רצף של מיקרופלורת חיידקים דם היקפיים: הניסיון שלנו עם HIV נגועים חולים

ריצוף של מיקרופלורה חיידקית העוברת טרנסלוקציה לדם הפריפרי. הניסיון שלנו עם חולי HIV; אני מרטי, מרצה בכיר, ואני עובד כפרופסור עוזר במרפאת למחלות זיהומיות ורפואה טרופית באוניברסיטת מילאנו באיטליה. כעת נדגים לכם ניסויים על האופן שבו ניתן לזהות ולרצף DNA חיידקי מדם פריפרי של חולי HIV.

מערכת העיכול הבריאה מאוכלסת במגוון רחב של מיקרובים קומנסליים המשפיעים על התפתחות מערכת החיסון ההומורלית והתאית. המיקרוביוטה מוגנת ממערכת החיסון באמצעות מחסום רירי חזק; בעקבות מספר מצבים קליניים כגון זיהומים, טיפול באנטיביוטיקה, סיבוכים לאחר ניתוח, וכן במטופלים עם קרצינומה, פנקריאטיטיס ותת-תזונה, חל שינוי במערכת העיכול.

זיהום ב-HIV גורם לפריצה של מחסום מערכת העיכול עם כשל הדרגתי של החסינות הרירית ודליפה למחזור הדם הסיסטמי של תוצרי ביולוגיים חיידקיים, כגון ליפופוליסכריד ומקטעי DNA חיידקיים, התורמים להפעלה חיסונית סיסטמית; כאן נדגים את השלבים הניסיוניים של זיהוי וריצוף של DNA חיידקי הנוכח בדם פריפריאלי של חולי HIV. נשתתף בתהליך Camilla ti, עמיתה למחקר במחלות זיהומיות, Esther, סטודנטית לדוקטורט, ו-ju MariaI, עמיתת פוסט-דוקטורט, כולנו מהמרפאה למחלות זיהומיות ורפואה טרופית באוניברסיטת מילאנו. ניסוי זה שואף לזהות מיני חיידקים מדגימות דם פריפריאלי של חולים נגועים ב-HIV.

נשתמש בדם מלא הן מנבדקים נגועים ב-HIV והן מנבדקים בריאים, בהנחה שאנשים בריאים מציגים הומאוסטזיס מעי רגיל. איננו מצפים לראות מיקרופלורה העוברת טרנסלוקציה בחולים אלו. דם מלא ייאסף מהמטופלים, ולאחר מכן תבוצע הפרדת פלזמה.

לאחר מכן יבודד DNA לצורך ביצוע תגובת PCR בטווח רחב עבור הגן הריבוזומלי 16 s של PCIC. בעקבות זאת, יבוצעו טיהור של תוצרי ה-PCR, שיבוט ואנליזת ריצוף. השלב הראשון בניסוי שלנו הוא איסוף דם באמצעות דקירה של וריד, ולאחר מכן הפרדת פלזמה.

דם מלא, בנפח של כ-9 ml, נשאב למבחנות המכילות EDTA. המבחנות מוכנסות לצנטריפוגה במהירות של 2000 RPM למשך 10 דקות. סבוב הצנטריפוגה בטמפרטורת החדר מאפשר הפרדה של הפלסמה.

כעת נבצע מיצוי DNA מדגימות הפלזמה שלנו. יש לחטא כראוי את המנדף, את הפפיטות ואת החומרים הדרושים לניסוי כדי להבטיח סטריליות; יש להניח את כל החומרים תחת אור UV למשך 30 דקות לפחות. כבו את אורות ה-UV, נגבו את הכפפות בחומר חיטוי, השרו מספר מגבונים בנייר באתנול והניחו אותם תחת המנדף לצורך השלכת טיפים. במהלך הליך מיצוי ה-DNA, נגבו את הפפיטה על המגבונים הרטובים.

אתם מוכנים כעת למיצוי ה-DNA. ה-DNA ממוצה באמצעות ערכה מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, 350 µL של פלזמה מועברים לשפופרת microcentrifuge בנפח 2 mL.

מים אולטרה-טהורים משמשים כביקורת שלילית. 10 µL של ליזוזום בריכוז סופי של 1 mg/mL מתווספים לדגימות. לאחר מכן, הדגימות מדגרות למשך 30 דקות.

בטמפרטורה של 37 °C, מוסיפים לדגימות את תמיסה A, כלורופורם ותמיסה B בהתאם להוראות לאחר הצנטריפוגה. יופיעו שלושה שלבים נפרדים. אוספים את הנוזל העליון (supernatant) ומוסיפים אותו לאתנול, כדי לאפשר שקיעה של ה-DNA, וריכוז ה-DNA נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר.

השלב הבא הוא תגובת PCR בטווח רחב להגברה של הגן הריבוזומלי 16 s PRIC, המתבצעת בחדר ייעודי. תערובת PCR מוכנה באמצעות ריאגנטים אלו. תערובת ה-PCR מסוננת במשך 30 דקות ב-500 G בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי למנוע זיהום אפשרי על ידי Taq polymerase בקטריאלי.

לאחר מכן מחלקים את תערובת ה-PCR לאליקוטים, בהתאם למספר הדגימות שיש להגביר. יש לזכור להקצות אליקוטים עבור בקרות תגובה שליליות וחיוביות.

התרמוסייקלינג (THERMOCYCLING) מתוכנת בתנאים הבאים: 94 °C למשך חמש דקות; 94 °C, 55 °C, 72 °C למשך דקה אחת למשך 40 מחזורים; 72 °C למשך 10 דקות. משך הזמן הממוצע הוא שלוש שעות.

תוצרי PCR מוצגים על ג'ל AGROS בריכוז 2%. זהו ג'ל agros בריכוז 2% המראה תוצרי PCR. הנתיב הראשון מכיל סולם של 100 bp.

הנתיב השני, ביקרת PCR חיובית. הנתיב השלישי מכיל ביקרת PCR שלילית. הנתיב הרביעי מציג דגימות ממטופל חיובי ל-HIV והנתיב החמישי מכיל נתיב מים.

פס שש מציג דגימות מאדם בריא ותגובת PCR שלילית. פס שבע מכיל מים. השלב הבא הוא אימות PCR.

מוצרי PCR מטוהרים באמצעות ערכה מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. בשלב זה נעשה שימוש בעמודות רבות המכילות מסננים. תוצאות ה-PCR נרשמות בגיליון עבודה.

כעת נמשיך לביצוע שיבוט באמצעות סינון כחול-לבן, טכניקה מולקולרית המאפשרת זיהוי של ליגציה מוצלחת של DNA לתוך וקטור. הווקטור מוחדר לתאים בקומפטיביים (competent cells) של חיידקים.

התאים המתאימים גדלים בנוכחות xal. אם הליגציה הצליחה, המושבה הבקטריאלית תהיה לבנה. אם לא, המושבה תהיה כחולה.

X-gal משמש כדי להצביע על כך שתא מבטא את אנזים הבטא-גלקטוסידאז ולויזואליזציה של טרנספורמציית מושבות של e coli; IPTG משרה את ביטויו של בטא-גלקטוסידאז. X-gal ו-IPTG נערבבים על פלטות המכילות אמפיסילין. תערובת שיבוט המכילה תוצרי PCR, SALT ווקטור שיבוט מוכנת בהתאם להוראות היצרן.

תאי E coli מוחזקים על קרח. לאחר מכן מוסיפים לתאים את תערובת השבוט, ולאחר הלם תרמי, מדגירים את הצלחות למשך לילה ב-37 °C. לאחר הדגירה, מתפתחות על הצלחות מושבות לבנות וכחולות.

מושבות לבנות הן חיוביות לתוצרי PCR. מושבות כחולות הן שליליות להחדרת תוצרי PCR. נבחרות 10 מושבות לבנות ומושבה כחולה אחת.

כל מושבה מוחדרת ל-2 mL של מצע גידול נוזלי מסוג LB. המושבות, בתוספת ampicillin, מדגרות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. לאחר הדגירה, המושבות שגדלו במהלך הלילה משמשות להפקת פלסמיד באמצעות ערכת mini prep מסחרית.

עמודות מיני המכילות פילטרים משמשות לשלב הבא. לאחר מיצוי הפלסמיד, הפלסמידים מוצגים על ג'ל 0.7%AROS. זהו ג'ל 0.7%AROS המציג תוצרי מיני-פרפ (mini prep). הנתיב הראשון מכיל סולם של one kilo base.

הנתיב השני מכיל את מושבת הביקורת הכחולה. נתיבים שלושה עד 12 מכילים מושבות לבנות. התוצאות נרשמות בגיליון עבודה; בשלב הבא מתבצע ריצוף, ולאחר מכן הפלסמידים מוגברים.

מכינים תערובת באמצעות ריאגנטים אלו. מחלקים את תערובת ה-PCR לאליקוויטות בהתאם למספר הדגימות שיש להגביר. תוכנית המחזוריות התרמית מוגדרת בתנאים הבאים: 96 °C למשך דקה אחת, 96 °C למשך 10 שניות, 50 °C למשך חמש שניות, 60 °C למשך ארבע דקות.

למשך 25 מחזורים. משך הזמן הממוצע הוא כשעה אחת. לאחר ההגברה, תוצרי ה-PCR מטוהרים באמצעות עמודות המכילות מסנן.

מוצרים מטוהרים נטענים על פלטה, שמונחת לאחר מכן בתוך רצף (sequencer). לאחר קבלת רצף, הוא מוזן למנוע חיפוש blast ומזוהים מיני חיידקים מכל מושבה. מושבות המציגות רצף בעל הומולוגיה של 98%to 100% נחשבות לחיוביות.

זוהי דוגמה לריצוף חיידקיים בפלזמה של אדם אחד חיובי ל-HIV. התוצאות שלנו מראות כי התעתקות מיקרוביאלית במחלת ה-HIV כוללת פלורה פולימיקרוביאלית. הוכחנו בזאת כי חולים נגועים ב-HIV מציגים מיקרופלורה מיקרוביאלית פולימיקרוביאלית גבוהה במחזור הדם המערכתי.

ה-DNA חיידקי בדם הפריפריאלי היה מתחת לסף הגילוי עבור אנשים בריאים שליליים ל-HIV, מה שעשוי לשקף את שלמותו של מערכת העיכול. מחקרנו מתמקד כעת בהבנה ובבדיקה של התפקיד האפשרי של המיקרופלורה בדם הפריפריאלי, בעיצוב האימונופתוגנזה של HIV, וייתכן שגם בתגובה לטיפול.