Name: Vibratome חתך לשימור משופרת של Cytoarchitecture של איברים של יונקים של קורטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: למד שיטת חיתוך Vibratome לאיבר קורטי ביונקים לשימור מרבי של ארכיטקטורת תאים. השיטה משלבת אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיית קונפוקל לזיהוי מדויק של סוגי תאים שונים באוזן הפנימית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר מבקש להודות השימוש המחקר Core הילדים הדמיה המכון מיקרוסקופיה confocal ד&quot;ר ג&#39;אנג ג&#39;יאן על ההצעה לעלות חלקים באמצעות חרוזים agarose. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH DC010387.

1. בידוד קיבוע פנימי של האוזניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של דפוסים הסלולר האיבר של קורטי, להרדים כראוי מבוים עוברים או מבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הקפסולה otic, המכיל את האוזן הפנימית קרומי. בשנת העכבר, זה יכול להיעשות בקלות על העוברים על העובר (ה) ביום 14.5 ומעלה, שבה E0.5 הוא היום שבו תקע הנרתיק זוהה. Dissection של הקפסולה otic נעשה לראשונה על ידי עריפת ראש ופתיחת הגולגולת על קו האמצע. הסר המוח לחשוף כל אוזן (איור 1A). האוזניים הפנימי ניתן הפגיזו את מלקחיים באמצעות שלמים (כגון 1B דומון # 5, איור.). אם הדמיה האיבר של קורטי, הסרה זהירה של כל רקמות החיבור ואת עצבי הקשור הקפסולה otic אינו הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון אוזניים פנימי שלם על ידי טבילה paraformaldehyde 4% (PFA) עם נדנדה עדין ב 4 ° C במשך הלילה 1.8 בורג הכתיר מ"ל NUNC cryo-צינור בקבוקונים, או מכולה בגודל מתאים אחרים. פתרון PFA צריכה להיעשות טרי DDH 2 0, מאוחסן אז -20 ° C עד הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את מקבע עם שלושה שינויים של פוספט 1X בופר סליין (PBS). רקמות ניתן לאחסן סטרילי 1X PBS במשך ימים עד חודשים עד מוכן לעיבוד. עבור רקמות למבוגרים, decalcify ב EDTA 10% (0.27 מ ') בשעה 4 ° C למשך 5 ימים, ואחריהם שטיפה אחסון 1X PBS. </li></ol> 2. חיתוך חלקים vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% טמפ 'התכה נמוכה agarose ב 1X PBS. הוסף נקודת התכה נמוכה agarose אל 1X PBS ומיקרוגל עד agarose נמצא פתרון. תשמרי על עצמך כי הפתרון אינו בועה על - להוציא במיקרוגל מעת לעת מערבולת לערבב. שמור על פתרון אמבטיה 55 מעלות צלזיוס מים עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר את האוזן הפנימית מפתרון PBS 1X ואת המיקום בתחתית התבנית פיל-A-Way הטבעה. Pipet משם כל עודף 1X PBS מן התבנית. מלא עובש כדי לכסות את הרקמה עם שפע של נוזל 4% טמפ 'התכה נמוכה agarose (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את האוזן הפנימית עבור חתך במישור המתאים. אני השיגו טוב חתכים של האיבר של קורטי על ידי קירוב את המיקום של הקפסולה otic כאילו הושארו באתרם בראש חתך במישור רוחבי. עבור E14.5 עוברים למבוגרים, מקם את האוזן הפנימית, כך הוא מוצג בצורה רוחבית, עם התעלה חצי עגול לרוחב גלוי (איור 2B). זווית האוזן הפנימית, כך שנוצר על ידי קו הצד האחורי של הקפסולה otic כ בזווית של 45 מעלות מהמטוס המיועד של חתך (איור 2 א ', ב). כאשר הקפסולה otic מוצג כך את החלק הגבי של הקפסולה otic נמצא בראש, להפוך את הבסיס של שבלול צריך להיות ממוקם בתחתית (ראש חץ, איור. 2B) ואת תעלת קדמית חצי עגול (עולה) צריך להיות בחלק העליון (איור 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose תקבע ב RT בתוך 30 דקות. פיל, הרחק תבניות העברה המכיל רקמות מוטבע על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן סעיף. אם חתך יהיה לדחות עד למחרת, להוסיף 1X PBS כדי לכסות את agarose במתכונת ומאחסנים בקופסה המכילה מגבות נייר לח טבול 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף עובש הפלסטיק. באמצעות סכין גילוח, לגזור תיבת agarose המכיל את רקמות האוזן הפנימית. תשמרי על מנת להבטיח כי מטוס של סעיף זה ישר מקביל בצד השני של הרחוב, אשר יהיה משטח שעליו לחסום agarose מודבק למטה. מאז agarose לא לחדור את הרקמה, לא לקצץ יותר מדי agarose מרחבי הרקמה, כך רקמות יהיה נתמכות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדבק לצרף את גוש למשטח החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף ב עובי 40-100 מיקרומטר ידי vibratome. שמור סעיפים בצלחת רקמות תרבות מלא 1X PBS, 0.1% TritonX-100. סעיף נציג דרך הספירלה שבלול מוצג באיור. 2C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים לנתח משם את agarose מן הרקמה. Agarose לא יחדרו את הרקמה, אבל פשוט יהיה תקוע על פני השטח החיצוני של האוזן הפנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, בריכת agarose חינם, רקמה מחולק באמצעות pipet עם פתח גדול חור כדי למנוע מריחה מוגזמת של הרקמה. אם ביצוע כתמים נוגדן מרובים על רקמות שונות מרובות, ניתן לזהות קטעים מאורגן 16 - או 24 גם תרבות צלחת רקמות. </li></ol> 3. מכתים נוגדן vibratome בסעיפים המשך עם נוגדן הכתם. תהליך מקטעים שלמים הר, ריחוף ללא פתרון. להלן נוגדן למשל מכתים פרוטוקול סמן S100 של תאים מעמודי התווך של האיבר של קורטי, אבל הפרוטוקול יכול לשמש נוגדן כלשהו. שוטף כל נערכות בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל צלחת רב גם בתרבית רקמה, דגירה חופשי צף חלקים עם נדנדה עדין PBT (1X PBS, 1% שור טריטון בסרום אלבומין, 0.1% X-100) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון הישן לחסום חופשי floating קטעים עם נדנדה עדין PBT + עז בסרום נורמלי (50 NGS μl / 1 מ"ל PBT) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון הישן להוסיף נוגדן ראשוני בדילול מלא + PBT NGS (1:200 דילול S100 ב PBT + NGS). דגירה לילה ב 4 ° C עם נדנדה עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון נוגדן ראשוני. לשטוף 3X, 5 דקות. עם PBT, 4X ואז, 30 דקות. עם PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק עם PBT + NGS, 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני fluorescently-מצומדות (שהועלו עז) בדילול מלא + PBT NGS. דגירה לילה ב 4 ° C, או כמה שעות, RT, נדנדה עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את הפתרון נוגדנים משני. לשטוף 3X, 5 דקות. אז 4X, 30 דקות. עם PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את PBT האחרון לשטוף ולהחליף עם המדיום המתאים הרכבה מימית המכילה counterstain גרעיני. </li></ol> 4. חלקים הרכבה על שקופיות מיקרוסקופיה confocal כדי למנוע ריסוק בסעיפים עבה עם coverslip, כאשר גובר חלקים בודדים, spacer חייב להיות מוכנס בין שקופיות מיקרוסקופ ואת coverslip. להלן שתי שיטות חלופיות של חלקים הרכבה vibratome עבה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spacer אפשר ליצור על ידי הנחת שפה של שומן ואקום בתוך ריבוע סביב החלק רקמות. לכן, כאשר הנחת את coverslip, קצוות של coverslip יהיה חתום גריז ואקום. לחץ כלפי מטה על שולי coverslip עם האגודל כדי לדבוק בנחישות אותו לשקופית. אם גריז ואקום היא יפה אחיד הנוכחי סביב כל הקצוות של coverslip, החלק יהיה אטום מספיק לשימוש מיקרוסקופ confocal הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, spacer יכול להיות שנוצרו באמצעות agarose שרף כרומטוגרפיה של גודל רשת ידועה (כגון Affi-Gel ג'ל כחול, Bio-Rad). 1 Pipet μl של שרף לשקופית מיקרוסקופ בכל אחת מארבע פינות coverslip שבו יוצב. One Pipet רקמות סעיף התקשורת הרכבה לאמצע של ארבע נקודות של שרף. Coverslip. אם באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוכה, לאטום את coverslip לשקופית באמצעות מיקרוסקופ nailpolish. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג סעיפים אופטי של פרוסות vibratome מוכתמים באמצעות מיקרוסקופיה confocal. כדי לכמת את סוגי תאים שונים בתוך האיבר של קורטי, להשיג Z-מחסנית בגודל צעד מוגדר (בין 1.5 ל -3 מיקרומטר). מדורים צריך להיות נגד מוכתם לצבוע גרעינית (שלב 3.8). דמויות יכולות להיבחן על כל מסך המחשב לאחר אוסף תמונה confocal. תאים ניתן לספור ידני להיות התבוננות הופעה והיעלמות של הגרעינים כתמונות נבחנות ברצף באמצעות מחסנית-z. </li></ol> 5. נציג תוצאות: Confocal נציג Z-מחסנית באמצעות קטע vibratome, מוכתם עבור חלבון S100, אשר שוהה עמוד ותאי "Deiters, ו counterstained עם צבע גרעיני (איור 3A-F). פאנל כל התמונה confocal נלקחה ב 3 מיקרומטר, צעדים, עם פאנל התמונה confocal שהושגו הקרובים אל פני השטח של סעיף הפאנל vibratome ו-F התמונה confocal השיג רוב פנימי בתוך הקטע vibratome. מורפולוגיה של האיבר של קורטי מופיע שיבשו מינימלית. בפרט, שלוחות cytoplasmic של תאים עמוד אינם שבורים. לפי לציין את המראה ואת היעלמותו של גרעיני תאים באמצעות עמוד מחסנית-z (איור 3A ל 3F), תא פנימי וחיצוני כאחד מספר העמוד ניתן לספור (ראה מספור, איור 3A -. F). בשל המספר הקטן של כל סוג תא לכל תמונה confocal, גישה זו ניתן להשתמש כדי לספור תאים מסוגים ביותר בתוך האיבר של קורטי. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. אינטקט, 15 בן שבועיים, האוזניים הפנימי מבוגר עטוף הקפסולה otic. (א) קפסולה otic ימינה (בסוגריים) עטוף הגולגולת, שנצפו מנקודת מבט של בתוך הראש, לאחר ההסרה של המוח. Anterior נמצאת מימין. (ב) שלמים, 15 שבועות בן באוזן הפנימית לאחר דיסקציה מהגולגולת. משטח הרוחב של האוזן הפנימית שמאל גלוי; השטח המדיאלי של האוזן הפנימית זכות גלוי. תוויות לציין את מיקומם של הקדמי חצי עגול תעלה (עולה), שיתוף (שבלול), ו ow (חלון סגלגל). <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. (א) האוזן הפנימית שלמים מן מבוגר 15 בן שבוע, מוטבע agarose במרכז עובש פיל פרידה. המטוס מיועד סעיף מצוין. (ב) תקריב תמונה של אוזן, 15 בן שבועיים פנימי שלם לפני ההטבעה. חלק מן העצם שמסביב כבר גזור משם כך מבוך קרומי יכול לראות בצורה ברורה יותר. התעלה לרוחב חצי עגול (LSC), תעלה קדמית חצי עגול (עולה), וכן שבלול (במשותף) הם לייחס (עקומות לבן). להפוך את הבסיס של שבלול (ראש חץ) והמטוס נועד סעיף (קו מקווקו) מצוינים. (ג) נציג CROss-קטע דרך שבלול. בחתך אחד דרך צינור שבלול, האיבר של קורטי (OC) הוא התאגרף, vascularis stria (ד"ה) הוא בסוגריים, ואת הממברנה של Reissner (RM) מצוין. <img src="/files/ftp_upload/2793/2793fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. איבר קורטי בעכבר wild-type ב p21. (AF) סדרה confocal סדרתית, על תאים 3 מיקרומטר צעד בגודל, דרך איבר S100 נוגדן מוכתם של קורטי לדמיין את התאים העמוד Deiters ". ספירת התאים עמוד הפנימיים והחיצוניים מההתחלה עד הסוף של הסדרה ממוספרים. קיצורים: IHC (תא השיער הפנימי), aIHC (שיער סמוך התאים הפנימית), OHC (תא השיער החיצונית), מחשב (תא העמוד), DC (תא 'Deiters).

<ol><li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+of+the+organ+of+Corti%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hear Res. 22, 117-146 (1986).</li>
<li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+innervation+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).</li>
<li>Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp2+signaling+regulates+the+hepatic+versus+pancreatic+fate+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision.</a> Dev Cell. 15, 738-748 (2008).</li>
<li>Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+FGF+signalling+from+the+apical+ectodermal+ridge+in+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development.</a> Nature. 418, 501-508 (2002).</li>
<li>Trinh, L. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+regulates+epithelial+organization+during+myocardial+migration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish.</a> Dev Cell. 6, 371-382 (2004).</li>
<li>Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand2+regulates+extracellular+matrix+remodeling+essential+for+gut-looping+morphogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish.</a> Dev Cell. 18, 973-984 (2010).</li>
<li>Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty2%2C+a+mouse+deafness+gene%2C+regulates+cell+fate+decisions+in+the+auditory+sensory+epithelium+by+antagonizing+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling.</a> Dev Cell. 8, 553-564 (2005).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי בית הספר לרפואה של ויסקונסין IACUC.

ההליך של חתך vibratome, ואחריו הדמיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מאפשר להדמיה של האיבר של קורטי עם נזק לרקמות מינימלית. ברור confocal תמונות שנלקחו האזורים הפנימיים בסעיף vibratome להראות שימור מעולה של מורפולוגיה תאית מוגבל רק על ידי חפצים קיבעון. תמונות שצולמו Confocal קרוב לשני משטחים לחתוך קטע vibratome לעיתים קשה להבדיל בין תמונות מאזורים פנימיים, למרות השיבושים הסלולר מפעם לפעם, כמו הפסקות סיומות cytoplasmic של תאים עמוד נצפו (לא מוצג). גישה זו היא פשוטה, ואת הפריטים הציוד ה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> לייקה VT1000S רטט Blade Microtome </td><td> לייקה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zeiss LSM510 סריקת לייזר confocal מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סטודנט דומון # 5 מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> טמפ &#39;התכה נמוכה ultrapure agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16520-050 </td><td></td></tr><tr><td> פיל-A-Way הטבעה עובש </td><td> Polysciences </td><td> 18986 או 18646A </td><td></td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch </td><td> 001-000-162 </td><td></td></tr><tr><td> עיזים סרום </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td><td></td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 568 עיזים נגד ארנב IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11036 </td><td> 1:1000 דילול </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> וקטור Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> YO-PRO-1 </td><td> Invitrogen </td><td> Y3603 </td><td></td></tr><tr><td> ואקום גריז </td><td> דיג </td><td> S41718 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-Gel ג&#39;ל כחול </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7301 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibratome חתך לשימור משופרת של cytoarchitecture של איברים של יונקים של קורטי

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

האיבר של קורטי יונקים הוא פסיפס הסלולר הורה מאוד של שיער mechanosensory ותאים תומכים nonsensory (הנסקרת ב 1,2). ויזואליזציה של הפסיפס הזה הסלולר לעתים קרובות מחייב את האיבר של קורטי הוא בחתך רוחב. בפרט, עמוד nonsensory ותאי &quot;Deiters, שאת הגרעינים נמצאים basally ביחס לתאי שיער, לא יכול להיות דמיינו מבלי לחצות חתך את האיבר של קורטי. עם זאת, cytoarchitecture עדין של האיבר של קורטי היונקים, כולל תהליכים cytoplasmic קנס של העמוד ותאי &quot;Deiters, קשה לשמור על נהלים היסטולוגית שגרתיות כגון פרפין cryo-חתך, אשר תואם תקן טכניקות צביעה immunohistochemical. הנה אני מתארת ​​תהליך פשוט וחזק המורכב vibratome חתך של שבלול, מכתים immunohistochemical מהסעיפים האלה vibratome בהר שלמה, ואחריו מיקרוסקופיה confocal. הליך זה כבר בשימוש נרחב לניתוח immunhistochemical של איברים מרובים, לרבות ניצן העכבר איבר, בטן דג הזברה, כבד, לבלב, לב (ראו 3-6 דוגמאות נבחרות). בנוסף, הליך זה היה sucessful הדמיה והן quantitificaton של מספר העמוד תא באיברים מוטציה ובקרה של קורטי בשני עוברי עכברים בוגרים ו 7. שיטה זו, עם זאת, כרגע לא בשימוש נרחב לבחון את איבר יונקים של קורטי. הפוטנציאל עבור הליך זה הן לספק שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של איבר הבוגרת של קורטי לאפשר כימות של סוגי תאים שונים מתואר.

הליך פשוט של vibratome חתך את האיבר של קורטי, ואחריו מיקרוסקופיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מתואר. הליך זה מאפשר שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של האיבר של קורטי יונקים, וכתוצאה מכך מאפשר כימות מדויק של סוגי תאים.

Vibratome חתך לשימור משופרת של Cytoarchitecture של איברים של יונקים של קורטי

איבר קורטי (organ of Corti) ביונקים הוא פסיפס תאי מאורגן מאוד של תאי שיער מכנו-סנסוריים ותאי תמיכה שאינם סנסוריים (נסקר ב-1,2). ויזואליזציה של...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדגים את איבר קורטיבי (organ of corti) תוך שימור מקסימלי של הארכיטקטורה התאית. דבר זה מושג על ידי חיתוך של אוזניים פנימיות מבודדות ומקובעות באמצעות ויברטום (vibratome) כדי לקבל חיתוכים עבים, תוך מזעור מספר משטחי החיתוך לכל שבלול. חיתוכי הוויברטום נצבעים לאחר מכן בשיטת אימונוהיסטוכימיה, המאפשרת זיהוי של סוגי תאים ומבנים תאיים שונים באיבר קורטיבי.בשלב הבא, החתכים מורכבים ונמדדים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה המגדירות מיקומי Z. לאורך כל חתך עבה של Vibram מתקבלות תוצאות המאפשרות מיקרוסקופיה קונפוקלית של התאים והמבנים באיבר קורטי עם הפרעה מינימלית כתוצאה מתהליך החיתוך. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קיבוע בפראפין או חיתוך קריוגני, הוא שהנזק הפיזי לשבלול ממוזער, מה שמאפשר שימור טוב יותר של הארכיטקטורה התאית של איבר קורטי. כדי לבודד את האוזן הפנימית, ראשית, בצעו דקפיטציה לעכבר בוגר שהורדם באמצעות להב תער.פתחו את הגולגולת לאורך קו האמצע ולאחר מכן הוציאו את המוח כדי לחשוף כל אוזן בעזרת פינצטה בזהירות, והוציאו את שתי האוזניים הפנימיות. טבלו את האוזניים הפנימיות במבחנה של קריו עם 4% paraformaldehyde טרי, ונערה אותה בעדינות למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, שטפו את המקבע בשלוש החלפות של 1x phosphate buffered saline, ובצעו דקלציפיקציה לרקמת המבוגר על ידי דגירה ב-10% EDTA בטמפרטורה של 4°C למשך חמישה ימים.שטפו ואחסנרו את האוזניים הפנימיות ב-1x PBS עד למועד העיבוד. הכינו אגרוז nisk-melting בריכוז 4% על ידי הוספת האגרוז ל-1x PBS וחימום במיקרוגל עד להמסה מלאה של האגרוז. שמרו את האגרוז הנוזלי באמבט מים בטמפרטורה של 55 °C עד למועד השימוש.הוצא את האוזן הפנימית מה-PBS באמצעות פינצטה והצב אותה בתחתית תבנית להטבעה בעלת קליפה נתיקה. שאב בעזרת פיפטה כל נוזל שנותר, ולאחר מכן מלא את התבנית ב-mol and aros כך שהאוזן הפנימית תכוסה לחלוטין, במטרה להפיק חתכים רוחביים דרך איבר קורטי (organ of corti). הצב את האוזן הפנימית כך שניתן יהיה לראותה מהצד, עם התעלת חצי השנה הלטרלית.סבבו את האוזן הפנימית כך שהקו הנוצר מהאזור האחורי ביותר של ה-cochlear יהיה בזווית של 45 מעלות מהמישור המתוכנן של החיתוך. לאחר שה-agros התמצמץ, קלפו את תבנית הפלסטיק. השתמשו בלהב תער כדי לקטום את שאריות ה-aros וליצור קובייה.יש לוודא שנותרה כמות מספקת של agarose מסביב כדי לשמור על תמיכה טובה ברקמה. במהלך החיתוך, הצמידו את בסיס קוביית ה-agarose למשטח החיתוך של ה-Vibratome באמצעות דבק מהיר, בצעו חיתוך בעובי של 40 עד 100 micron ואספו את הפרוסות לצלח המכיל 1x PBS עם 0.1% Triton X 100, תוך שימוש בפינצטה.הפרידו את ה-aros מנתחי הרקמה. העבירו את הנתחים לצלה המכילה PBS טרי בריכוז 1x עם 0.1% Triton X 100, בעזרת טיפ פפיטה בעל פיה רחבה, והמשיכו בתהליך הצביעה בנוגדנים בתוך פלטה לתרבית רקמה. עם השלמת הצביעה בנוגדנים, העבירו את נתחי הרקמה להרכבה על זכוכית מיקרוסקופ.כדי למנוע מעיכה של חתכי הרקמה העבים, הניחו שכבה של גריז ואקום בריבוע מסביב לחתך כדי ליצור מרווח בין זכוכית המכסה לבין העגילה. העבירו את חתך הרקמה אל עגילת מיקרוסקופ. לחצו בחוזקה על קצוות זכוכית המכסה כדי ליצור אטימה.לחלופין, ניתן להניח נקודה של 1 µL של שרף כרומטוגרפיית agarose בגודל רשת ידוע בכל אחת מארבע הפינות שבהן תונח זכוכית הכיסוי, להניח את זכוכית הכיסוי ולאטום את הקצוות בלק גוף לפני ביצוע הדמיה. בתמונה הראשונה של סריקת z-stack דרך חתך coronal של ה-organ of Corti, נראים תאי השערה פנימיים, תאי שערה פנימיים סמוכים, תאי שערה חיצוניים ותאי Deiters. בצביעה גרעינית, תאי העמוד (pillar cells) נראים באמצעות צביעת נוגדן S100 ומופיעים בצבע צהוב. ככל שה-z-stack מתקדם דרך החתך בצעדים של 3 µm, ניתן לספור את מספר תאי העמוד על ידי סימון הופעתם והיעלמותם של גרעיניהם.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע חיתוכי האוזן הפנימית באמצעות vibram, ביצוע אימונוהיסטוכימיה על חיתוכים אלו, ולאחר מכן דימות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. פרוצדורה פשוטה זו, הניתנת להכללה עבור כל נוגדן, מבטיחה שימור מקסימלי של הארגון התאי של ה-organ of Corti.

vibratome-sectioning-for-enhanced-preservation-cytoarchitecture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הליך זה מתאר שיטה לבידוד והתרבות של האיבר של קורטי Murine עם או בלי לימבוס ספירלה ספירלה נוירונים גנגליון. אנחנו גם להדגים שיטה הביטוי של הגן כתב אקסוגניים האיבר של קורטי explant ידי electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

פרוטוקול זה מתאר assay פרוסה organotypic אופטימיזציה עבור המוח לאחר הלידה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות הדמיה של הגירה neuroblast בזרם נודדות מקורי.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

אנו מתארים הליכי הכנה הקלטה אלקטרו מן פרוסות המוח השומרים על הציר הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי entorhinal (MEC). בגלל קידוד עצבי של מיקום כדלקמן הארגון הגב, הגחון בתוך MEC, נהלים אלה להקל על החקירה של מנגנונים תאיים חשובים לניווט וזיכרון.

הכנת פרוסות Parasagittal לחקירת ארגון הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי מכרסמים entorhinal

בסרטון זה, אנו מדגימים את חתך הוויברטום של כליה שלמה של עכבר כדי להשיג פרוסות דקות. ניתן לאחסן חלקי רקמה פרוסים אלה בטמפרטורות נמוכות עד לניתוח נוסף במורד הזרם.

חתך ויברטומי של כליה מורין שלמה: טכניקה ליצירת חלקים דקים של כליה מורין

סרטון זה מתאר את הבידוד של איבר vomeronasal עכבר (VNO) והכנת רקמות עבור חתך ויברטום. חלקים משמשים לאפיון התכונות הביופיזיות והפיזיולוגיות של קבוצה מסוימת של נוירונים חושיים.

הכנת איבר Vomeronasal עכבר עבור חתך Vibratome

רשתית עצבית של עכבר בגילים 8 ימים היא על גבי בלוק ג'לטין 4%. לאחר הבידוד של שכבת קולטי האור (200 מיקרומטר) על ידי vibratome, הקולטניים האור הם זורעים לאחר ניתוק מכאני והאנזימטית לתרבות. שכבת קולטי האור יכולה לשמש ל, ניתוחים ביוכימיים מולקולריים או השתלה.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר הבוגר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס). אנחנו גם מדגימים הליך immunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently. יחד טכניקות אלה יאפשרו המחקר של תאי שיער, תאי תמיכה, וסוגי תאים אחרים הנמצא בשבלול.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט כדי להשיג מקטעים וצורניים שעברו שיטוח של יונקים cortices והמחש מודולים בקליפת המוח באמצעות פתולוגיה ושיטות immunohistochemical.

ויזואליזציה של מודולי קורטיקליים Cortices יונקים שעברו שיטוח

כתב יד זה מתאר פרוטוקול ניסיוני להערכת מאפיינים מורפולוגיים ומעמד פונקציונלי של הסינפסות של רצועת הכלים בעכברים נורמליים. המודל הנוכחי מתאים גם לרעש המושרה והקשורות לגיל synaptopathy מודלים מוגבלים. גם התוצאות של לימודי העכבר הקודמים נדונו.

מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול

במחקר זה, אנו מציגים שיטת הדמיה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להתבונן בתאים הנעים לכיוון רקמה פגומה על ידי דגירה ex vivo עם אפיתל שבלול המכיל את האיבר של קורטי.

הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

כאן, פרוטוקול ממוטב שלב אחר שלב מסופק לקיבוע, חיסון וחתך של עוברים כדי לזהות פילופודיה איתותית מיוחדת הנקראת ציטונמות ברקמות עכבר מתפתחות.

קיבוע רקמת עכבר עוברית לניתוח ציטונמה

למד שיטת חיתוך Vibratome לאיבר קורטי ביונקים לשימור מרבי של ארכיטקטורת תאים. השיטה משלבת אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיית קונפוקל לזיהוי מדויק של סוגי תאים שונים באוזן הפנימית.

Vibratome חתך לשימור משופרת של Cytoarchitecture של איברים של יונקים של קורטי

גלה סרטונים נוספים