הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת את ספיגת הננו-חלקיקים לתוך גידולים באמצעות דימוי תוך-חי (intra vital imaging). הדבר מתבצע תחילה על ידי קילוף המעטפת והקדמת עוברי עוף. השלב השני הוא הקמת גידולי קסנוגרפט (xenograft) בממברנה החלולית-שלייית, או ה-cam, והמתנה לצמיחתם למשך כשבוע.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הזרקה תוורידית של ננו-חלקיקים אל תוך העכבר וביצוע הדמיה קונפוקלית אינטרה-ויטלית בזמן אמת של גידול השסנוגרפט. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא כריתה וחיתוך של הגידול. לבסוף, ספיגת הננו-חלקיקים על ידי הגידול נמדדת כמותית מהתמונות, וניתן לבצע ניתוח משני של הגידול.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת הפקה של תמונות ברזולוציה גבוהה להערכת הדינמיקה של הצטברות ננו-חלקיקים בגידולים ברמה המיקרוסקופית. יתרה מכך, באמצעות מערכת מודל זו, חוקר בודד יכול לנתח מספר רב מאוד של קבוצות ניסוייות בתוך שבועיים. בנוסף, קרום ה-Cory Alloid של עוברי ה-Shells נגיש בקלות למניפולציה פיזית ולדימות לא פולשני.

המעבדה שלי מתמקדת בפיתוח ננו-חלקיקים עבור דימות מולקולרי ממוקד והובלת תרופות בסרטן. החיפוש שלנו אחר מודל קסנוגרפט מהיר וזול שבו ניתן לבצע ניתוחי ספיגה מפורטים הוביל אותנו לעוברי עוף בשיטת shells. כאן אנו משתמשים בדימות אינטרה-ויטלי (intravital) ברזולוציה גבוהה כדי להעריך את ספיגת הננו-חלקיקים בكسנוגרפטים של גידולי אדם במודל שונה של עוברי עוף בשיטת shells.

עבור פרוטוקול זה, הכינו רשימת ביצים של עוברי תרנגולות מופרות ביום הרביעי. באמצעות השיטה הסטנדרטית, ודאו שהעוברים מופרות וחיים על ידי בדיקת דופק, והדגירו אותם בטמפרטורה של 38 °C עם לחות יחסית של לפחות 60% עד ליום התיתפתח בארץ. ביום התשיעי, העוברים יהיו מוכנים להחדרת תאי גידול.

הרכיבו מיקרו-מזרק על ידי חיבור מחט בכי মাপ 18 למזרק של 1 מיליליטר באמצעות קטע צינור טיגון (tigon) באורך של חמישה עד שישה אינצ'ים. הכניסו בזהירות את קצה המחט (הבבל) לתוך הצינור. כארבעה עד חמישה אינצ'ים מהצינור צריכים לבלוט מקצה המחט.

כעת, שאבו את תרחיף תאי הגידול דרך הפיתול אל תוך המזרק והפכו אותו. הקש הקיאו בזהירות על דופן המזרק ולחצו על הבוכנה כדי להוציא בועות אוויר. לאחר מכן, הכניסו מחט זכוכית למיקרו-הזרקה בקצה הפיתול ולחצו על הבוכנה עד שתרחיף התאים יגיע לקצה המחט.

כעת, תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הזרקו לאט ובזהירות בין 10,000 ל-100,000 תאי סרטן אל תוך החלל הבין-רקמתי בתוך ה-cam. התאים צריכים ליצור גושים (bolus) נראים לעין בתוך ה-cam; תאים שהופקדו על פני השטח של ה-cam ניתן להסיר על ידי טבילה קלה עם נייר Kimwipe או מקלוני צמר. כעת, החזירו את העוברים לאינקובטור בטמפרטורה של 38 °C עם לחות של 60% לפחות.

יש לאפשר לגידול לצמוח ולהתvסקלר (להיווצר בו כלי דם) למשך עד שבעה ימים, עד להגעה לקוטר של חמישה מילימטרים לפחות לפני הדימיג'. יש לסמן את הננו-חלקיקים בצבע פלואורסצנטי, התואם למיקרוסקופ האינטרה-ויטאל, ולאחסנם בטמפרטורה של 4°C ב-PBS, שם הם נשארים יציבים למשך שנה אחת לפחות. לאחר מכן, יש לסובב (spin down) את הננו-חלקיקים למשך דקה אחת כדי לשקיע אגרגטים לפני שאיבתם לתוך המיקרו-מזרק. כעת, באמצעות PBS לדילול הננו-חלקיקים, הכין ריכוז עבודה של 1 mg/mL כדי להזריק בסופו של דבר 50 µg של ננו-חלקיקים בנפח של 50 µL.

כעת עברו להזרקות ביום ה-16 של ההתפתחות העוברית. ודאו שהגידולים מווסקולריים מספיק כדי לבחור את העוברים בעלי הגידולים המתאימים ביותר להזרקה תוך-ורידית. הזריקו דקסטרין פלואורסצנטי בעל משקל מולקולרי נמוך, אשר נבדל ספקטרלית מתאי הגידול והננו-חלקיקים.

לאחר מכן, בצעו הדמיה של הדקסטרין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ובחרו את העוברים עם הגומיים בעלי רמת כלי דם הגבוהה ביותר. לאחר בחירת העוברים, השתמשו במזרק מיקרו מוכן להחדרת לפחות 200 µL מהננו-חלקיקים שהוכנו. הפכו את המזרק.

הקישו בזהירות על הדופן והפעילו לחץ על הבוכנה כדי להוציא בועות אוויר. כעת, הכניסו מחט זכוכית דקה להזרקה מיקרוסקופית (microinjection) בעלת קצה חרוטי וארוך לקצה הצינור, והפעילו לחץ על הבוכנה עד שפתרון הננו-חלקיקים יגיע לקצה המחט. מחט קהה לא תחדור דרך האקטודרם, ומחט חדה ודקה מדי תישבר בעת החדרתה לרקמה.

בשלב הבא, הזרק באופן תוך-ורידי בין 30 ל-200 µL של ננו-חלקיקים לעובריו, במרחק מהצד המיועד להדמיה, מיד לאחר הזרקת הננו-חלקיקים. את הגידולים, כפי שמתואר בסעיף הבא, יש להתחיל בהכנת יחידת ההדמיה של העובריו. ראשית, מרח שכבה דקה של גריז ואקום מסביב להיקף של פתח ההדמיה בחלק התחתון של המכסה.

לאחר מכן, התקינו כיסוי זכוכית של 18 מילימטר על הפתח. כעת העמיסו את העובר ליחידה כך שכיסוי הזכוכית יהיה מעל האזור המיועד לדימות. הורידו באיטיות את מכסה היחידה עד שכיסוי הזכוכית יבוא במגע עם העובר, והבריגו את המכסה למקומו.

כעת מלאו את הצלחת המכילה את העובר ביחידת ההדמיה עם מים בטמפרטורה של 37 °C. יחידה זו תחזיק את העובר במקומו תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי בעל דיסק מסתובב (spinning disc confocal microscope) במיקרוסקופ פלואורסנציה קונפוקאלי בעל דיסק מסתובב. ודאו שתא הסביבה נמצא בטמפרטורה של 37 °C.

כעת, מקמו את יחידת הדימוי על הבמה כך שחלון זכוכית הכיסוי נמצא ישירות מתחת לעדשת המיקרוסקופ. התקדמו לביצוע הדימוי. רכשו סדרות תמונות (stacks) ברזולוציה גבוהה של הגידול וכלי הדם שסביבו מיד לאחר ההזרקה ובמרווחים של שעה.

לאחר מכן, התמונות ישקפו שינויים מבניים מפורטים המתרחשים בכלי הדם של הגידול. ניתן לצלם את העובר באופן רציף למשך עד 36 שעות ללא צורך בהחלפת רחלוץ המים. כדי לכמת את הספיגה של ננו-חלקיקים ויראליים מהתמונות, השתמשו בחבילת תוכנה כגון velocity.

ראשית, בחרו את הגידול והגדירו את גבולותיו מהסטרומה הסובבת. הבחירה מופעלת באמצעות סימון הגידול בדקסטרין פלואורסצנטי. כעת, חשבו את עוצמת האות הפלואורסצנטי הממוצע מהננו-חלקיקים בגידול ובאזורים מייצגים של הסטרומה הסמוכה.

בשלב הבא, חשבו את היחס של אות הממוצע. הגבירו את הבחירה של הגידול ביחס לאות הממוצע. הגבירו את הבחירה של הסטרומה.

יחס הגבוה מאחד מעיד על כך שהננו-חלקיקים ממוקמים באופן מועדף בגידול. תאי סרטן מעי גס מסוג HT 29 הוזרקו כדי ליצור גוש בקוטר של כמילימטר אחד בתוך ה-cam ביום התשיעי. לאחר שבעה ימי דגירה, הוזרק לעוברי עוף באופן תוורידי דקסטרין בעל משקל מולקולרי נמוך כדי לאשר את הווסקולריזציה של הגידול.

מתן תוך-ורידי של ננו-חלקיקי CPMV LOR 6 47 או של ננו-חלקיקי CPMV LOR 6 47 פגילאים, ואחריו דימות קונפוקאלי בזמן אמת ברזולוציה גבוהה, גילה כי הן ננו-חלקיקי CPMV והן ננו-חלקיקי CPMV פגילאים סימנו במהירות את כל מערכת כלי הדם. בתוך 12 שעות לאחר ההזרקה, כימות של האות הפלואורסצנטי באזורי הגידול לעומת אזורי הסטרומה גילה כי הספיגה של CPMV פגילאי לתוך הגידול הייתה גבוהה פי שלושה בקירוב מזו של CPMV. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד לבצע דימות אינטרה-ויטלי ברזולוציה גבוהה להערכת ספיגת ננו-חלקיקים בקסנוגרפטים של גידולים במודל של עובר עוף, החל מהכנת עוברי העוף, דרך השתלת תאי גידול (xenografting), הזרקה תוך-ורידית של ננו-חלקיקים, והערכת ספיגת הננו-חלקיקים בגידולים באמצעות דימות קונפוקאלי אינטרה-ויטלי בזמן אמת.