Vibratome חתך לשימור משופרת של Cytoarchitecture של איברים של יונקים של קורטי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדגים את איבר קורטיבי (organ of corti) תוך שימור מקסימלי של הארכיטקטורה התאית. דבר זה מושג על ידי חיתוך של אוזניים פנימיות מבודדות ומקובעות באמצעות ויברטום (vibratome) כדי לקבל חיתוכים עבים, תוך מזעור מספר משטחי החיתוך לכל שבלול. חיתוכי הוויברטום נצבעים לאחר מכן בשיטת אימונוהיסטוכימיה, המאפשרת זיהוי של סוגי תאים ומבנים תאיים שונים באיבר קורטיבי.

בשלב הבא, החתכים מורכבים ונמדדים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה המגדירות מיקומי Z. לאורך כל חתך עבה של Vibram מתקבלות תוצאות המאפשרות מיקרוסקופיה קונפוקלית של התאים והמבנים באיבר קורטי עם הפרעה מינימלית כתוצאה מתהליך החיתוך. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קיבוע בפראפין או חיתוך קריוגני, הוא שהנזק הפיזי לשבלול ממוזער, מה שמאפשר שימור טוב יותר של הארכיטקטורה התאית של איבר קורטי. כדי לבודד את האוזן הפנימית, ראשית, בצעו דקפיטציה לעכבר בוגר שהורדם באמצעות להב תער.

פתחו את הגולגולת לאורך קו האמצע ולאחר מכן הוציאו את המוח כדי לחשוף כל אוזן בעזרת פינצטה בזהירות, והוציאו את שתי האוזניים הפנימיות. טבלו את האוזניים הפנימיות במבחנה של קריו עם 4% paraformaldehyde טרי, ונערה אותה בעדינות למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, שטפו את המקבע בשלוש החלפות של 1x phosphate buffered saline, ובצעו דקלציפיקציה לרקמת המבוגר על ידי דגירה ב-10% EDTA בטמפרטורה של 4°C למשך חמישה ימים.

שטפו ואחסנרו את האוזניים הפנימיות ב-1x PBS עד למועד העיבוד. הכינו אגרוז nisk-melting בריכוז 4% על ידי הוספת האגרוז ל-1x PBS וחימום במיקרוגל עד להמסה מלאה של האגרוז. שמרו את האגרוז הנוזלי באמבט מים בטמפרטורה של 55 °C עד למועד השימוש.

הוצא את האוזן הפנימית מה-PBS באמצעות פינצטה והצב אותה בתחתית תבנית להטבעה בעלת קליפה נתיקה. שאב בעזרת פיפטה כל נוזל שנותר, ולאחר מכן מלא את התבנית ב-mol and aros כך שהאוזן הפנימית תכוסה לחלוטין, במטרה להפיק חתכים רוחביים דרך איבר קורטי (organ of corti). הצב את האוזן הפנימית כך שניתן יהיה לראותה מהצד, עם התעלת חצי השנה הלטרלית.

סבבו את האוזן הפנימית כך שהקו הנוצר מהאזור האחורי ביותר של ה-cochlear יהיה בזווית של 45 מעלות מהמישור המתוכנן של החיתוך. לאחר שה-agros התמצמץ, קלפו את תבנית הפלסטיק. השתמשו בלהב תער כדי לקטום את שאריות ה-aros וליצור קובייה.

יש לוודא שנותרה כמות מספקת של agarose מסביב כדי לשמור על תמיכה טובה ברקמה. במהלך החיתוך, הצמידו את בסיס קוביית ה-agarose למשטח החיתוך של ה-Vibratome באמצעות דבק מהיר, בצעו חיתוך בעובי של 40 עד 100 micron ואספו את הפרוסות לצלח המכיל 1x PBS עם 0.1% Triton X 100, תוך שימוש בפינצטה.

הפרידו את ה-aros מנתחי הרקמה. העבירו את הנתחים לצלה המכילה PBS טרי בריכוז 1x עם 0.1% Triton X 100, בעזרת טיפ פפיטה בעל פיה רחבה, והמשיכו בתהליך הצביעה בנוגדנים בתוך פלטה לתרבית רקמה. עם השלמת הצביעה בנוגדנים, העבירו את נתחי הרקמה להרכבה על זכוכית מיקרוסקופ.

כדי למנוע מעיכה של חתכי הרקמה העבים, הניחו שכבה של גריז ואקום בריבוע מסביב לחתך כדי ליצור מרווח בין זכוכית המכסה לבין העגילה. העבירו את חתך הרקמה אל עגילת מיקרוסקופ. לחצו בחוזקה על קצוות זכוכית המכסה כדי ליצור אטימה.

לחלופין, ניתן להניח נקודה של 1 µL של שרף כרומטוגרפיית agarose בגודל רשת ידוע בכל אחת מארבע הפינות שבהן תונח זכוכית הכיסוי, להניח את זכוכית הכיסוי ולאטום את הקצוות בלק גוף לפני ביצוע הדמיה. בתמונה הראשונה של סריקת z-stack דרך חתך coronal של ה-organ of Corti, נראים תאי השערה פנימיים, תאי שערה פנימיים סמוכים, תאי שערה חיצוניים ותאי Deiters. בצביעה גרעינית, תאי העמוד (pillar cells) נראים באמצעות צביעת נוגדן S100 ומופיעים בצבע צהוב. ככל שה-z-stack מתקדם דרך החתך בצעדים של 3 µm, ניתן לספור את מספר תאי העמוד על ידי סימון הופעתם והיעלמותם של גרעיניהם.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע חיתוכי האוזן הפנימית באמצעות vibram, ביצוע אימונוהיסטוכימיה על חיתוכים אלו, ולאחר מכן דימות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. פרוצדורה פשוטה זו, הניתנת להכללה עבור כל נוגדן, מבטיחה שימור מקסימלי של הארגון התאי של ה-organ of Corti.