזורי החקירה בתוך אוכלוסיות טבעיים, תוך צמצום ההשפעה על אורגניזמים המחקר.

אנו מציגים גישה דגימה פולשנית ביעילות לאסוף דגימות שיער של יונקים קטנים חמקמק, כפי שמוצג על pika האמריקאי. אנו מדגימים את השירות של שיטה זו על ידי מיצוי דנ&quot;א של השיער שנדגמו הגברה מספר סוגים של סמנים מולקולריים נפוץ לימודי האקולוגיה ושימור חיות בר.

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

גישות לדגימה גנטית לא פולשנית הופכות לחשובות יותר ויותר למחקר של אוכלוסיות חיות בר. מספר מחקרים דיווחו על שימוש ב...

גנטיקאים של אוכלוסיות בר משתמשים יותר ויותר בגישות של דגימה לא פולשנית כדי להשיג נתונים מהמינים הנחקרים. גישות אלו הוכחו כשימושיות לבחינת שאלות הקשורות להתנהגות בעלי חיים, אוכלוסיות, דמוגרפיה וגנטיקה, במיוחד בבעלי חיים נדירים וחומקים; באמצעות איסוף מרחוק של חומרים ביולוגיים כגון שיער, חוקרים יכולים ללמוד על בעלי החיים ללא הפרעה, פגיעה או אפילו תצפית ישירה במינים הנחקרים. בעוד ששיטות אלה יושמו בעיקר על טורפים בגודל בינוני עד גדול, כגון דובים גריזלי, הושקע מאמץ מועט יותר ביונקים עשבוניים קטנים יותר כדי לגשר על פער זה.גישות חדשניות וחדשניות לדגימה של יונקים קטנים נמצאות כעת בפיתוח. מאמר וידאו זה מתאר דרך חדשה וחדשנית להשגת דגימות שיער בצורה בלתי מורגשת מפסונוקיים קטנים הנקראים פיקה אמריקאית. יונקים קטנים אלו נמצאים ברחבי רכס ההרים של צפון אמריקה, מניו מקסיקו וקליפורניה ועד למרכז קולומביה הבריטית.הם שוכנים במטמונות סלעים הנקראים Tala Slopes, המספקים מחסה מפני טורפים והגנה מתנאים סביבתיים קיצוניים. הם נמצאים בדרך כלל בגבהים העולים על 2,500 מטרים מעל פני הים בחלק הדרומי של טווח תפוצתם, אך ניתן למצוא אותם גם בגובה פני הים בחלק הצפוני ביותר של תפוצתם. פיקותים אינם שוכבים בתרדמה חורפית.הם פעילים לאורך כל היום במהלך הקיץ, אך מרכזים את פעילותם לשעות הבוקר והערב. כאשר הטמפרטורות נמוכות יותר, הם יוצאים אל המרגעות הסמוכות למדרון Tali כדי להזין מהצמחייה השכנה. מאפיין אחד של ה-PIKA הוא שאינו אוכל את מזונו רק בשטח הפתוח.הוא מחזיר אותה לשטחו ב-Tallis ומאחסן אותה בערי חציר. למרות שהמין ניתן לזיהוי בקלות, הוא ביישני מטבעו ולעתים קרובות ימנע ממלכודות חיות שהניחו חוקרים. יתרה מכך, נמצא כי פיקות רגישים לטיפול, דבר שעלול להוביל למות בעל החיים, לצורך חקר שורה של שאלות אקולוגיות, התנהגותיות ואבולוציוניות.במטרה לדגום את היונק הקטן והחמקמק הזה תוך מזעור ההשפעה עליו, פיתח פילפ הנרי, דוקטורנט מקמפוס אוקנאגן של אוניברסיטת הבריטיש קולומביה, טכניקת דגימה לא פולשנית המתאימה למין זה. לפני הצבת מלכודת, הוא מחפש ראיות לטריטוריות פעילות של פיקה (PIKA) במדרון טאליס. ראיות אלו כוללות ערמות חציר, שהן מאגרי צמחייה שהחיה אוספת בשלהי הקיץ כדי לשרוד את החורף, וכן גללים טריים.דבר זה נמצא בדרך כלל באתרי מחילה ספציפיים. לאחר זיהוי שיא פוטנציאלי של בית גידול בתוך ה-tlu, מציבים מלכודת שערות באופן אסטרטגי מעל הכניסה אליו. באמצעות גליל של סרט דביק לאריזה, פיליפ מגלגל במיומנות רצועות דבק ומסדר אותן בצורה דמוית רשת כדי להקיף את הפתח.כניסותיהן של מלכודות המסתור מעוצבות במבנים מורכבים המספקים פתח שאינו גדול מדי או קטן מדי עבור בעל החיים כדי לעבור דרכו. תיאורטית, הפיקה יעבור דרך הלולאה, וישאיר מאחור דגימה של פרוותו בעודו ממשיך במטלותיו היומיות ללא הפרעה. השערה עצמה דקה מאוד עם בסיס שורש זעיר.על מנת להשיג מדגם הולם לניתוח, רצוי לאסוף לפחות 25 שערות השייכות לאותו פרט. כמו כן, מיקומי הפגיעה חייבים להיות מובחנים לאורך הסרט. כל מקבץ שמופיע באופן עצמאי ייחשב כפרט נפרד.בעוד ששערות המקבצות יחד נחשבות כשייכות לאותו אדם, ניתן להסיר בזהירות את השערות שנאספו מהסרט בעזרת פינצטה סטרילית מבלי להפריע למבנה הדגימה, ובמיוחד לבצול השורש המכיל את הריכוז הגבוה ביותר של DNA גרעיני. לאחר מכן, השערה מונחת בזהירות בתוך מבחנה קריוגנית בנפח שני מיליליטר ומאוחסנת במיכל חנקן נוזלי עד שהדגימה מגיעה למעבדה לצורך ניתוח נוסף. עם הגעתה למעבדה, דגימת השערה מסובבת במיקרו-צנטריפוגה כדי למנוע אובדן שערות בעת פתיחת המבחנה. ה-DNA מופק מדגימות השערה באמצעות מערכת Promega DNA IQ; השלב הראשון כולל הכנת תמיסה המכילה 100 µL של תחביב אינקובציה, 1.8 mg/mL של proteinase K ו-0.1 M של DTT.מוסיפים 100 µL נוספים של תמיסת הדגירה לשיער ומדגירים בטמפרטורה של 56 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן מעבדים את הדגימה עם 200 µL של באפר ליזיס המכיל 0.01 M DTT ושבעה µL של שרף DNA IQ שהושעה. את הדגימה מערבלים במכשיר vortex במהירות גבוהה למשך שלוש שניות ומדגירים בטמפרטורת החדר למשך 5 עד 10 דקות.לאחר מכן, את הדגימה שעברה עיכול מערבלים ב-vortex למשך שתי שניות במהירות גבוהה ומניחים אותה במתקן הפרדה מגנטית. בנקודה זו, שרף המגנט המכיל את מקטעי ה-DNA מופרד באופן מיידי מהתמיסה ויוצר משקע בתחתית המבחנה. את התמיסה שנותרה מסלקים ומשליכים.בשלב הבא, הדגימה מטופלת שנית ב-100 µL של lysis buffer, מועברת למערבל (vortex) ומוחזרת למעמד המגנטי שבו מתבצעת ההפרדה. שלב זה חוזר על עצמו שלוש פעמים נוספות תוך שימוש ב-wash buffer. לאחר השטיפה האחרונה, הדגימה נשארת להתייבש במעמד המגנטי למשך 15 דקות.לאחר מכן, מוסיפים 100 µL של תמיסות אלוציה לדגימה ומדגירים בטמפרטורה של 65 °C למשך חמש דקות. לבסוף, את הדגימה מערבלים במכשיר vortex למשך שתי שניות ומניחים במעמד המגנטי. פתרון ה-DNA מועבר לאחר מכן לפקעון Eppendorf בנפח 1.5 mL ונשמר בטמפרטורה של 20- °C.עד לניתוח נוסף, שמי פיטר בוהי. אני דוקטורנט במעבדה לגנומיקה אקולוגית ושימור של ד"ר מייקל רוסו בקמפוס אוקנאגן של אוניברסיטת הבריטיש קולומביה. ה-DNA שחולץ מהשיער שדגמנו הקיץ שימש לאחר מכן ל-PCR, להגברה של סוגים שונים של סמנים מולקולריים.השתמשנו גם בדגימות כבד כביקורת חיובית וכבסיס. לצורך השוואת השיטה שלנו, הגברנו לוקי מיקרו-לוח (microsatellite) גרעיניים אשר ישמשו למחקר האוכלוסייה והמבנה הגנטי של בעל החיים שלנו, כמו גם סריקות גנומיות מסוג A FLP שישמשו למחקור הבסיס הגנטי של הסתגלות לאורך מדרג גבהים. כמו כן, הגברנו רצפי DNA מיטוכונדריאליים באורך של עד 800 זוגות בסיסים, אשר יכולים לשמש למחקר הפילוגיאוגרפיה של המין, והחלת כלי לזיהוי מין מולקולרי המבוסס על רצפי אצבע אבץ ו-P-C-R-R-F-L-P כדי לזהות את מינם של הפרטים באוכלוסיות שלנו.בכל הסמנים שנבדקו, DNA שהוצא מדגימות שיער וכבד הניב רמות דומות של רצף DNA ואיכות גנוטיפ. בסרטון זה, הדגמנו כי שיטת דגימה לא פולשנית זו, בשילוב עם פרוטוקול מיצוי ה-DNA IQ, היא יעילה, וכי השגת כמויות מספיקות של שיער מניבה DNA באיכות ובכמות מספקות להגברה באמצעות PCR. באופן כללי, אנו צופים כי שיטה זו תסייע בהקלה על איסוף נתונים לתמיכה במחקרים פופולציוניים, גנטיים והתנהגותיים של יונקים קטנים נדירים או חמקמקים, תוך מזעור ההשפעות על המינים הנחקרים.

a-noninvasive-hair-sampling-technique-to-obtain-high-quality-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

הגישה הישירה PCR מוצגת כאן מאפשרת הגברת PCR ישירות מכמויות קטנות של צמח unpurified ורקמות בעלי חיים.

Genotyping של דוגמאות צמחים ובעלי חיים, ללא טיהור DNA לפני

ניתוח רקמות ספציפית של מודל התחדשות זקיקי שיער באמצעות lentivirus לתווך רווח או פסד--of-פונקציה.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

אנו מתארים נהלים לתיוג וgenotyping עכברי יילוד ויצירת תרבויות עצביות עיקריות מהם. Genotyping הוא מהיר, יעיל ואמין, ומאפשר למיצוי גרעין חומצה אוטומטי. זה שימושי במיוחד עבור עכברי neonatally קטלניים והתרבויות שלהם שדורשות השלמה מוקדמת של genotyping.

המהיר Genotyping של בעלי חיים ואחרי הקמת תרבויות עיקריות של נוירונים במוח

כאן אנו מתארים אסטרטגית ההסרה מותאמת ויעילה לאיסוף ביו-חלקיקים הנמצאים ב'לגעת DNA 'דגימות, יחד עם פרוטוקול הגברה משופרת מעורב תמוגה מיקרו נפח 5 μl צעד אחד / הגברה STR, כדי לאפשר ההתאוששות של בד בבד חוזר קצרים (STR) פרופילים של התורם ביו-חלקיקים (ים).

ניתוח גנטי משופר של Bioparticles האדם יחיד ששוחזרו על ידי פשוטה מיקרומניפולציה מהראיות משפטית &quot;Touch DNA&quot;

במאמר זה נדגים איך מתבצעת טכניקת microbiopsy סופג ו איך המדגם יכולים לשמש לחילוץ RNA לדיגום סימולטני ופשוט של עור ודם בצורה פולשנית.

. Microbiopsy ספיגה דגימה והפקת RNA דם פולשנית ובו-זמניים וניתוח בעור

זהו פרוטוקול עבור הכנת רקמה אופטימלית עבור גנומית, טראנסקריפט, וניתוחים פרוטאומית של עטלפים נתפס בטבע. הוא כולל פרוטוקולים עבור לכידת בת וניתוח, שימור רקמות, ותא culturing של רקמת בת.

אוסף רקמות של עטלפים עבור-ניתוח Omics ותרבות התא הראשוני

הפרוטוקול הנוכחי מציג שיטה מהירה, יעילה ועדינה לבידוד תאים בודדים המתאימים לניתוח RNA-seq חד-תאי משיניים שיניים חד-תאיות של עכבר, שיניים שיניים לבנות עכבר ושיניים אנושיות הגדלות ללא הרף.

בידוד מהיר של תאים בודדים מעכבר ושיניים אנושיות

הפרוטוקול מציג סדרה של פרוטוקולים של שיטות עבודה מומלצות לאיסוף אבקת עצם משמונה מיקומי דגימה אנטומיים מומלצים (מיקומים ספציפיים על אלמנט שלד נתון) על פני חמישה יסודות שלד שונים מאנשים מימי הביניים (רדיוקרבון המתוארך לתקופה של 1040-1400 לסה"נ בקירוב, טווח 2-סיגמא מכויל).

פרוטוקולים אופטימליים לדגימת עצם לשליפת דנ"א עתיק משרידים ארכיאולוגיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט לדגימה גנטית לא פולשנית של אוכלוסיות פרפרים בהתבסס על איסוף שדה של שאריות פסולת ביצים. ניתן להשתמש בו כדי לאשר את זהות המין ולכמת שונות גנטית. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לקבוצות רחבות יותר למעורבות מדעית קהילתית.

פריסת מדעני קהילה לביצוע דגימה גנטית לא פולשנית של אוכלוסיות פרפרים נדירות

למד שיטת דגימת שיער לא פולשנית לחקר אקולוגיה וגנטיקה של שימור ביונקים קטנים החמקמיקים. הטכניקה מאפשרת איסוף DNA איכותי מפיקה אמריקאית ללא הפרעה לחיות.

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

גלה סרטונים נוספים