הר שלם באתר הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר
10 באוקטובר 2011
כל זה הר באתר פרוטוקול ההכלאה דן שלבים קריטיים המבטיחים תוצאות באיכות גבוהה לשעתק לביטוי במחקרי גן בעוברי עכברי E8.5-E11.5 יום ישנים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להגדיר דפוסי ביטוי גנים בעוברי עכבר שלמים. זה מושג על ידי תכנון ויצירה של בדיקת ריבו ספציפית עבור הגן המעניין. לאחר מכן, העוברים נאספים ומטופלים לצורך הכלאה.
לאחר מכן הגשושית המסומנת מוכלאת לעוברים. השלב האחרון הוא לדמיין את הגשושית ההיברידית על ידי זיהוי אימונוהיסטוכימי. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות דפוסי ביטוי גנים בעוברים שלמים או בחתכים עובריים.
לאחר הדמיה עם מערכת סטריאו, מיקרוסקופ ניתוח או מיקרוסקופ שדה בהיר רגיל, בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהליכי ההכלאה של המכון הם ארוכים ותובעניים מבחינה טכנית, ישנם מספר שלבים חשובים התורמים ביחד לאיכות התוצאה הסופית. ראשית, צור תבנית DNA על ידי הגברת רצף העניין באמצעות פריימרים PCR ספציפיים לגנים שתוכננו עם רצפי מקדם שעתוק פארגה בחמשת הקצוות הראשוניים. לאחר מכן יש לטהר את מוצר ה-PCR ולכלול שלב עיכול פרוטאינאז K על פי הפרוטוקול הכתוב.
לאחר מכן הגדר תגובת שעתוק במבחנה וטמפרטורה אופטימלית של חממה למשך שעתיים. לאחר עיכול ה-DNA של תבנית ה-DNA, טהר את בדיקת הריבו באמצעות טיהור עמודות, הערך את תפוקת הבדיקה באמצעות NanoDrop או קורא ספיגת מיקרו-צלחת. לאחר מכן התאם את ריכוז הבדיקה ל-100 ננוגרם למיקרוליטר בהתאם לתפוקה המשוערת.
לאחר מכן בדוק את איכות הגשושית על ידי דנטורציה של אלקטרופורזה של ג'ל אקרילאמיד כמתואר בפרוטוקול הכתוב ועל ידי מדידת הפעילות הספציפית של בדיקת RIBA, בדיקה טובה צריכה להניב פס בדיד יחיד על הג'ל עם מריחה מינימלית למדידת פעילות ספציפית, לבצע דילול סדרתי של בדיקת הריבו כדי להשיג טווח דילולים מ-10 למינוס שתיים עד 10 למינוס חמש. לאחר מכן פיפטה מיקרוליטר אחד מכל דילול על חתיכה בקוטר 82 מילימטר של קשר גבוה n פלוס ממברנה, יחד עם מיקרוליטר אחד של דגימת DNA לא מסומנת כבקרה. קישור צולב את המסנן מיד בקישור צולב UV ב-125 מילי-ג'אול לאחר קישור צולב.
הוסף 10 מיליליטר של מגיב חוסם 1% בפעם אחת מאגר TN מדגר את טמפרטורת החדר למשך 30 דקות לאחר השלמת החסימה. הסר את תמיסת החסימה ושטוף את המסנן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ב -10 מיליליטר של מאגר TN חד פעמי תוך שטיפת הממברנה. הכן דילול של אחד עד 5,000 של אנטי חמצן בשבר FAB ב -10 מיליליטר של מאגר TN חד פעמי לאחר הכביסה.
דגרו את הממברנה בתמיסה זו למשך 30 דקות לאחר הדגירה, שטפו את הממברנה פעמיים למשך 15 דקות כל אחת ב -10 מיליליטר של מאגר TN חד פעמי. לאחר הכביסה הסופית, שאפו את תמיסת הכביסה מצלחת הפטרי והחליפו בחמישה מיליליטר מצע סגול BM. דגרו את הממברנה בתמיסה זו למשך 30 דקות.
לאחר שחלפו 30 דקות, בדוק את הממברנה אם יש אות גלוי הנפלט מהנקודה המתאימה לדילול 10 עד מינוס ארבע. אם האות גלוי, עצור את תגובת הצבע על ידי שטיפה עם חמש פעמים TE פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם. אם לא נראה אות לאחר 30 דקות, יש להשליך את הגשושית.
אסוף עוברי עכברים ב- PBST קר כקרח. לאחר מכן מיין את העוברים לפי גנוטיפ לארבעה מיליליטר קבצים מכוסים בורג המכילים PBST. יש לתקן את העוברים עם 4% פרלדהיד ב-PBST אלא אם כן צוין אחרת.
כל שלבי הדגירה והשטיפה נעשים בתמיסות ממולאות עד למפלס התחתון של צוואר הבקבוקון, שנפחו כארבעה מיליליטר. השאירו את העוברים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס לאחר הקיבוע. שאפו את הפרלדהיד 4% ב-PBST עם פיפטת פסטה מזכוכית והחליפו ב-PBST.
הניחו את הבקבוקון על קרח למשך חמש דקות לשטיפה. חזור על תהליך זה כדי לשטוף את הרקמה בפעם השנייה. לאחר מכן, שאפו את ה-PBST וייבשו את העוברים בשלבים דרך מתנול בסדרת PBST ל-100% מתנול.
שימו לב שקצה הפיפטה נשמר בצד הנגדי של הבקבוקון כדי למנוע נזק לעוברים אם רוצים, ניתן לאחסן את העוברים במינוס 20 מעלות צלזיוס ב-100% מתנול עד שמונה חודשים ואולי יותר עד לשימוש. העבירו את העוברים לצלחת, נקבו את הלב והראש של עוברים E 10.5 ומעלה בעזרת סכין מיקרו-דיסקציה בזמן שהעוברים עדיין במתנול. זה מאפשר לתמיסות שטיפה להיכנס לחדרי המוח ולחדרי הלב ומפחית כתמי רקע.
לאחר מכן יש להחזיר לחות לעוברים על ידי שטיפות עוקבות במתנול בסדרת PBST. מסיימים בשתי שטיפות במשך חמש דקות כל אחת ב-100% PBST, מלבינים את העוברים על ידי הכנת תמיסה של ארבעה חלקים PBST לחלק אחד 30% מי חמצן ודגירה של העוברים בתמיסה זו למשך שעה על קרח. במהלך הדגירה, הניחו את מאגר ההכלאה הטרי שהוכן על 65 מעלות צלזיוס לחימום מראש.
שטפו את העוברים עם PBST פעמיים למשך חמש דקות כל אחד. במהלך הכביסה הסופית, הכינו 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K עם מי DEPC. לאחר מכן יש לדלל את הציר באופן סדרתי כדי ליצור 10 מיקרוגרם למיליליטר.
פרוטאינאז K ב- PBST שואב את תמיסת הכביסה הסופית ומחליף במיליליטר אחד מתוך תמיסת 10 מיקרוגרם למיליליטר פרוטאינאז K. הניחו את הבקבוקון אנכית במתלה צינורות בתוך אמבט מים של 25 עד מעלות צלזיוס ודגרו במשך 10 עד 30 דקות, תלוי בגודל העוברים. רשום את שעת ההתחלה כאופטימלית וניתנת לשכפול.
זמן הדגירה הוא קריטי כדי לאפשר חדירה של בדיקת הריבו ללא עיכול יתר של העובר. כדי לעצור את עיכול הפרוטאז K יש לשאוב את תמיסת הפרוטאינאז K 30 שניות לפני שחלף זמן הדגירה. לאחר מכן, כאשר זמן הדגירה חולף, הוסף שני מיליגרם טריים למיליליטר גליצין ב-PBST.
בואו נעמוד חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן חזור על שטיפת הגליצין למשך חמש דקות נוספות. לאחר מכן יש לשטוף פעמיים ב-PBST למשך חמש דקות כל אחת.
לאחר מכן יש לתקן מחדש את העוברים שטופלו בפרוטאינאז K על ידי טבילת העוברים ב-4% פרלדהיד ב-PBST בתוספת 0.2% גלוטרלדהיד למשך 20 דקות. לאחר מכן שטפו את העוברים ב-PBST שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחד. לאחר הכביסה האחרונה, שאפו את ה- PBST והחליפו במיליליטר אחד של מאגר הכלאה חם מראש.
לאחר שהעוברים התייצבו, שאפו את מאגר ההכלאה והחליפו במיליליטר אחד של הכלאה טרייה לפני חמה. מאגר. דגרו את הבקבוקונים אנכית בתנור 65 מעלות צלזיוס עם פלטפורמת ניעור למשך שעה. הכן מאגר הכלאה המכיל 0.5 מיקרוגרם למיליליטר ריבו מסומן.
בדיקה לעוברים עד E 8.5 או 0.1 עד מיקרוגרם אחד למיליליטר בדיקה לעוברים מעבר ל-E 8.5. לאחר הדגירה, החלף את תמיסת ההכלאה המוקדמת ב-0.4 מיליליטר של תמיסה זו והכלאה למשך הלילה ב-65 מעלות צלזיוס. למחרת, בדקו את איכות העוברים.
אם העוברים טופלו יתר על המידה בפרוטאינאז K, הם עלולים להיצמד לגודל הבקבוקון, ייראו שקופים במיוחד או יתפרקו. יש להשליך עוברים המופיעים כך מכיוון שעיבודם הנוסף לא יביא לנתונים הניתנים לפירוש. החלף את מאגר ההכלאה בארבעה מיליליטר תמיסה.
אחד ב-70 מעלות צלזיוס. שמרו על טמפרטורה זו ופעמיים למשך 30 דקות כל אחד עבור עוברים E 8.5 או שלוש פעמים למשך 30 דקות בכל שטיפה. עבור עוברים E 9.5 ומעלה במהלך הכביסה האחרונה, הכינו ארבעה מיליליטר של תמיסה של 50%, תמיסה אחת של 50% שתיים לכל בקבוקון וחממו מראש ל-70 מעלות צלזיוס לאחר הכביסה האחרונה.
דגרו את העוברים בתמיסה זו למשך 10 דקות, ואז שטפו שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל שטיפה עם ארבעה מיליליטר תמיסה. שניים בטמפרטורת החדר עם נדנוד לאחר הכביסה. החלף את התמיסה בתמיסה טרייה.
שניים המכילים 100 מיקרוגרם למיליליטר RNA A ו-100 יחידות למיליליטר RNA T אחד דוגר ב-37 מעלות צלזיוס פעמיים למשך 30 דקות לכל שטיפה. תמיסת הכביסה הבאה שלוש ב-65 מעלות צלזיוס עם נדנוד פעמיים למשך 30 דקות כל שטיפה עבור E 8.5, שלוש פעמים למשך 30 דקות לכל שטיפה עבור E 9.5 ומעלה. לבסוף, שטפו שלוש פעמים במשך חמש דקות בכל שטיפה עם פעם אחת TBST.
לאחר מכן המשך לזיהוי נוגדנים. שאפו את שטיפת ה- TBST הסופית מהבקבוקון והחליפו ב -0.5 מיליליטר של פעם אחת TBST בתוספת 10% סרום כבשים שטופל בחום. הניחו את הבקבוקון אנכית על שייקר פלטפורמה בטמפרטורת החדר ודגרו עם נדנדה למשך שעתיים וחצי לפחות כדי לחסום אתרי קשירת נוגדנים לא ספציפיים.
לאחר שחלף זמן הדגירה, יש לשאוב את תמיסת החסימה ולהחליף בסרום טרי פעם אחת בתוספת 10% המכיל דילול של 1 עד 2000 עד 1 עד 5,000 של פוספטאז אלקליין מופחת, אנטיגן כבשים מצומד ונוגדנים לשברי FAB ודגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. שטפו שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת עם פעם אחת TBST. לאחר מכן חמש עד שש פעמים במשך שעה להגיע לטמפרטורת החדר ולבסוף לילה בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר עודפי נוגדנים.
למחרת. שטפו את העוברים פעמיים במשך 20 דקות בכל שטיפה עם מאגר פוספטאז אלקליין טרי. זהו הליך חשוב להפחתת רקע.
החלף את הכביסה האחרונה במיליליטר אחד של מצע AP סגול BM חם מראש. דגירה בטמפרטורת החדר תוך הגנה מפני אור ומעקב אחר אות מעת לעת באמצעות ניתוח אות מיקרוסקופ. לשליח בשפע.
RNA אמור להיות גלוי תוך 15 דקות. כאשר האות נראה בבירור או אם כתמים ברקע מתחילים להוות בעיה, עצור את התגובה על ידי שטיפה פעמיים למשך חמש דקות לכל שטיפה עם תמונות לכידת PBST אחת בתוספת חמש מילי-מולרית EDTA כדי לתעד את דפוס הצביעה של כל עובר ההר. לאחר שהדבר נעשה, החזירו את העוברים לבקבוקון של מצע סגול BM ודגרו במשך 16 עד 24 שעות בטמפרטורת החדר עד שהמשטח החיצוני של העובר הופך לכחול כהה כדי לאפשר לכתם לחדור לכל העובר.
לאחר מכן העבירו את העוברים ל-4% עור פרמלי ב-PBST כדי לתקן מחדש למשך מספר שעות או לילה בארבע מעלות צלזיוס. שלב קיבוע אחרון זה חיוני לשימור ארוך טווח של דפוס הצביעה. לבסוף, המשך לפרפין, הטמעה וחתך על פי הנהלים המפורטים בפרוטוקול הכתוב כדי לחשוף כתמים אלה.
תמונה זו מציגה הרכבה מוצלחת של חור ב-C 2 הכלאה של עובר E 10.5 באמצעות בדיקת ריבו ספציפית של גאטה שלוש. הנה תמונה המציגה עובר E 11.5 שתויג בהצלחה עם בדיקת ריבו ספציפית אחת של Fox G. תמונה זו מציגה רקע גבוה ואות חלש מהכלאה כושלת ב-C 2 עם בדיקה גאטה שלוש מושפלת חלקית הממחישה את החשיבות של ביצוע בקרת איכות קפדנית של בדיקות כדי להבטיח תוצאות באיכות גבוהה.
הנה תמונה של הליך לא מוצלח נוסף. במקרה זה, ההליך בוצע ללא ניקוב הראש וכתוצאה מכך רמה גבוהה של כתמי רקע בחדרים כפי שמצוין על ידי ראשי החצים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הכלאה באיכות גבוהה של המכון כדי להגדיר דפוסי ביטוי גנים על עוברי עכברים לפרטים מרחביים והשוואות זמניות או גנוטיפיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול הכלאה in situ בהרכבה מלאה דן בשלבים קריטיים המבטיחים תוצאות איכותיות ומשוכפלות למחקרים על ביטוי גנים בעובר עכבר בגיל E8.5-E11.5 ימים. הנוהל שם לעצמו למטרה להגדיר דפוסי ביטוי גנים בשלמותם של עוברי עכבר דרך סדרה של שלבים מתודולוגיים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- ביטוי גנים
רקע
- הכלאה in situ בהרכבה מלאה היא טכניקה המשמשת לחקר ביטוי גנים.
- שיטה זו מועילה במיוחד לבחינת התפתחות עוברית.
- עוברי עכבר בגיל E8.5-E11.5 קריטיים להבנת ההתפתחות המוקדמת.
- גריי ריבו ספציפיים מתוכננים לניתוח גנים ממוקד.
מטרת המחקר
- להמחיש דפוסי ביטוי גנים בשלמותם של עוברי עכבר.
- לספק פרוטוקול אמין לחוקרים בביולוגיה התפתחותית.
- להעמיק את ההבנה של תפקוד הגנים במהלך התפתחות העובר.
שיטות ששימשו
- תכנון ויצירה של גריי ריבו ספציפיים לגן המעניין.
- איסוף וטיפול בעובריים להכלאה.
- הכלאה של גריי מסומנים לעובריים.
- המחשה של גריי מוכלאים דרך איתור אימונוהיסטוכימי.
תוצאות עיקריות
- המחשה מוצלחת של דפוסי ביטוי גנים בשלמותם של עובריים.
- הוכחת יעילות פרוטוקול ההכלאה.
- התוצאות תורמות להבנת תהליכים התפתחותיים.
- פוטנציאל ליישום במחקרים שונים על ביטוי גנים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה חזקה לחקר ביטוי גנים בעובר עכבר.
- התוצאות יכולות להוות בסיס למחקרים עתידיים בביולוגיה התפתחותית.
- ניתן להשיג תוצאות איכותיות באמצעות שמירה קפדנית על הפרוטוקול.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos enables spatial mapping of gene expression, supporting early discovery and target validation in developmental and disease models. Rigorous probe quality control and reproducible workflows reduce mechanistic ambiguity and enhance predictive confidence for downstream R&D. This protocol's emphasis on standardization and quantifiable outputs positions it as a reusable capability for gene expression analysis across discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatial and temporal mapping of gene expression in intact embryonic systems.
- Supports functional target validation by revealing endogenous transcript localization.
- Facilitates mechanistic de-risking through high-quality, reproducible detection of gene activity.
- Provides a platform for comparative genotype or developmental stage analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes validated probe quality control assays for sensitivity and specificity.
- Standardizes sample preparation and hybridization conditions for reproducibility.
- Generates quantitative and qualitative readouts suitable for downstream screening workflows.
- Enables reliable evaluation of gene expression modulation by candidate compounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression patterns with disease-relevant developmental windows.
- Supports continuity from discovery through preclinical model validation.
- Provides spatial context for translational biomarker identification when supported by gene targets.
- Reduces risk of late-stage biological failure by confirming target engagement in relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through preclinical model validation, supporting both target identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of gene function and pathway mapping in embryonic contexts.
- Screening: Provides standardized, reproducible assay conditions and quantitative probe validation for screening readiness.
- Analytics: Delivers measurable outputs—such as probe integrity and specific activity—that inform experimental comparability.
- Translational Research: Connects gene expression data to developmental and disease-relevant models when gene targets are aligned.
- Enterprise Reuse: Offers a robust, quality-controlled workflow adaptable to diverse gene targets and developmental stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in gene expression studies.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in probe design, embryo handling, and hybridization techniques.
- Demands access to molecular biology instrumentation and imaging platforms.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of probe quality control and sample processing.
- Adaptable to various gene targets and developmental stages with protocol optimization.
- Dependent on careful execution of quality control steps to ensure interpretable results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Generation of a Gene-specific Riboprobe and Measurement of Specific Activity
3:58
Collection of Mouse Embryos
5:12
Hybridization of the Digoxygenin-labeled Probe to Whole Mouse Embryos
10:07
Antibody Detection of the Digoxygenin-labeled Riboprobe
12:38
Examples of Whole-mount in situ Hybridizations
13:29
Conclusion
