אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע חגיגה ממוקדת של תאי כליה בכליה העוברית של דג הזברה, הפרו נפרוס לצורך חקר התחדשות אפיתל הכליה לאחר פגיעה כלייתית חריפה. זה מושג על ידי הזרקת מיקרו ראשונה של עוברי דג הזברה עם מצומד פלואורסצנטי דקסטרן. במהלך דגירה של לילה, המצומדים נספגים באופן סלקטיבי על ידי תאי צינוריות פרוקסימליים של נפרון.

למחרת, התאים נבדקים תחת אפי פלואורסצנטי ותאים נבחרים מבוטלים באמצעות מערכת לייזר פועמת. מאוחר יותר, שינויים מורפולוגיים ומולקולריים מוערכים באמצעות היסטולוגיה, הכלאה שלמה של C 2 וכימיה אימונוהיסטוכימית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו פגיעה כלייתית חריפה באמצעות האנטיביוטיקה הנפרוטוקסית גנטמיצין, הוא שטיפולים כאלה גורמים לנזק קטסטרופלי והם קטלניים ומונעים ניתוח של אירועי התחדשות כליות לאורך זמן.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הכליות, כגון זיהוי אירועי איתות מולקולאריים המתרחשים במהלך התחדשות האפיתל. הרעיון לטכניקה זו עלה לנו לראשונה כשרצינו לפתח ניתוח מפורט של התחדשות אפיתל הכליות בצלחות פטרי. אסוף עוברי דג זברה מופרים בתמיסת E 3 שונה ללא מתילן כחול.

הרם את העוברים המופרים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד שהם בין 48 ל-55 שעות לאחר ההפריה כאשר מערכת הכליות של העובר החלה לתפקד לפני תחילת הזריקות, הכינו עץ הזרקת ארוס באמצעות תבנית עם שקעים משולשים כדי להחזיק את העוברים. לאחר מכן, הכינו מחטי מיקרו-הזרקה סטנדרטיות ותמיסת הזרקה לתיוג הצינורית הפרוקסימלית. התחל את הניסוי בהכנת העוברים.

ראשית, הסר את הקוריאן מכל ביצים שלא בקעו בעזרת מלקחיים עדינים. לאחר מכן שוטפים את פסולת הקוריאן, הפסולת מצלחת הפטרי וממלאים את המנה ב -30 מיליליטר תמיסת E 3 שונה. שנית, להרדים את הזחלים עם חמישה מיליליטר טריקה.

ודא שהזחלים מורדמים לחלוטין על ידי בדיקת תגובת מגע. אם הם לא מורדמים לחלוטין, הם יתעוותו במהלך ההזרקה. שלישית, בעזרת פיפטת העברה מפלסטיק, הכניסו את הזחלים לתבנית.

מקם את בעלי החיים עם ראשיהם בחלק העמוק ביותר של השקע וגזעיהם לאורך דופן הבאר. כעת המשך עם זריקות מיקרו תוך שריריות על ידי העמסת מחט מוכנה עם שניים עד שלושה מיקרוליטרים של דקסטרן פלואורסצ במיקום המחט והזרקת כ-1 ננו-ליטר של תמיסה לתוך תא המטען של כל חיה. הצומדים הדקסטרניים עוברים אנדוציטוזציה בקלות על ידי הצינורית הפרוקסימלית של הנפרון, מה שמאפשר תיוג מועדף של אוכלוסיית תאי אפיתל זו.

כוונו לחלק העליון של קרדית הסו והימנעו מהארכת שק החלמון, אחרת צינורות הנפרון בסופו של דבר יופרעו, כמו בחיה זו שהוזרקה בצורה לא נכונה. לאחר הזרקת הזחלים, העבירו אותם לצלחת פטרי נקייה ושטפו אותם שלוש פעמים במצע E שלוש טרי כדי להסיר את כל עקבות הטריקה. כעת, מכסים את המכסה בנייר כסף ודוגרים על בעלי החיים למשך הלילה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס.

לפני שתתחיל בהליך זה, הכינו את אמצעי הגיוס ושמרו כמה עליות ממנו לשימוש מיידי בטמפרטורת החדר ולשמור את העליונות הנותרות בארבע מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. התחל בהרדמת זחלי דגי הזברה עם חמישה מיליליטר טריקה ב-30 מיליליטר של E שלוש. בדיוק כמו קודם, וודאו שהדגים לא מגיבים לתחושת מישוש.

כעת בחנו את בעלי החיים המוזרקים תחת פלואורסצנטיות כדי לבחור זחלים עם צינורות פרוקסימליים הניתנים להמחשה בקלות. העבירו עד 12 זחלים לצלחת חדשה המכילה את אותו ריכוז של טריקה במיקרוסקופ פלואורסצנטי מורכב המצויד במסנן פיצי, תאורת שדה בהיר ומופע לייזר. האבלציה מתחילה בהעברה והרדמה של לבה לצלחת המכילה אמצעי קיבוע.

והמתינו שתי דקות, ואז העבירו את הלבה למגלשת שקע זכוכית המכילה טיפה של אמצעי קיבוע. מקם בעדינות את הצד הגבי של החיה כלפי מעלה בעזרת בדיקה עדינה והתמקד בצד הגב. כעת באמצעות מערכת לייזר מיקרו נקודתית מכוילת באחד הנפרונים ומשאיר את השני שלם כבקרה.

תראה פיזור של הקרינה כאשר תאי האפיתל הכלייתי נכרתים. לאחר מכן העבירו בעדינות את החיה לבאר של צלחת 12 עולמות ושטפו אותה שלוש פעמים ב-E שלוש מדיה כדי לשטוף את המתיל תאית. המשיכו להוציא נפרונים עד למילוי 12 המנות הראשונות בעולם.

לאחר מכן להרדים עוד 12 בעלי חיים ולחזור על התהליך. דקסטרה פיצי הוזרק כדי לסמן באופן מועדף את הצינורית הפרוקסימלית. שלושה ימים לאחר ההפריה והנפרון של כל בעל חיים עבר כריתה בלייזר.

יום אחד לאחר האבלציה. התחדשות אינה ניכרת ארבעה ימים לאחר האבלציה, אולם התחדשות התרחשה לאחר אבלציה של תאים במקום השני. הכלאה שימשה לניתוח שינויים בדגימות קבועות בנקודות זמן בודדות.

עובר זה לא עבר אבלציה. לעומת זאת, לעובר זה הייתה רצועה גדולה של אפיתל צינורי שהוסר, ולעובר זה היה מרווח קצר של אפיתל צינורי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הכלאה של הול הר סיטו על מנת לענות על שאלות נוספות כמו זהות השינויים בביטוי הגנים במהלך התחדשות הנפרון.

אל תשכח שעבודה עם כימיקלים עלולה להיות מסוכנת ביותר. אמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי כמו מעיל מעבדה וכפפות מומלצים במהלך הליך זה.