גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקל על ויזואליזציה של נוירונים פלואורסצנטיים בתוך פרוסות מוח עבות. דבר זה מושג תחילה על ידי הטמנת המוח במחזיק פלגי aeros. השלב השני של הפרוצדורה הוא חיתוך המוח לפרוסות עבות באמצעות tome דחוס.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע שקיפות אופטית של פרוסות המוח במדרג גליצרין. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא העמדת פרוסות המוח השקופות על עלויות לצורך דימוג פלואורסצנטי. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות ביטוי של חלבון רפורטר פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה בנוירונים בתוך פרוסות מוח עבות, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפי-פלואורסצנטית או קונפוקלית.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון חיתוך דק, מיקרוסקופיה פלורסצנטית סדרתית או דימוי מרובה פוטונים, הוא שהיא מהירה הרבה יותר, דורשת פחות עבודת כפיים ואינה מחייבת טכניקת מיקרוסקופיה יקרה או מורכבת. כדי להתחיל, הוציאו את רקמת המוח של העכבר שעברה קיבוע NC שתיים באמצעות פרפוזיה לבבית וקיבוע משלים למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, הכינו תמיסת אגרו (agro) בריכוז 2% בעלת חוזק גבוה ונקודת ג'ל נמוכה ב-PBS וחממו במיקרוגל עד להמסה מלאה.

העבירו את האגרוז (agros) המותך למבחנה והניחו אותו בבלוק חימום בטמפרטורה של 40 °C כדי להשוות את הטמפרטורה. בזמן שהאגרוז מתstabilize, הדביקו את רקמת המוח המקובעת לבוכנה של מזרק הדגימות. בעזרת דבק Sano Aate, טבלו את הרקמה המורכבת בתמיסת PBS רוויה בסוכרוז כדי לצפות את פני השטח של המוח, ולאחר מכן משכו את הבוכנה למטה אל תוך תא הבוכנה. טפטפו את האגרוז החם אל תוך הבוכנה, כך שיכסה לחלוטין את רקמת המוח, תוך הקפדה לא להחדיר בועות אוויר.

לבסוף, קבעו את מזרק הדגימה באמצעות בלוק קירור למשך כדקה אחת. כדי להגדיר את ה-aros, הרכיבו את מזרק הדגימה המכיל את רקמת המוח המוטמעת אל תוך הבית הדחוס. יישרו את קצה הלהב באופן צמוד לפתח היציאה של מזרק הדגימה, ולאחר מכן מלאו את מיכל התמימות ב-PBS.

סובב את המיקרומטר. הפעל את התקדמות עובי הפרוסה כדי לדחוף את רקמת המוח המוטמעת אל מחוץ למזרק הדגימה. כדי להפיק את הפרוסה הראשונה, לחץ על כפתור ההפעלה (start) ביחידת הבקרה.

חזור על תהליך קידום הרקמה המוטמעת ולחיצה על כפתור ההפעלה כדי להפיק את מספר הפרוסות הרצוי. אסוף את הפרוסות באמצעות פפית העברה והעבר אותן לבקבוק זכוכית לספיגה מלאה ב-PBS. שאב בעזרת פפית את רוב ה-PBS מהפרוסות שנאספו והחלף אותו בתמיסת 10% glycerol ב-PBS. נער את הבקבוק בעדינות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס על שייקר סיבובי שולחני עד שהפרוסות ישקעו.

המשיכו בניקוי ההדרגתי על ידי חזרה על תהליך השפיכה והמילוי עם תמיסות גליצרין בריכוזים של 25%, 50% ולאחר מכן 75%. שאבו את תמיסת הגליצרין בריכוז 75% והחליפו אותה בגליצרין בריכוז 90%. הקפידו שלא להכניס בועות אוויר, והגיעו לשיווי משקל בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס תוך כדי נענוע עדין.

כעת, לאחר שהפרוסות עברו הבהרה מקסימלית, הן לא ישקעו יותר, אלא יפגינו ציפה ניטרלית. בעזרת פינצטה, גזרו דבק דו-צדדי למלבן פתוח עם שוליים של שני עד שלושה מילימטרים, כך שיתאים לשטח התצפית של זכוכית מיקרוסקופ בגודל 25 על 75 מילימטרים. סדרו את פרוסות המוח בתוך השוליים על גבי הזכוכית.

הנח בעדינות את זכוכית הכיסוי על סרט הדבק. תוך הקפדה שלא להחדיר בועות אוויר ומתוך הפעלת לחץ ליצירת אטימה, שאב את עודפי הגליצרין, ולאחר מכן אטום את קצוות זכוכית הכיסוי באמצעות לק שקוף. לאחר שהאיטום התייבש, ניתן לשמור את השקופית בקופסת שקופיות בטמפרטורה של 4°C או לבצע דמיון.

יש להשתמש מיד במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפי-פלואורסצנטית. ניתן לראות את דפוס הביטוי של וקטור ויראלי המבטא GFP משופר בחתך קורונלי בעובי 200 µm של רקמת מוח של עכבר. כאן, האזור המודגש בתמונת האפי-פלואורסצנציה מוצג ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחשוף נוירונים קורטיקליים בודדים משכבה חמש.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הכנת פרוסות מוח מקובעות ועבות עבור דימוי פלואורסצנטי מהיר וברזולוציה גבוהה.