גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה תאים תמונה שכותרתו fluorescently למחצה עבה פרוסות המוח. על ידי תיקון, חיתוך, ואת אופטית ניקוי רקמת המוח אנו מתארים כיצד הדמיה epifluorescent או confocal רגיל יכול לשמש כדי לחזות תאים בודדים ורשתות נוירונים בתוך רקמת העצבים ללא פגע.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ביתר קלות נוירונים פלואורסצנטיים בתוך פרוסות מוח עבות. זה מושג על ידי הטמעת המוח תחילה במחזיק תקע אירוס. השלב השני של ההליך הוא לחתוך את המוח לפרוסות עבות על הספר הדחוס.

השלב השלישי של ההליך הוא ניקוי אופטי של פרוסות המוח בשיפוע גליצרול. השלב האחרון של ההליך הוא הרכבת פרוסות המוח המנוקות על שקופיות להדמיה פלואורסצנטית. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות ביטוי מדווח של חלבון פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה בתאי עצב בתוך פרוסות מוח עבות, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או קונפוקלית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו חתך דק, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית טורית או הדמיה מרובת פוטונים, הוא שהיא הרבה יותר מהירה, פחות עתירת עבודה ואינה דורשת טכניקת מיקרוסקופיה יקרה או מתוחכמת. כדי להתחיל לאחזר את רקמת המוח של העכבר שעברה קיבוע NC 2 על ידי זלוף לב והייתה לאחר קידומת למשך שעה עד שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו תמיסת אגרו נמוכה של נקודת ג'ל נמוכה בחוזק גבוה של 2% ב-PBS וחממו במיקרוגל עד להמסה.

העבירו את האגרוס המותך למבחנה והניחו גוש חום של 40 מעלות צלזיוס כדי לאזן את הטמפרטורה בזמן שהאגרוס מאזן מדביק את רקמת המוח הקבועה על הבוכנה של מזרק הדגימה. עם סנו אטה, דבק הטביע את הרקמה המותקנת בתמיסת סוכרוז רוויה PBS כדי לצפות את פני המוח ולאחר מכן למשוך את הבוכנה לתוך בית הבוכנה. הכניסו את הארוס החם לתוך הבוכנה, מכסים לחלוטין את רקמת המוח תוך הקפדה לא להכניס בועות אוויר.

לבסוף, מהדקים את מזרק הדגימה עם בלוק קירור קר למשך כדקה. כדי להגדיר את ה-aros, הרכיבו את מזרק הדגימה המכיל את רקמת המוח המוטבעת לתוך הבית הדחוס. יישר את קצה הלהב היטב עם יציאת מזרק הדגימה, ולאחר מכן מלא את מיכל החיץ ב-PBS.

סובב את המיקרומטר. ברגע שעובי הפרוסה קדימה כדי להוציא את רקמת המוח המוטמעת ממזרק הדגימה. כדי ליצור את הפרוסה הראשונה, לחץ על כפתור ההתחלה ביחידת הבקרה.

חזור על תהליך קידום הרקמה המוטבעת ולחיצה על כפתור ההתחלה כדי ליצור את מספר הפרוסות הרצוי. אוספים את הפרוסות בעזרת פיפטת העברה ומעבירים אותן לבקבוקון שאיפת זכוכית מלא בפיפטה PBS מרוב ה-PBS מהפרוסות שנאספו ומחליפים ב-10% גליצרול בתמיסת PBS. נדנד את הבקבוקון בעדינות בארבע מעלות צלזיוס על שייקר מסתובב על השולחן עד שהפרוסות שוקעות.

המשך בניקוי ההדרגתי על ידי חזרה על תהליך הסילוק והמילוי מחדש עם 25, 50 ולאחר מכן 75% תמיסות גליצרול. הסר את תמיסת ה-75% גליצרול והחלף ב-90% גליצרול. נזהר לא להכניס בועות ולאזן בארבע מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין.

כעת, לאחר שהפרוסות נוקו בצורה מקסימלית, הן כבר לא ישקעו, אלא במקום זאת יראו ציפה ניטרלית. חותכים דבק דו צדדי למלבן פתוח עם גבול של שניים עד שלושה מילימטר כדי להתאים לאזור הניתן לצפייה של מיקרוסקופ בגודל 25 על 75 מילימטר החלק באמצעות זוג מלקחיים. סדרו את פרוסות המוח בתוך הגבול בשקופית.

הורד בעדינות את זכוכית הכיסוי על סרט ההדבקה. היזהר לא להכניס בועות אוויר ולהפעיל לחץ ליצירת אטימה, שאב עודף גליצרול, ולאחר מכן אטום את שולי החלקה על ידי מריחת לק שקוף. לאחר שהאטם התייבש, ניתן לאחסן את השקופית בקופסת שקופיות בארבע מעלות צלזיוס או לצלם.

השתמש מיד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי. ניתן לראות את דפוס הביטוי של וקטור ויראלי המבטא GFP משופר בחתך קורונלי בעובי 200 מיקרומטר של רקמת מוח עכבר. כאן, האזור המודגש של התמונה הפלואורסצנטית של האפי מוצג ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחשוף נוירונים קליפת המוח בשכבה חמש בודדים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין פרוסות מוח קבועות עד עבות להדמיה פלואורסצנטית מהירה וברזולוציה גבוהה.