Name: רצף של מיקרופלורת חיידקים דם היקפיים: הניסיון שלנו עם HIV נגועים חולים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: למדו ריצוף DNA חיידקי בדם היקפי של חולי HIV לזיהוי מיקרוביוטה מתמירה. שיטה זו מאפשרת הבנת השפעת החיידקים על מערכת החיסון והשלכות קליניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה ג&#39;יאני Scimone לסיוע מעולה עם ביצוע וידאו.

טיפול של דגימות דם נגוע ב-HIV דורש כמה המלצות חשובות. דגימות דם של כל חייב להיות מועבר דליפה הוכחה מכולות חזקים. יש להקפיד בעת לקיחת הדגימה, כדי למנוע זיהום חיצוני של מכולה של כל הניירת המלווה את הדגימה. כל האנשים עיבוד דם נגוע חייב ללבוש כפפות. כפפות יש לשנות לרחוץ ידיים לאחר השלמת עיבוד הדגימה. עיבוד של HIV-נגוע דגימות דם חייבת להיעשות ברדס II הקבינט Biohazard בכיתה. עזרי pipetting מכונות אמור לשמש. שימוש של מחטים או מכשירים חדים אחרים (כולל למשל pipettes זכוכית או צינורות נימי) חייב להיות מוגבל למצבים בהם אין ברירה. משטחים מעבדה יש ​​לחטא עם חומר חיטוי כימי מתאים לאחר לשפוך דם וכאשר פעילויות עבודה הושלמו. חומרים המשמשים מזוהמות חייב להיות חיטוי לפני שימוש חוזר או חייב להיות מסולק בדרך הנכונה דרך תוואי פסולת קליניים. בכל מקרה של חשיפה תעסוקתית דם או נוזלים מדבקים בפוטנציה (כלומר, אלה הדורשים אמצעי זהירות אוניברסליים) יש להתייחס כאל מקרה חירום רפואי כמו התערבויות חייב להיות יזם מיד כדי להיות יעיל. הפרוטוקול דורש 5 ימים להשלמתו. הזמן הוא מפורט באיור 1. מין חיידקית מזוהים באמצעות השיטות המתוארות באיור 2. 1. לדוגמה אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 9 מ"ל של דם מלא נמשך לתוך צינורות המכיל EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות הם centrifuged ב 2000 סל"ד במשך 10 דקות על RT כדי לקבל פלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלזמה נאסף בתוך צינור Eppendorf סטרילי 2 מ"ל. </li></ol> 2. הפקת דנ"א מדגימות פלזמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא כראוי, מכסה המנוע pipettes חומר הדרוש לצורך הניסוי על מנת להבטיח סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום כל החומרים תחת אורות UV במשך 30 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב כפפות בחומר חיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים מגבות נייר כמה אתנול למקם אותם מתחת למכסה המנוע. בכל פעם טיפ נמחקת לנגב את פיפטה על מגבות נייר רטוב. </li></ol> הדנ"א מופק באמצעות ערכת מסחרי בהתאם להוראות היצרן (Easy-DNA קיט, Invitrogen, בקרלסבד קליפורניה, ארה"ב). <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 350 μL של פלזמה ממוקמים צינור סטרילי Eppendorf 2ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 350 μL של מים מסוננים ultrapure משמשים בקרה שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של ליזוזים (1mg/ml) על דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL הפתרון תמוגה ומערבבים בעדינות את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 7 דקות 65 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 900 μL של כלורופורם על דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס במרץ עד דגימות הן צמיג אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL הפתרון רטיבות ו מערבולת במרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות 10500 סל"ד במשך 10 דקות ב RT להפריד בין השלבים ויוצרים את הממשק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית העליון צינור microcentrifuge טריים המכילה 1 מ"ל של 100% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות 10500 סל"ד במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1ml של אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות במהירות מקסימלית במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אתנול. אתנול שיורית יש להסיר עם pipettator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ב 50 μL מים ultrapure. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את ריכוז ה-DNA עם ספקטרופוטומטר. </li></ol> 3. 16S rRNA ג'ין PCR הגברה PCR מתבצעת 9 כפי שתואר לעיל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Amplify DNA בתערובת 100 תגובה μL המורכב μL 10 של חיץ PCR 10X, 5 μL של 25 מ"מ MgCl2, 5 μL של 2 dNTPs הכולל מ"מ, 1 μL של פריימר 50 מיקרומטר RW01 (AACTGGAGGAAGGTGGGGAT), 1 μL של פריימר 50 מיקרומטר DG74 (AGGAGGTGATCCAACCGCA), 34 μL של H20 ו 0.5 μL של פולימראז תקי (AmpliTaq זהב, אפלייד Biosystem, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את תערובת PCR במסננים כדי למנוע זיהום אפשרי של פולימראז תקי חיידקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מסננים (Microcon, Millipore, Billerica, מסצ'וסטס, ארה"ב) במשך 30 דקות ב RCF 500 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot PCR לערבב לפי מספר דגימות אשר צריך להיות מוגבר (חיוביות ושליליות שולטת PCR, דגימות מים חילוץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש התנאים הבאים Cycler תרמי: 94 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 40 פעמים במשך דקה 1 בכל פעם ב 94 ° C, 55 ° C ו 72 ° C, ו - 10 דק 'ב 72 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את המוצר PCR על ג'ל agarose 2%. השתמש 100 נ"ב סולם הדנ"א. גודל PCR המוצר על 360 נ"ב (איור 3). </li></ol> 4. PCR טיהור מוצר רק דגימות חיוביות PCR צריך להיות מטוהרים. הטיהור מתבצע באמצעותערכת מסחרי הבאים הוראות היצרן (PureLink PCR microkit, Invitrogen, בקרלסבד קליפורניה, ארה"ב). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 כרכים של הצפת עקידת המכיל isopropanol לכל נפח 1 של המוצר PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מוצר PCR עם הצפת עקידת לעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דקה 1 ב RCF 10,000 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טור עם הצפת לשטוף המכיל אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דקה 1 ב RCF 10,000 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות המרבית למשך דקה 1 ב RT לייבש את הממברנה סיליקה להסיר כל חוצץ לשטוף שיורית עם אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL מים ultrapure. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דקה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 2 דקות על RT כדי לאסוף את ה-DNA מטוהרים. </li></ol> 5. שיבוט Lysogeny מרק (LB) אופן ההכנה פלייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 25 גרם של תערובת LB ב כ 800 מ"ל מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את הנפח הסופי ל 1 ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 גר 'של Bactoagar. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מעוקר, במרץ מערבולת הפתרון בבקבוק לערבב אגר מותכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב הפתרון 50 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) ומערבלים עד שהוא נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים צלחות לעומק של כ 3 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את הצלחות החוצה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים X-גל (40mg/ml) ו IPTG (100 מ"מ) על כל צלחת LB ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. </li></ol> טרנספורמציה תאים המוסמכת השינוי מתבצע באמצעות הוראות ערכה המסחרי הבא של היצרן (Topo ת"א ערכה שיבוט, Invitrogen, בקרלסבד קליפורניה, ארה"ב). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת התגובה שיבוט (1-4 μL של מוצר ה-PCR טריים, 1 μL של תמיסת מלח, 1 μL של וקטור מים במידת הצורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות התגובה דגירה למשך 5-10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התגובה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL התגובה שיבוט לתוך בקבוקון של תאים המוסמכת ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על קרח במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום הלם התאים למשך 30 שניות על 42 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את הצינור לתוך הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250 μL של המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי צינור tighly ולנער את הצינור אופקית ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים 50 μL מן התמורה כל על צלחת סלקטיבית prewarmed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה בשעה 37 ° C. </li></ol> לאחר דגירה, מושבות לבן וכחול לפתח על צלחות. מושבות לבן הן חיוביות עבור החדרת מוצר ה-PCR ומושבות כחול הן שליליות עבור החדרת מוצר ה-PCR. 6. סידור ניתוח סידור התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב נעשית באמצעות ריאגנטים אלה: 2,5-DNA μl, 1 פריימר μl (5pmol / μl) 1,1 BigDye μl (Applied Biosystem, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cycler התנאים תרמי: 96 ° C עבור 1 דקות; 25 פעמים עבור 96 ° C למשך 10 שניות, 55 ° C למשך 15 שניות ו - 60 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. </li></ol> טור טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תגובה, להכין עמודה אחת MicroSpin (Qiagen, מילאנו, איטליה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך עמודה מערבולת לערבב שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את החלק התחתון של הטור, לשחרר את המכסה ¼ בתורו, ועמודה מקום צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 3200 סל"ד במשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עמודה צינור microcentrifuge נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות pipet התגובה רצף שלם PCR למרכז העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 3200 סל"ד במשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA מטוהרים יהיה eluite לתוך הצינור (20 μl מים ultrapure). </li></ol> סידור ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען המדגם מטוהרים (20 μl) לתוך צלחת 96-multiwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הצלחת לתוך ברצף. Sequencers DNA אוטומטי ליצור chromatogram בארבעה צבעים להציג את התוצאות של הפעלת רצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלט את רצף נוקליאוטידים כשאילתת נגד מאגרי רצף הציבור. החיפוש מבוצע על צמח השדה מסדי נתונים ושרתים, בסיסי עם כלי חיפוש מקומי המערך (תפציץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו רק עם חיידקים homologies 98-100%. </li></ol> 7. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ציר הזמן של ההליך. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. תרשימי זרימה של הליך הזיהוי כולו החיידק. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. 2% ג'ל agarose מראה מגוון רחב 16S rRNA גן מוצרים PCR. ליין 1 מכיל דנ"א 100bp סולם, מסלול 2 מכיל את השליטה PCR חיובי, במסלול 3 מציג את השליטה שלילי PCR. ליין 4 מראה דגימות מכל חולה איידס, לבין מסלול 5 מכיל מים. ליין 6 shows דגימות מאדם בריא תגובה שלילית PCR; נתיב 7 מכילה מים. רק חולי איידס מציג הגברה PCR חיובי. מים ultrapure לשמש מלאה שלילית במהלך שלב החילוץ, עולה כי הזיהום לא התרחשה. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. 0.7% ג'ל agarose מראה פלסמיד חילוץ עם הליך miniprep. ליין 1 מכיל סולם 1 Kilobase DNA, מסלול 2 מכיל את המושבה לשלוט כחול, נתיבים 3 עד 12 מכילות מושבות לבן. הפלסמיד מהמושבה הכחול אינו מכיל את להכניס מוצר PCR. כל 10 מושבות לבן מכילים פלסמיד עם הוספת הנכון. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. מציג דוגמה לניתוח רצפי החיידקים פלזמה מאדם עם HIV אחד. התוצאות שלנו מראות כי טרנסלוקציה חיידקים מחלת האיידס כרוכה צומח polimicrobic, אשר אינו נראה HIV-שלילי נושאים, דבר המצביע על כשל ניכר חסינות במעי בשליטה טרנסלוקציה חיידקים.

<ol><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li>
<li>Macpherson, A. J., Harris, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+commensal+intestinal+bacteria+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).</li>
<li>Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+intestinal+flora+in+the+treatment+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease.</a> Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).</li>
<li>Brenchley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+a+cause+of+systemic+immune+activation+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection.</a> Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).</li>
<li>Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+disease%3A+fallout+from+a+mucosal+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe.</a> Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).</li>
<li>Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+bacterial+DNA+correlate+with+immune+activation+and+the+magnitude+of+immune+restoration+in+persons+with+antiretroviral-treated+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection.</a> J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).</li>
<li>Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+associated+with+sustained+failure+in+CD4%2B+T-cell+reconstitution+in+HIV-infected+patients+on+long-term+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy.</a> AIDS. 22, 2035-2038 (2008).</li>
<li>Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. The 17th Conference on Reteroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA, USA, , (2010).</li>
<li>Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+primers+and+probes+for+the+16S+rRNA+gene+of+most+species+of+pathogenic+bacteria%2C+including+bacteria+found+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid.</a> J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<p class="jove_content"&gt; הננו להראות פרוטוקול ה-PCR / ריצוף לאפיין את טרנסלוקציה של חיידקים דם היקפיים של HIV-נגוע יחידים.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; תוצאות אמינות ביותר מתקבלים בעת שימוש פלזמה שנאספו EDTA המכילים צינורות. לאחר דגימה דם, פלזמה צריכים להיות מופרדים על ידי צנטריפוגה בתוך 2 / 3 שעות, כדי למנוע שבר השפלה haemolysis ו-DNA. דוגמאות מאוחסנים הראשון כ 5 ימים ולאחר מכן ב -80 ° C. ב -20 ° C ריבוי להקפיא להפשיר מחזורי אשר עלול לגרום לאובדן של ה-DNA חיידקי יש להימנע.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; דגימות פלזמה יש להשתמש תוך 12...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> Easty-DNA Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K 180001 </td><td></td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C2432 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E7203 </td><td></td><tr/><tr><td> Ultrapure Waer </td><td> Invitrogen </td><td> 10977049 </td><td></td></tr><tr><td> ליזוזים </td><td> Fluka </td><td> 62970 </td><td> 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מים Distillated </td></tr><tr><td> AmpliTaq זהב </td><td> אפלייד Biosystem </td><td> 26478701 </td><td></td></tr><tr><td> Microcon 100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td><td></td></tr><tr><td> PCR primers </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Eppendorf </td><td> C1343 </td><td></td></tr><tr><td> ה-DNA סולם </td><td> Invitrogen </td><td> 15628019 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink PCR מיקרו בערכה </td><td> Invitrogen </td><td> K310050 </td><td></td></tr><tr><td> אגר LB, אבקת </td><td> Invitrogen </td><td> 22700025 </td><td></td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אמפיצילין </td><td> Invitrogen </td><td> 11593027 </td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מים Distillated </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520034 </td><td> 40mg/mL ב DMF </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Invitrogen </td><td> 15529019 </td><td> 100mm במים Distillated </td></tr><tr><td> Topo ת&quot;א ערכה שיבוט </td><td> Invitrogen </td><td> K450002 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink מהירה ערכת פלסמיד Miniprep </td><td> Invitrogen </td><td> K210010 </td><td></td></tr><tr><td> ביג צבע </td><td> אפלייד Biosystem </td><td> 4337455 </td><td></td></tr><tr><td> DyeEx 2.0 ספין ערכת </td><td> Qiagen </td><td> 63204 </td><td></td></tr></tbody></table>

רצף של מיקרופלורת חיידקים דם היקפיים: הניסיון שלנו עם hiv נגועים חולים

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

מערכת העיכול בריאה מבחינה פיזיולוגית יישבו על ידי מגוון רחב של חיידקים commensal המשפיעים על התפתחות של 1,2 מערכת הריריות הלחות ואת החיסונית התאית. החיידקים הוא מוגן מפני מערכת החיסון דרך מחסום הרירית חזק. זיהומים ואנטיביוטיקה ידועים לשנות גם את המכשול נורמלי מערכת העיכול ואת הרכב של חיידקים תושב, אשר עלול לגרום הפרעות החיסון ניתן 3. HIV גורם פרצה מחסום העיכול עם כישלון מתמשך של חסינות זליגת הרירית תוך מחזור מערכתי של bioproducts חיידקי, כגון lipopolysaccharide ושברי DNA בקטריאלי, אשר תורמת להפעלת מערכת החיסון מערכתית 4-7. טרנסלוקציה מיקרוביאלית הוא מעורב immunopathogenesis HIV / איידס ועל התגובה לטיפול 4,8. אנו שמטרתו לאפיין את ההרכב של חיידקים translocating בדם ההיקפי של HIV-נגועים. כדי לרדוף אחרי המטרה שלנו הקמנו תגובת PCR עבור הגן 16S panbacteric ribosomial ואחריו ניתוח רצף. בקצרה, כל דם משני הנושאים HIV נגועים ובריאים משמש. בהתחשב בעובדה אנשים בריאים הנוכחית הומאוסטזיס מעיים רגילה ללא טרנסלוקציה של מיקרופלורת צפוי בחולים אלו. לאחר איסוף הדם כולו על ידי venipuncture והפרדה פלזמה, הדנ&quot;א מופק פלזמה המשמש לביצוע מגוון רחב PCR תגובה עבור 16S panbacteric ribosomial גן 9. ניתוחים לאחר טיהור PCR המוצר, שיבוט רצף מבוצעות.

הניסוי שלנו יציגו כיצד לבצע ניתוח רצף של מינים translocating חיידקי בדם ההיקפי של חולי איידס.

רצף של מיקרופלורת חיידקים דם היקפיים: הניסיון שלנו עם HIV נגועים חולים

מערכת העיכול הבריאה מקולונזית באופן פיזיולוגי על ידי מגוון רחב של מיקרובים קומנסליים המשפיעים על התפתחות המערכת ההומורלית...

ריצוף של מיקרופלורה חיידקית העוברת טרנסלוקציה לדם הפריפרי. הניסיון שלנו עם חולי HIV; אני מרטי, מרצה בכיר, ואני עובד כפרופסור עוזר במרפאת למחלות זיהומיות ורפואה טרופית באוניברסיטת מילאנו באיטליה. כעת נדגים לכם ניסויים על האופן שבו ניתן לזהות ולרצף DNA חיידקי מדם פריפרי של חולי HIV.מערכת העיכול הבריאה מאוכלסת במגוון רחב של מיקרובים קומנסליים המשפיעים על התפתחות מערכת החיסון ההומורלית והתאית. המיקרוביוטה מוגנת ממערכת החיסון באמצעות מחסום רירי חזק; בעקבות מספר מצבים קליניים כגון זיהומים, טיפול באנטיביוטיקה, סיבוכים לאחר ניתוח, וכן במטופלים עם קרצינומה, פנקריאטיטיס ותת-תזונה, חל שינוי במערכת העיכול.זיהום ב-HIV גורם לפריצה של מחסום מערכת העיכול עם כשל הדרגתי של החסינות הרירית ודליפה למחזור הדם הסיסטמי של תוצרי ביולוגיים חיידקיים, כגון ליפופוליסכריד ומקטעי DNA חיידקיים, התורמים להפעלה חיסונית סיסטמית; כאן נדגים את השלבים הניסיוניים של זיהוי וריצוף של DNA חיידקי הנוכח בדם פריפריאלי של חולי HIV. נשתתף בתהליך Camilla ti, עמיתה למחקר במחלות זיהומיות, Esther, סטודנטית לדוקטורט, ו-ju MariaI, עמיתת פוסט-דוקטורט, כולנו מהמרפאה למחלות זיהומיות ורפואה טרופית באוניברסיטת מילאנו. ניסוי זה שואף לזהות מיני חיידקים מדגימות דם פריפריאלי של חולים נגועים ב-HIV.נשתמש בדם מלא הן מנבדקים נגועים ב-HIV והן מנבדקים בריאים, בהנחה שאנשים בריאים מציגים הומאוסטזיס מעי רגיל. איננו מצפים לראות מיקרופלורה העוברת טרנסלוקציה בחולים אלו. דם מלא ייאסף מהמטופלים, ולאחר מכן תבוצע הפרדת פלזמה.לאחר מכן יבודד DNA לצורך ביצוע תגובת PCR בטווח רחב עבור הגן הריבוזומלי 16 s של PCIC. בעקבות זאת, יבוצעו טיהור של תוצרי ה-PCR, שיבוט ואנליזת ריצוף. השלב הראשון בניסוי שלנו הוא איסוף דם באמצעות דקירה של וריד, ולאחר מכן הפרדת פלזמה.דם מלא, בנפח של כ-9 ml, נשאב למבחנות המכילות EDTA. המבחנות מוכנסות לצנטריפוגה במהירות של 2000 RPM למשך 10 דקות. סבוב הצנטריפוגה בטמפרטורת החדר מאפשר הפרדה של הפלסמה.כעת נבצע מיצוי DNA מדגימות הפלזמה שלנו. יש לחטא כראוי את המנדף, את הפפיטות ואת החומרים הדרושים לניסוי כדי להבטיח סטריליות; יש להניח את כל החומרים תחת אור UV למשך 30 דקות לפחות. כבו את אורות ה-UV, נגבו את הכפפות בחומר חיטוי, השרו מספר מגבונים בנייר באתנול והניחו אותם תחת המנדף לצורך השלכת טיפים. במהלך הליך מיצוי ה-DNA, נגבו את הפפיטה על המגבונים הרטובים.אתם מוכנים כעת למיצוי ה-DNA. ה-DNA ממוצה באמצעות ערכה מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, 350 µL של פלזמה מועברים לשפופרת microcentrifuge בנפח 2 mL.מים אולטרה-טהורים משמשים כביקורת שלילית. 10 µL של ליזוזום בריכוז סופי של 1 mg/mL מתווספים לדגימות. לאחר מכן, הדגימות מדגרות למשך 30 דקות.בטמפרטורה של 37 °C, מוסיפים לדגימות את תמיסה A, כלורופורם ותמיסה B בהתאם להוראות לאחר הצנטריפוגה. יופיעו שלושה שלבים נפרדים. אוספים את הנוזל העליון (supernatant) ומוסיפים אותו לאתנול, כדי לאפשר שקיעה של ה-DNA, וריכוז ה-DNA נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר.השלב הבא הוא תגובת PCR בטווח רחב להגברה של הגן הריבוזומלי 16 s PRIC, המתבצעת בחדר ייעודי. תערובת PCR מוכנה באמצעות ריאגנטים אלו. תערובת ה-PCR מסוננת במשך 30 דקות ב-500 G בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי למנוע זיהום אפשרי על ידי Taq polymerase בקטריאלי.לאחר מכן מחלקים את תערובת ה-PCR לאליקוטים, בהתאם למספר הדגימות שיש להגביר. יש לזכור להקצות אליקוטים עבור בקרות תגובה שליליות וחיוביות.התרמוסייקלינג (THERMOCYCLING) מתוכנת בתנאים הבאים: 94 °C למשך חמש דקות; 94 °C, 55 °C, 72 °C למשך דקה אחת למשך 40 מחזורים; 72 °C למשך 10 דקות. משך הזמן הממוצע הוא שלוש שעות.תוצרי PCR מוצגים על ג'ל AGROS בריכוז 2%. זהו ג'ל agros בריכוז 2% המראה תוצרי PCR. הנתיב הראשון מכיל סולם של 100 bp.הנתיב השני, ביקרת PCR חיובית. הנתיב השלישי מכיל ביקרת PCR שלילית. הנתיב הרביעי מציג דגימות ממטופל חיובי ל-HIV והנתיב החמישי מכיל נתיב מים.פס שש מציג דגימות מאדם בריא ותגובת PCR שלילית. פס שבע מכיל מים. השלב הבא הוא אימות PCR.מוצרי PCR מטוהרים באמצעות ערכה מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. בשלב זה נעשה שימוש בעמודות רבות המכילות מסננים. תוצאות ה-PCR נרשמות בגיליון עבודה.כעת נמשיך לביצוע שיבוט באמצעות סינון כחול-לבן, טכניקה מולקולרית המאפשרת זיהוי של ליגציה מוצלחת של DNA לתוך וקטור. הווקטור מוחדר לתאים בקומפטיביים (competent cells) של חיידקים.התאים המתאימים גדלים בנוכחות xal. אם הליגציה הצליחה, המושבה הבקטריאלית תהיה לבנה. אם לא, המושבה תהיה כחולה.X-gal משמש כדי להצביע על כך שתא מבטא את אנזים הבטא-גלקטוסידאז ולויזואליזציה של טרנספורמציית מושבות של e coli; IPTG משרה את ביטויו של בטא-גלקטוסידאז. X-gal ו-IPTG נערבבים על פלטות המכילות אמפיסילין. תערובת שיבוט המכילה תוצרי PCR, SALT ווקטור שיבוט מוכנת בהתאם להוראות היצרן.תאי E coli מוחזקים על קרח. לאחר מכן מוסיפים לתאים את תערובת השבוט, ולאחר הלם תרמי, מדגירים את הצלחות למשך לילה ב-37 °C. לאחר הדגירה, מתפתחות על הצלחות מושבות לבנות וכחולות.מושבות לבנות הן חיוביות לתוצרי PCR. מושבות כחולות הן שליליות להחדרת תוצרי PCR. נבחרות 10 מושבות לבנות ומושבה כחולה אחת.כל מושבה מוחדרת ל-2 mL של מצע גידול נוזלי מסוג LB. המושבות, בתוספת ampicillin, מדגרות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. לאחר הדגירה, המושבות שגדלו במהלך הלילה משמשות להפקת פלסמיד באמצעות ערכת mini prep מסחרית.עמודות מיני המכילות פילטרים משמשות לשלב הבא. לאחר מיצוי הפלסמיד, הפלסמידים מוצגים על ג'ל 0.7%AROS. זהו ג'ל 0.7%AROS המציג תוצרי מיני-פרפ (mini prep). הנתיב הראשון מכיל סולם של one kilo base.הנתיב השני מכיל את מושבת הביקורת הכחולה. נתיבים שלושה עד 12 מכילים מושבות לבנות. התוצאות נרשמות בגיליון עבודה; בשלב הבא מתבצע ריצוף, ולאחר מכן הפלסמידים מוגברים.מכינים תערובת באמצעות ריאגנטים אלו. מחלקים את תערובת ה-PCR לאליקוויטות בהתאם למספר הדגימות שיש להגביר. תוכנית המחזוריות התרמית מוגדרת בתנאים הבאים: 96 °C למשך דקה אחת, 96 °C למשך 10 שניות, 50 °C למשך חמש שניות, 60 °C למשך ארבע דקות.למשך 25 מחזורים. משך הזמן הממוצע הוא כשעה אחת. לאחר ההגברה, תוצרי ה-PCR מטוהרים באמצעות עמודות המכילות מסנן.מוצרים מטוהרים נטענים על פלטה, שמונחת לאחר מכן בתוך רצף (sequencer). לאחר קבלת רצף, הוא מוזן למנוע חיפוש blast ומזוהים מיני חיידקים מכל מושבה. מושבות המציגות רצף בעל הומולוגיה של 98%to 100% נחשבות לחיוביות.זוהי דוגמה לריצוף חיידקיים בפלזמה של אדם אחד חיובי ל-HIV. התוצאות שלנו מראות כי התעתקות מיקרוביאלית במחלת ה-HIV כוללת פלורה פולימיקרוביאלית. הוכחנו בזאת כי חולים נגועים ב-HIV מציגים מיקרופלורה מיקרוביאלית פולימיקרוביאלית גבוהה במחזור הדם המערכתי.ה-DNA חיידקי בדם הפריפריאלי היה מתחת לסף הגילוי עבור אנשים בריאים שליליים ל-HIV, מה שעשוי לשקף את שלמותו של מערכת העיכול. מחקרנו מתמקד כעת בהבנה ובבדיקה של התפקיד האפשרי של המיקרופלורה בדם הפריפריאלי, בעיצוב האימונופתוגנזה של HIV, וייתכן שגם בתגובה לטיפול.

sequencing-bacterial-microflora-peripheral-blood-our-experience-with

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

HIV כמיהות ניתן להסיק באזור V3 המעטפה ויראלי. V3 הוא PCR מוגבר בשלושה עותקים באמצעות מקוננות RT-PCR, רצף, ופירשו באמצעות תוכנת bioinformatic. דוגמאות עם רצף עם 1 או יותר (ים) עם ציונים נמוכים g2P מסווגים וירוס לא R5.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

קשה לשכפל הדבקה משותפת בבני אדם במבחנה. עם זאת, טפילי מלריה אנושיים ניתנים לתרבית בקלות במבחנה, כמו גם תאים חד-גרעיניים מבודדים מדם היקפי אנושי שנדבקו באופן טבעי ב-HIV. זה מספק מודל מצוין לחקר תגובות חיסוניות מוקדמות לטפילי מלריה בהקשר של הדבקה משותפת ב-HIV.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל למדידה של מערכת חיסונית למלריה בהקשר של HIV Co-זיהום

מתוארות טכניקות המתארות הליך שיפוע להפרדת אקסוזומים מחלקיקי נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV). הליך זה שימש לבידוד אקסוזומים הרחק מחלקיקי HIV בפלזמה אנושית מאנשים נגועים ב-HIV. האקסוזומים המבודדים נותחו לתכולת ציטוקין/כימוקין.

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

דלקת של רקמות עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) ex-vivo מספק דגם תלת-ממד חשוב של וירוס פתוגנזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לעבד, להדביק דגימות רקמות מן האדם את השקדים mucosae באברי המין הנשי עם HIV-1 ולשמור אותם בתרבות-הממשק נוזלי-אייר.

לשעבר Vivo דלקת של רירית איברי המין האנושי רקמת הלימפה ונקבה עם וירוס הכשל החיסוני האנושי 1, Histoculture

רצף proviral בודדים באורך מלא (היפוך) מספקת שיטה יעילה, תפוקה גבוהה עבור הגברה רצף של יחיד, ליד באורך מלא (שלמים ולא פגומה) HIV-1 הפרו-וירוס והיא מאפשרת קביעה של הפוטנציאל שלהם שכפול-כשירות. סלטות מתגבר על המגבלות של מבחני הקודם שנועדה רצף המאגר HIV-1 סמויה.

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

אנו מתארים שיטה לעיבוד מכתשיים נוזל ששטיפה בהתאמה דם היקפי מאנשים כרוניים הנגועים באיידס על טיפול תרופתי להערכת מאגרי HIV ריאתי. שיטות אלה תוצאה של רכישת תאים CD4 T טהור מאוד מכתשי מקרופאגים שעשויים להיגרם לאחר מכן עבור immunophenotyping קלדה ו-DNA האיידס/RNA כימות על ידי תגובת שרשרת באולטרסאונד.

עיבוד של ברונמכתשיים נוזלים ומתאימים דם עבור מכתשיים מקרופאג ו CD4+ T-Cell Immunophenotyping קלדה ומאגר HIV הערכה

מוצג כאן הוא פרוטוקול אופטימיזציה עבור בידוד, culturing, העברה, וההבחנה העיקרי האנושי מונוציטים מאנשים נגועים בריאים ושליטה בריאה.

בידוד, העברה ותרבות של האדם הראשי המונולוציטים

חלב אם מעביר וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), אם כי רק ~ 15% של תינוקות היונקים על ידי אמהות מזוהמת HIV להידבק. תינוקות החושן לבלוע ~ 105על 10שמונה לוקיציטים אימהי מדי יום, למרות תאים אלה אינם לומדים. כאן אנו מתארים את הבידוד של חלב לוקיולוציטים וניתוח של קיבולת phagocytic שלהם.

בידוד של לוקיולוציטים מחלב השד האנושי לשימוש בנוגדן-מותנה תאית הסלולר שיטת מטרות HIV

למדו ריצוף DNA חיידקי בדם היקפי של חולי HIV לזיהוי מיקרוביוטה מתמירה. שיטה זו מאפשרת הבנת השפעת החיידקים על מערכת החיסון והשלכות קליניות.

רצף של מיקרופלורת חיידקים דם היקפיים: הניסיון שלנו עם HIV נגועים חולים

גלה סרטונים נוספים