Name: אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: למד שיטת תרבות איברים תלת-ממדית באלגינט לתאי אפיתל שחלות וחצוצרות עכברים. שיטה זו מאפשרת חקר אירועי התחלה בסרטן שחלות תוך שמירה על מאפיינים תאיים נורמליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מחקר על סרטן השחלות קרן [מענק LT/UIC/01.2011], מרכז UIC למדע Translational קלינית, המרכז לסרטן UIC, לבין המכון הלאומי לבריאות מענק C06RR15482. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי AAALAC תחת אושרה לטיפול בפרוטוקולים בעלי חיים על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת השתמש ב UIC. בעלי חיים עבור פרויקט זה הם שוכנו בחדרים המכשול הביולוגי משאבי המעבדה (BRL) באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. BRL יש צוות וטרינרי מלא המנטרת בעלי חיים לפחות פעמיים ביום, ומספק עצות לטיפול בבעלי חיים.

1. השחלות ביתור ובידוד רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 0.5% (w / v) של אלגינט הנתרן, להכין מגירסה שונה של הפרוטוקול שתואר לעיל 5, באמצעות PBS סטרילית חום 37 ° C. מערבבים על ידי היפוך או נדנדה, אבל לא מערבולת. צייר את אלגינט לתוך מזרק 1 מ"ל עם מחט 25 G ולשמור על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10mm סטרילי CaCl 2 פתרון אלגינט crosslinking על אנקפסולציה רקמות חמים 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1mL של המדיום תרבות (αMEM + 5 יחידות פניצילין 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין) לכל היטב צלחת 24 היטב כל ניסוי. הכללת תרופות שונות, פפטידים, וירוסים או במדיום תרבות. עבור transfection לפני אנקפסולציה איברים, רקמות דגירה עם Lipofectamine 2000 ו-DNA פלסמיד במשך ארבע שעות בכל 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתחים את האיברים מן החיה, להסיר את כל רקמת שומן או שיורית, משוך בעדינות את הממברנה בורסה המקיפה את השחלה, לחתוך את השחלה או oviduct לארבעה חלקים על ידי שחצתה את האיבר. החיות היו מורדמים בחנק CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. עבור oviduct, להשתחרר בעדינות את הרקמה על ידי משיכת לגזרים את הקרומים חיבור והארכת הקצוות של הצינור בכיוונים מנוגדים באמצעות מלקחיים לפני החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפה אחת אלגינט (~ μL 1-3) על סיב רשת מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטריליות, להעביר חתיכת איבר לתוך אגל אלגינט והמרכז אגל באמצעות מלקחיים או מחט סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך אגל המכיל את חתיכת איבר (organoid) ידי אחיזה סיבים רשת עם מלקחיים סטריליות ולהפוך אותו הפוך, כדי לאפשר לכוח הכבידה אלגינט תוך ירידה תלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על מלקחיים על קצה צלחת פטרי המכילה 10 ס"מ 10mm CaCl 2 פתרון, כך הירידה נופל לתוך פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 2 דקות, מוציאים בכף סטרילית המכילה נקבוביות לשחרר תוספת 10mm CaCl 2, ולהעביר את המדיום לתרבות. עד ארבעה ג'ל אלגינט ניתן להעביר לתוך הבאר אחד של צלחת המכילה 24 היטב את המדיום לתרבות. תרבות לתקופת זמן מוגדרת. </li></ol> 2. הפירוק של אלגינט אוסף של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור solubilization של ג'ל אלגינט, דגירה התרבויות lyase אלגינט (3.4 מ"ג / מ"ל) מומס L-15 של ליבוביץ התקשורת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או עד הג'ל נמס לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת רקמה lyase אלגינט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אוסף של OSE, דגירה organoid עם 500 יחידות collagenase ב-L-15 של ליבוביץ התקשורת במשך שעה 1 8. וורטקס ב 2 פעימות השני (2 שניות מערבולת ו -2 שניות מנוחה) על כוח בינוני למשך דקה 1, ואחריו 1 פולסים השנייה (1 מערבולת השני 1 שאר השנייה) למשך דקה 1. בואו חתיכות איברים ליפול לתחתית של התחתית microcentrifuge ו supernatant פיפטה לתוך צינור טרי microcentrifuge סטרילית. צנטריפוגה 3 דקות ל 3000 סל"ד אפיתל פני השטח גלולה השחלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אוסף של האפיתל חצוצרות, לחתוך את הצינור לאורך ומניחים על ניילון רקמה תרבות DMEM עם 5 יחידות פניצילין 5 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל ו -4% (v / v) FBS. במשך 3-5 ימים, התאים יהיה "לזחול" מתוך stroma חצוצרות ולגדול על תרביות רקמה plastic9. </li></ol> 3. קיבוע של במארז אלגינט תרבויות איבר עבור חלקים פרפין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את אלגינט במארז חרוז ממדיום התרבות בנקודת הזמן שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Recrosslink אלגינט כדי להקשיח את הג'ל על ידי הטלת התרבות לתוך סטרילי פתרון 10mm 2 CaCl במשך שתי דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את איבר אלגינט הגלום paraformaldehyde 2% סוכרוז המכילה 50 מ"מ, 10 mM CaCl 2 ו 50 נתרן cacodylate mM על מנת להבטיח כי הג'ל נשאר מוצק מלא תמצית רקמות במהלך קיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות עיבוד רקמות, להטביע את תרבות שלמה אלגינט, במארז איבר לתוך חתיכת פרפין קטע עם microtome לייצר 5 סעיפים מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלגינט יפורק והוציאו משקופית אם ביצוע אימונוהיסטוכימיה עקב החום אחזור אנטיגן מבוסס. אלגינט תישאר כתם על eosin תחת עומד hematoxylin והכתים eosin. </li></ol> 4. נציג תוצאות: דוגמה תרבות תלת מימדי איבר של השחלה ואת oviduct מוצג באיור 1. השחלות ניתן לחתוך לחתיכות בגודל שונה, OSE להתרבות ולהעביר לתקן את פני השטח כי נפצע מן החתך עם אזמל. במהלך תהליך זה, הכיוון הנכון של OSE ביחס stroma הבסיס נשמר, עם OSE encapsulating את השחלה. כפי שניתן לראות בתרשים 2, OSE של השחלות בחצי לתמצת את השחלה יותר לחלוטין לעומת השחלות לחתוך לרבעים או שמיניות. לתקן פצע של השחלותפני השטח ניתן ללמוד בהקשר של השחלה כולו עשוי לשפוך אור על איך לתקן את הביוץ פני השטח גורם לשינוי השחלות. נקודת הסיום של הניסוי תלויה המידע הנדרש. האדריכלות רקמות, מורפולוגיה הסלולר, וספציפית שיעורי צמיחה הסלולר נמצאות תחת פיקוח בקלות באמצעות קטעים פרפין. לדוגמה, שכבה אחת של אפיתל פני השחלות הוא ציין לאחר culturing ב αMEM סרום ללא למשך 7 ימים (איור 3A) תוך תוספת של 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין למשך 7 ימים גורם hyperproliferation של אפיתל פני השחלות היווצרות של שכבות מרובות של התאים (איור 3B). על ידי הוספת bromodeoxyuridine לתרבויות בריכוז סופי של 10 מיקרומטר 24 שעות לפני קיבעון, התרבות התאים ניתן למדוד (3A הבלעה ו 3B). עבור תרבויות נשמר αMEM בסרום חינם, כ 3-5% מכלל OSE עוברים שגשוג בתקופת 24 שעות תיוג (3A הבלעה), ואילו אחוז גבוה יותר של תאים granulosa להתרבות. תוספת של אינסולין על תרבות התקשורת מגביר את אחוז מתרבים OSE על כ -30% מסך OSE (3B הבלעה). Immunofluorescence של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ניתן דמיינו באמצעות ג'ל אלגינט עם מיקרוסקופ רגיל הבאה transfection cDNA (איור 3 ג). בעוד איבר תרבות אלגינט מספקת לצמיחה וניתוח של אפיתל פני השחלות זקיקים ראשוניים, יש לציין כי בוגרת, זקיקים משניים מצליחים לשרוד במערכת זו תרבות (איור 3D). תרבות של זקיקים בודדים לפדיון בתוך המטריצה ​​הידרוג אלגינט תוארה במקומות אחרים 10. שינויים חלבון או רנ"א ניתן לנתח מן האיבר כולו או סוגי תאים מסוימים באמצעות פירוק אנזימטי (איור 4). טיפול organoids השחלות תרבותי עם collagenase עוזב את stroma הבסיסית שלמים (איור 4C) תוך מתן אפשרות להעשרה של OSE בתא גלולה שהושגו לאחר הטיפול, אם כי חלק מתאי סטרומה מבודדים גם (איור 4D). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> 1. השחלה איור עכבר תלת ממדי התרבות המערכת השתמשו כדי להפיץ OSE לאחר פציעה. א) תחת המיקרוסקופ, בורסה לבין כרית השומן המקיפים הוסרו. ב) השחלה אינטקט (O) עם צינור oviductal (T) ושומן כרית (F). ג) השחלות עם בורסה כרית השומן הוסר (משמאל) התיר oviduct (מימין). ד) organoids השחלות או oviductal הונחו לתוך אגל אלגינט. E) organoids אלגינט עטוף הוטלו לתוך crosslinking 2 CaCl הפתרון אלגינט כדי ליצור ג'ל. F) אלגינט במארז organoid השחלות. G) אלגינט במארז organoid oviductal. H) organoids אלגינט הגלום במדיום מודגרות תרבות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. פני השטח מחדש על ידי השחלות לפני השטח נמדד על ידי cytokeratin 8. Encapsulation של organoids השחלות על ידי OSE לאחר וחותכים, רבעים שמיניות, ועל חצאים, בתרבית בינוני BSA, נמדד על ידי ניתוח immunohistochemical באמצעות cytokeratin 8 (CK8) נוגדן. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> 3. איור אלגינט מערכת התרבות מאפשר מעבר של גורמי גדילה transfection של cDNA לתוך OSE, אך אינו תומך צמיחה התבגרות מהירה של זקיקים. א) organoid השחלות בתרבית למשך 7 ימים במדיום הבסיסי ניתח עבור CK8 הביטוי, אשר מסמן את OSE. סעיף הבלעה, סידורי מוכתם עבור התאגדות BrdU. ב) תוספת של אינסולין התקשורת בתרבות גורם היפרפלזיה של OSE. סעיף הבלעה, סידורי מוכתם עבור התאגדות BrdU. ג) organoid השחלות transfected עם cDNA להביע את ה-GFP. ד) תרבות אלגינט מערכת תומכת צמיחה של זקיקים בראשיתי (חץ אדום), אבל לא משני זקיקים בשלים (חץ שחור). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. OSE ניתן לבודד לתרבות הניתוח הבא. א) Organoid בתרבית בינוני עד 2 שבועות. ב) organoid Encapsulated מטופל עם lyase אלגינט לעזוב organoid ללא פגע. השחלה היא מוכתמת CK8 לציון OSE. ג) Organoid מטופל עם collagenase אל OSE נפרד stroma הבסיסית. פיסת הרקמה נותרת היה מוכתם CK8 להדגיש הסרת פני השחלות. ד) לאחר הטיפול התאים שנאספו מועשרים עבור OSE כמו מוכתם עבור CK8 (אדום). תאים הם counterstained עם DAPI לציון גרעינים.

<ol><li>Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2009%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2009.</a> CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+ovarian+carcinomas%3A+a+developmental+view%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The origin of ovarian carcinomas: a developmental view.</a> Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).</li>
<li>Crum, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distal+fallopian+tube%3A+a+new+model+for+pelvic+serous+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis.</a> Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).</li>
<li>Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+ovarian+organ+culture+as+a+tool+to+study+normal+ovarian+surface+epithelial+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair.</a> Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).</li>
<li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20, 45-53 (1999).</li>
<li>Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as biomaterials.</a> Macromol Biosci. 6, 623-633 (2006).</li>
<li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).</li>
<li>Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+methoxychlor+and+estradiol+on+cytochrome+p450+enzymes+in+the+mouse+ovarian+surface+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium.</a> Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).</li>
<li>Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+newly+established+clonal+oviductal+cell+lines+and+differential+hormonal+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).</li>
<li>Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+and+preventing+infection+after+abdominal+vascular+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma%22%5BJournal%5D)">Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries.</a> J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Oocyte+Maturation+and+Preantral+Follicle+Culture+from+the+Luteal+Phase+Baboon+Ovary+Produce+Mature+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes.</a> Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+grown+human+ovarian+follicles+from+cancer+patients+support+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth.</a> Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).</li>
<li>Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Hydrogels+for+cell+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Review: Hydrogels for cell immobilization.</a> Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).</li>
<li>Iwamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bifunctional+alginate+lyase+from+Alteromonas+sp.+strain+no.+272+and+its+action+on+saturated+oligomeric+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).</li>
<li>Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cultured+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+phenotypic+plasticity+and+premalignant+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes.</a> Lab Invest. 71, 510-518 (1994).</li>
<li>Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+ovarian+epithelial+carcinogenesis%3A+progress+and+problems+in+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches.</a> Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).</li>
<li>Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+between+human+ovarian+surface+epithelial+cells+and+adjacent+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix.</a> Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).</li>
<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li>
<li>Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+surface+epithelium%3A+biology%2C+endocrinology%2C+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology.</a> Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).</li>
<li>Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropins+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Gonadotropins and ovarian cancer.</a> Endocr Rev. 28, 440-461 (2007).</li>
<li>Fathalla, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incessant+ovulation--a+factor+in+ovarian+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia.</a> Lancet. 2, 163-163 (1971).</li>
<li>Espey, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+the+hypothesis+that+mammalian+ovulation+is+comparable+to+an+inflammatory+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction.</a> Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).</li>
</ol>

אין מה לגלות.

הפיתוח של מערכת תלת מימדי איבר תרבות ניצול הידרוג אלגינט מייצג שיטה לניתוח תכליתי הרבה סוגי רקמות שונים ממגוון רחב של אורגניזמים. השימוש תרבויות 3D ניתן להרחיב בתחומי הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית כפי שהוא מספק פיגום שעליו התאים יכולים לגדול 11. נכון לעכשיו, במעבדה שלנו עוברת מחקרים ראשוניים באמצעות השחלות האדם רקמת החצוצרה, אך תרבות של זקיקים קוף אדם הלא אנושי תוארה 12,13. השימוש הידרוג אלגי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> ליבוביץ L-15 בינוני </td><td> Gibco </td><td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> αMEM בינוני </td><td> Gibco </td><td> 12000-022 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן אלגינט </td><td> Novamatrix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נתרן cacodylate </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C0250 </td><td></td></tr><tr><td> רשת סיבי פוליפרופילן </td><td> מקמאסטר קאר </td><td></td><td> 45 &quot;רול רחב; 0.0041&quot; הפתיחה </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> אלגינט lyase </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A1603 </td><td></td></tr><tr><td> A1603 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C9697 </td><td> מ Clostridium histolyticum </td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> MP Biomedicals </td><td> 103700 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> Gibco </td><td> Gibco </td><td></td></tr><tr><td> ITS פתרון </td><td> רוש </td><td> 11074547001 </td><td> אינסולין / transferrin / נתרן סלניום </td></tr><tr><td> Cytokeratin 8 נוגדן </td><td> התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק </td><td> TROMA-1 </td><td> השתמש ב 1:200 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> וקטור Labs </td><td> H1200 </td><td></td></tr><tr><td> Bromodeoxyuridine </td><td> סיגמא </td><td> B50002-1G </td><td> הריכוז הסופי 10 מיקרומטר </td></tr></tbody></table>

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות oviducts

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

סרטן השחלות הוא הגורם המוביל החמישי של מקרי מוות מסרטן בקרב נשים יש שיעור תמותה 63% בארצות הברית 1. סוג תא המוצא עבור סרטן השחלות עדיין השאלה יכול להיות גם על פני השחלות אפיתל (OSE) או אפיתל דיסטלי של fimbriae את החצוצרה 2,3. Culturing תאים נורמליים כתרבות ראשוני במבחנה יאפשר למדענים מודל שינויים ספציפיים שעשויים לגרום לסרטן השחלות האפיתל ברורים, ובכך לקבוע בוודאות את סוג התא המוצא. זה יאפשר פיתוח של סמנים ביולוגיים יותר מדויק, במודלים של בעלי חיים עם ספציפיים רקמות שינויים גן, אסטרטגיות מניעה טובה יותר ממוקד המחלה. שמירה על תאים נורמליים הידרוג אלגינט לטווח קצר מקדמת תרבות של תאים במבחנה בהקשר שלהם תלת מימדי ומאפשרת המבוא של ה-DNA פלסמיד siRNA, ומולקולות קטנות. על ידי איברים culturing לחתיכות כי הם שנבעו מקיצוצים אסטרטגי באמצעות אזמל, תרבויות מספר מאיבר אחד יכול להיות שנוצר, הגדלת מספר ניסויים מבעל חיים אחד. קיצוצים אלו היבטים מודל הביוץ מוביל לשגשוג של OSE, אשר מזוהה עם היווצרות סרטן השחלות. סוגי תאים כגון OSE כי אינם גדלים היטב על משטחי פלסטיק יכול להיות מתורבת בשיטה זו ולהקל על חקירת תהליכים תאיים רגיל או את האירועים המוקדמים להיווצרות סרטן 4. הידרוג אלגינט יכול לשמש כדי לתמוך בצמיחה של סוגים רבים של רקמות 5. אלגינט הוא פוליסכריד ליניארי מורכב יחידות חוזרות של חומצת-D-mannuronic β ו α-L-guluronic חומצה שניתן crosslinked עם יוני סידן, וכתוצאה מכך פעולה gelling עדין שאינו נזק לרקמות 6,7. כמו אחרים תלת ממדי התרבות מטריצות תאים כגון Matrigel, אלגינט מספק תמיכה מכאנית עבור רקמות, אולם החלבונים אינם תגובתי עם המטריצה ​​אלגינט, ולכן פונקציות אלגינט כמטריצה ​​תאיים סינתטי שלא ליזום התא איתות 5. הידרוג אלגינט מרחפת בתווך תא רגיל התרבות תומך ארכיטקטורת הצמיחה רקמות במבחנה. השיטה מוצגת להכנת, הפרדה, והטבעה של השחלות חתיכות איברים oviductal לתוך הידרוג אלגינט, אשר ניתן לשמור על תרבות של עד שבועיים. לשחרר האנזימטית של תאים לניתוח דגימות RNA חלבונים מן התרבות איבר מתואר גם. לבסוף, את הצמיחה של תאים מסוגים ראשוני ניתן ללא הנצחה גנטי מעכברים היתרי החוקרים להשתמש בנוקאאוט ואת העכברים הטרנסגניים.

התרבות של תאים נורמליים בהקשר שלהם תלת ממדי מייצג שיטה חלופית לחקור אירועים מוקדם נדרש שינוי tumorigenesis הסלולר. שיטה זו משמשת לגדול השחלות נורמלי תאים oviductal ללמוד האירועים מוקדם להיווצרות סרטן השחלות.

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

סרטן השחלה הוא גורם התמותה החמישי בשכיחותו מסרטן בקרב נשים, ושיעור התמותה ממנו בארצות הברית עומד על 63%1. סוג התא ממנו מקור ה...

נוהל זה מתאר את השכפל של תאי אפיתל שגירים נורמליים ותאי אפיתל של השפופרת המבילה כתרבית איברים תלת-ממדית. ראשית, בצעו דיסקציה של השחלה, של רפידת השומן של ה-UCT וחלק מהרחם מעכבר. לאחר מכן, הסירו את הבורסה והפרידו את קרומי השפופרת המבילה בעזרת פינצטה, וחתכו כל שחלה או UCT לשני עד ארבעה חלקים המכונים אורגנואידים.לבסוף, כסו את האורגנואיד בטיפת אלגינאט על גבי פיסת סיב רשת. מכיוון ש-OSC ו-TEC המגודלים במד แนים שומרים על מאפייני תא נורמליים במבנה התלת-ממדי הטבעי שלהם, אימונוהיסטוכימיה של חתכי רקמה, ניתוח RNA וניתוח חלבונים יכולים לספק תובנות לגבי ההשפעה של OSC ו-TEC בסרטן השחלה.היתרון המרכזי של טכניקה זו בהשוואה לתרבית תאים מסורתית דו-ממדית של תאים מונצחים הוא שניתן לגדל את התאים במגע עם המטריצה החוץ-תאית ותאי הסטרומה שמתחתיהם, ללא שימוש בהנצחה גנטית שעלולה לשנות מסלולים תאיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום סרטן השחלה, כגון הגדרת אירועים מוקדמים בהיווצרות הסרטן וקביעה מאיזה סוג תאים נובעים סרטני שחלה סרוזיים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי סרטן השחלה, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון תרבית זקיקי שחלה ותרבית איים בטא מהלבלב.בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקשיים, מכיוון שהסרת הבורסה (bursa) וממבני ה-uc ללא פגיעה בשחלות וב-UCT היא משימה מאתגרת. ראשית, הכינו תמיסת alginate בריכוז 0.5% ב-PBS סטרילי וחממו ל-37 °C תוך ערבוב באמצעות הפיכה או ניuע. לאחר מכן, שאבו את ה-alginate למזרק של 1 mL עם מחט בכיול 25 gauge, ושמרו על טמפרטורה של 37 °C.בשלב הבא, הכין תמיסת calcium chloride בריכוז 10 millimolar לצורך קישור צולב (cross-linking) של האלגינאט בעת כמיסת הרקמה, וחמם ל-37 degree Celsius. כמו כן, הכין מיליליטר אחד של תוצרי תרבית לכל באר בלוח של 24 בארות עבור כל ניסוי; כלול תרופות, פפטידים או וירוסים שונים בתוצר התרבית. בעת הפריקה של האיברים מהחיה, הסר כל שומן או רקמה שאריתית.הסר בעדינות את קרום הבורס המקיף את השחלה וחתוך את השחלה או את ה-UCT לארבעה חלקים על ידי חציית האיבר, כדי לפתוח בעדינות את רקמתו של צינור הביצים. הפר את הקרומים המקשרים ומתח את קצות הצינור לכיוונים מנוגדים באמצעות פינצטה.לפני החיתוך, הניחו טיפה אחת של אלגינאט בנפח של כ-שני µL על סיב רשת סטרילי. בעזרת פינצטה סטרילית, העבירו חלק מהאיבר אל תוך טיפת האלגינאט ומקמו את הטיפה כך שניתן יהיה להפוך את הטיפה המכילה את האורגנואיד. הפכו את סיב הרשת ואפשרו לכוח הכבידה לדחוף את האלגינאט ליצירת טיפה תלויה על דופן של Petri dish בקוטר 10 cm המכילה תמיסת calcium chloride בריכוז 10 mM.הקישו על הפינצטה כך שהטיפה תיפול לתוך התמיסה. דגרו למשך שתי דקות. הסירו בעזרת כף סטרילית בעלת נקבים כדי לשחרר עודף של 10 millimolar calcium chloride והעבירו למצע התרבית למשך פרק זמן מוגדר.להמסה של ג'ל האלגינט, דגרו את התרביות ב-3.4 mg/mL אלגינט ליאז (Alginate lyase) המומס במצע Ovitz L 15, בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות או עד להמסה מלאה של הג'ל.לאחר מכן הוצא את הרקמה מה-alginate lyase. כדי לאסוף את ה-OSE, דגרו את האורגנואיד עם 500 units של collagenase בתווך ovitz ISS. L 15 למשך שעה אחת, ערבבו בוורטקס בפולסים של שתי שניות בעוצמה בינונית למשך דקה אחת, ולאחר מכן פולס של שנייה אחת.בצעו פולסים למשך דקה אחת. הניחו לחלקי האיבר לשקוע לתחתית מבחנת המיקרו-צנטריפוגה, והעבירו בפיפט את הנוזל העליון (supernatant) למבחנת מיקרו-צנטריפוגה סטרילית חדשה. צנטריפוגו למשך שלוש דקות במהירות של 3000 RPM כדי להשקיע את אפיתל השטח של השחלה. לבסוף, כדי לאסוף את אפיתל החסונית, חתכו את המבחנה לאורכה והניחו על פלסטיק לתרביות רקמה למשך שלושה עד חמישה ימים.התאים ינדדו החוצה מהסטרומה של השפופרות ויגדלו על הפלסטיק לתרבית רקמות. אספו את חרוז האלגינט העטוף מתוך מדיום התרבית בנקודת הזמן שנבחרה. קשרו את האלגינט כדי להקשיח את הג'ל על ידי העברת התרבית לתוך תמיסת calcium chloride סטרילית בריכוז 10 millimolar למשך שתי דקות.כעת, בצעו קיבוע לאיבר העטוף באלגינאט, תוך הבטחה שהג'ל יישאר מוצק ויעטוף את הרקמה באופן מלא במהלך הקיבוע. ניתן לתרבת סוגי תאים שאינם גדלים היטב על משטחי פלסטיק, כגון OSC. שימוש בשיטה זו מקל על חקירת תהליכים תאיים נורמליים או את האירועים המוקדמים ביותר בהיווצרות סרטן.תחת המיקרוסקופ, הוסרו הבורסה וכרית השומן שמסביבה, והם עובדו לאורגנואידים עטופים באלגינט שהודגרו במצע גידול. ה-OSC שיקמו את הפני השטח שנפגעו מהחתך של הסקלפל כפונקציה של זמן ומרחק.ניתוח אימונוהיסטוכימי באמצעות נוגדן לסייטוקראטין שמונה מעיד כי שחלות שחולקו לחצאים עטופות את השחלה באופן מלא יותר בהשוואה לשחלות שחולקו לרבעים או לשמיניות. ניתן לנטר בקלות את ארכיטקטורת הרקמה, את המורפולוגיה התאית ואת שיעורי הגדילה התאיים הספציפיים באמצעות חתכי פראפין. לדוגמה, ניתן להבחין בשכבה בודדת של אפיתל פני השחלה לאחר תרבית ב-MEM ללא סרום למשך שבעה ימים.בעוד שהוספה של 5 µg/mL אינסולין למשך שבעה ימים משרה היפר-פרוליפרציה של אפיתל פני השחלה והיווצרותם של מספר שכבות תאים. כאן, אימונופלואורסצנציה של חלבון פלואורסצנטי ירוק מוצגת דרך ג'ל אלגינאט באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית לאחר טרנספקציית CDNA. בעוד שתרבית איברים באלגינאט מאפשרת צמיחה ואנליזה של אפיתל פני השחלה ושל זקיקים ראשוניים, יש לציין כי זקיקים שניים בשלים אינם שורדים במערכת תרבית זו.ניתן לנתח שינויים בחלבונים או ב-RNA מכל האיבר או מסוגי תאים ספציפיים באמצעות פירוק אנזימטי. טיפול באורגנואידים שחלאיות במבנה תרבית באמצעות קולגנאז משאיר את הסטרומה שבבסיסם שלמה, תוך שהוא מאפשר העשרה של אפיתל השטח השחלאי במשקע התאים המתקבל לאחר הטיפול. ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שעה עד שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על סטריליות בכל עת. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון immunohistochemistry, western blotting ומערכי תמלול (transcription arrays) כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האופן שבו מורפולוגיית התאים וארכיטקטורת הרקמה תורמות לאירועי התמרה מוקדמים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמירה להבנה טובה של אופן ביצוע תרבית אלגינאט תלת-ממדית של השחלה ושל חצוצרה.

alginate-hydrogels-for-three-dimensional-organ-culture-ovaries

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטה חדשה אנקפסולציה השחלות זקיק ברשת 3D הפיברין-אלגינט interpenetrating מתואר. מערכת זו משלבת תמיכה מבנית עם השפלה פרוטאוליטי כדי לתמוך בפיתוח של זקיקים בשלים לייצר ביציות בוגרות. שיטה זו עשויה להיות מיושם אגרגטים תא התרבות לשמור תאים תאים מגעים ללא הגבלת ההתרחבות.

שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי

סרטון וידאו זה מתאר את הפרוטוקולים לעטוף קומולוס-ביציות חזיריות (COC) בחרוזי פיברין-אלגינט כדי לבסס תרבית תלת-ממדית. מערכת הבשלה חוץ-גופית זו שומרת על תקשורת תקינה בין תאים, ומבטיחה הבשלת ביציות ושמירה על כדאיות.

תרבית תלת ממדית של COC חזירי: הליך לעטוף קומולוס קומוציטים קומולוס בחרוזי הידרוג'ל פולימריים פיברין-אלגינט

פרוטוקול זה מתאר את התרבות העיקרית / שיתוף התרבות של רקמת השחלה עכבר, באמצעות השחלות מעכברים בילוד וזקיקים בשחלות בודדות מעכברים לפני גיל בגרות מיניים. טכניקות התרבות לתמוך בפיתוח באופן פיסיולוגי מאוד, המאפשר חקירה של ההשפעה של סוכנים חיצוניים בשחלה, ושל יחסי גומלין בין זקיקים בשחלות.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

כאן אנו מציגים עיבוד של בהירות פסיבי, שיטת שחזור תלת-ממד עבור ויזואליזציה של השחלות להערכת, נימים הזקיקים השחלות העכבר ללא פגע.

שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי

מוצגים כאן שני פרוטוקולים לתחינה של ציטים שונים בתנאי תרבות תלת-מידוד. בתחילה, קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) הם עטוף חרוזים fibrin-אלגינט. בשנייה, הם מוקפים פלואורציה אתילן פרופילן אבקת חלקיקי (microbioreactors). שתי המערכות מבטיחות תנאים אופטימליים לשמירה על ארגון תלת-מיוד.

הידרוג'לים אלג'ינאט מפורקים ופרוטאוליטית ומיקרוביו-סיבה לאנקלוסציה של פורצין אוציט

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכברים לביטוי גנים וניתוחים היסטולוגיים.

הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר

פרוטוקול זה מתאר הקמת אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של רקמה מתאי אפיתל ראשוניים של פני השחלות האנושיות (hOSE). הפרוטוקול כולל בידוד של hOSE מהשחלות הטריות שנאספו, הרחבה תאית של hOSE, הליכי הפשרה בהקפאה וגזירת אורגנואידים. Immunofluorescence, ניתוח כמותי, והצגת השירות כפלטפורמת סינון כלולים.

אורגנואידים אפיתל פני השטח של השחלות האנושיות כפלטפורמה לחקר התחדשות רקמות

פרוטוקול זה מתאר מודל תרבית תלת מימדי חדש (3-D) המשתמש בהידרוג'ל היאלורונן המקושר לטירמין כדי לעטוף ולתרבית זקיקים פרה-אנטרליים משחלת העכבר. אנו מפרטים גם שתי גישות לשימור הקפאה של זקיקי השחלות על ידי ויטריפיקציה.

יישום של הידרוג'ל היאלורונן חדשני לתרבית זקיקים תלת מימדית ומתודולוגיה לשימור הקפאה של זקיקי שחלות עכבר

אנו מתארים שיטות לתרבית זקיקי שחלות בתבנית אגרוז חדשה ללא פיגומים המשלימים את הגמטוגנזה במבחנה .

ייצור ושימוש בתבניות אגרוז הניתנות להתאמה אישית לתרבית זקיקי שחלות עכבר ללא פיגומים

אנו מתארים שיטות לבידוד תאי סומטיקה של שחלות העכבר מחלק מועשר בסטרומה של השחלה וליצירת אורגנואידים סומטיים של שחלות העכבר בגישה ללא פיגומים.

חקירת מיקרו-סביבת השחלות: שיטות לבידוד, תרבית דו-ממדית ותרבות אורגנואידית של תאי סומטיקה בשחלות בעכברים

למד שיטת תרבות איברים תלת-ממדית באלגינט לתאי אפיתל שחלות וחצוצרות עכברים. שיטה זו מאפשרת חקר אירועי התחלה בסרטן שחלות תוך שמירה על מאפיינים תאיים נורמליים.

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

גלה סרטונים נוספים