אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה
29 באוגוסט 2011
נזק כלייתי אקוטי (AKI) בבני אדם היא בעיה קלינית נפוצה נגרמת על ידי נזק לתאי האפיתל המרכיבים nephrons כליות, AKI קשור עם שיעורי תמותה גבוהים של 5-70% 1. לאחר חורבן תא אפיתל, nephrons יש יכולת מוגבלת להתחדש, אם כי המנגנונים והמגבלות המנחים את התופעה הזאת להישאר ממעטים להבין. במאמר זה וידאו, אנחנו מתארים את הטכניקה שלנו אבלציה לייזר ממוקד של תאים נפרון כליה כליות העובר דג הזברה, או כלית ראשית. השיטה החדשה שלנו יכול לשמש כדי להשלים nephrotoxicity-Induced דגמים של AKI ולהשיג הבנה ברזולוציה גבוהה של התא ואת השינויים המולקולריים הקשורים התחדשות אפיתל ב נפרון את הכליה.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע סימון ממוקד של תאי כליה בכליה העוברית של דגי הזברה, הפרונפרוס (pro nephros), במטרה ללמוד על התחדשות אפיתליום הכליה בעקבות פגיעה כלייתית חריפה. הדבר משיג תחילה על ידי מיקרו-הזרקה של תצמידי דקסטראן פלואורסצנטיים לעוברי זברה. במהלך דגירה למשך לילה, התצמידים נספגים באופן סלקטיבי על ידי תאי הפרוקסימלי של הנפרון.
ביום למחרת, התאים נבחנים תחת פלואורסצנציית epi ותאים נבחרים מועברים אבלציה באמצעות מערכת לייזר פולסית. בהמשך, שינויים מורפולוגיים ומולקולריים מוערכים באמצעות היסטולוגיה, כלאבונמיזציה (whole mounting) של C two hybridization ואימונוהיסטוכימיה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון השראת פגיעה חריפה בכליות באמצעות האנטיביוטיקה נפרוטוקסית gentamicin, הוא שטיפולים כאלה גורמים לנזק קטסטרופלי והם קטלניים, מה שמונע את ניתוח אירועי הרגנרציה הכלית לאורך זמן.
שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הכליות, כגון זיהוי אירועי איתות מולקולריים המתרחשים במהלך התחדשות אפיתליאלית. הרעיון לטכניקה זו עלה לראשונה כאשר ביקשנו לפתח ניתוח מפורט של התחדשות אפיתליאלית כלייתית בצלחות פטרי. אספו עוברי zebrafish מופרות בתמיסת E3 משונה ללא מתילן כחול.
גדלו את העוברים המופרות בטמפרטורה של 28.5 °C עד שיהיו בין 48 ל-55 שעות לאחר ההפריה, כאשר מערכת השתן של העובר כבר החלה לתפקד. לפני תחילת ההזרקות, הכינו עץ הזרקה עבור העוברים באמצעות תבנית בעלת שקעים משולשים להחזקת העוברים. לאחר מכן, הכינו מחטי מיקרו-הזרקה סטנדרטיות ותמיסת הזרקה לסיומנם של הרכיבים הפרוקסימליים של הרכיב ה tubular. התחילו את הניסוי בהכנת העוברים.
ראשית, הסירו את ה-Corian מביצים שטרם בקעו באמצעות פינצטה עדינה. לאחר מכן, שטפו את שאריות ה-Corian ואת השאריות מתוך פטרי dish ומלאו מחדש את הצלחת ב-30 milliliters של תמיסת E three משופרת. שנית, הרדימו את הזחליים באמצעות 5 milliliters של trica.
וודאו שהזחלים מושפעים מההרדמה באופן מלא על ידי בדיקה של תגובה למגע. אם הם אינם מורדמים לחלוטין, הם ירעדו במהלך ההזרקה. שלישי, בעזרת פיפט העברה מפלסטיק, הניחו את הזחלים בתבנית.
מקמו את בעלי החיים כך שראשיהם יהיו בחלק העמוק ביותר של השקע וגופם לאורך דופן הבאר. כעת המשיכו בהזרקות מיקרו-אינטרא-מוסקולריות (תוך-שריריות) על ידי טעינת מחט מוכנה עם שני עד שלושה µL של dextran fluoresce; מקמו את המחט והזריקו כ-1 nL של תמיסה לתוך גוף כל בעל חיים. תאי ה-dextran conjugates נבלעים בקלות בתהליך אנדוציטוזה על ידי התובה הפרוקסימלית של הנפרון, מה שמאפשר סימון מועדף של אוכלוסיית תאי אפיתל זו.
כוון לחלק העליון של הסומייט והימנע ממעטפת חלמון הביצה (yolk sac extension), אחרת צינוריות הנפרון ייפגעו, כפי שניתן לראות בבעל החיים המוזרק באופן שגוי זה. לאחר הזרקת הזחלים, העבר אותם לצלחית פטרי נקייה ושטוף אותם שלוש פעמים במצע E3 טרי כדי להסיר את כל שאריות ה-tricine. כעת, כסה את המכסה בנייר אלומיניום והדגר את בעלי החיים למשך הלילה בטמפרטורה של 28 °C.
לפני תחילת הליך זה, הכינו מצע לקיבוע (Im mobilization media), שמרו חלק מהמנות לשימוש מיידי בטמפרטורת החדר ואת שאר המנות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. התחילו בהרדמת זחלי דגי זברה באמצעות 5 mL של trica ב-30 mL של E3. כפי שנעשה קודם לכן, ודאו כי הדגים אינם מגיבים לגירוי מגע.
כעת בחנו את בעלי החיים המוזרקים תחת פלואורסצנציה כדי לבחור זחלים עם צינורות פרוקסימליים הנראים בבירור. העבירו עד 12 זחלים לצלחית חדשה המכילה את אותו ריכוז של trica תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה תרכוב המצויד במסנן fitzy, תאור שדה בהיר ולייזר לביצוע הפעולה. את תהליך האבלציה יזמים על ידי העברה והרדמה של הזחלים לצלחית המכילה מדיום לקיבוע.
המתינו שתי דקות, ולאחר מכן העבירו את הזחול לפסייד זכוכית בעל שקע המכיל טיפה של מדיום קיבוע. מקמו בעדינות את בעל החיים כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה באמצעות מיקרו-פרוב, והתמקדו בצד הגבי. כעת, בעזרת מערכת לייזר מיקרו-נקודתי פועם מכוילת, בצעו אבלציה של אחד הנפרונים והשאירו את השני ללא פגע כביקורת.
ניתן יהיה לראות פיזור של הפלואורסצנציה בעת השמדת התאים האפיטלייאליים הכליתיים. לאחר מכן, העבירו בעדינות את בעל החיים לבאר בצלחת 12-well ושטפו אותו שלוש פעמים במצע E3 כדי להסיר את המתיל-צלולוז. המשיכו להשמיד נפרונים עד למילוי הצלחת הראשונה.
לאחר מכן, הרדימו 12 בעלי חיים נוספים וחזרו על התהליך. Dextra Fitzy הוזרק כדי לסמן באופן סלקטיבי את הת سراת הפרוקסימלית. שלושה ימים לאחר ההפריה, בוצע ablating בלייזר של הנפרון בכל בעל חיים.
יום אחד לאחר אבלציה. ארבעה ימים לאחר האבלציה התחדשות אינה ניכרת, עם זאת, התחדשות התרחשה בעקבות אבלציה של תאים ב-in situ two. היברידיזציה שימשה לניתוח שינויים בדגימות מקובעות בנקודות זמן בודדות.
עובר זה לא הוכפף לאבלאציה. לעומת זאת, בעובר זה הסרה (אבלאציה) בוצעה למקטע גדול של אפיתל צינורי, ובעובר זה הוסרהה מקטע קצר של אפיתל צינורי. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון היברידיזציה בסיטוא (in situ hybridization) של העובר כולו (whole mount), כדי לענות על שאלות נוספות, כגון זהות השינויים בביטוי הגנים במהלך התחדשות הנפרון.
זכרו כי עבודה עם כימיקלים עלולה להיות מסוכנת ביותר. במהלך הליך זה מומלץ לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מיגון אישי הכולל חלוק מעבדה וכפפות.
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה חדשנית לחקר התחדשות תאי אפיתל כלייתיים בעקבות פגיעה כלייתית חריפה (AKI), באמצעות אבלציה ממוקדת בלייזר בעוברים של דגי זברפיש. השיטה מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של שינויים תאיים ומולקולריים במהלך התחדשות הנפרונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- נפרולוגיה
- רפואה רגנרטיבית
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- פגיעה כלייתית חריפה (AKI) היא בעיה קלינית משמעותית עם שיעורי תמותה גבוהים.
- לנפרונים יש יכולת התחדשות מוגבלת לאחר פגיעה בתאים אפיתליאליים.
- הבנת מנגנוני ההתחדשות חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
- מודלים קיימים גורמים לעיתים קרובות לנזק קטסטרופלי, המעכב את ניתוח ההתחדשות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לאבלציה ממוקדת של תאי נפרון בעוברים של דגי זברה.
- חקר תהליך ההתחדשות של תאי אפיתל כלייתיים לאחר AKI.
- זיהוי אירועי סיגנל מולקולריים המעורבים בהתחדשות האפיתל.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרו-הזרקה של עוברים של zebrafish עם תמצית דקסטראן פלואורסצנטית.
- השמדה בלייזר (Laser ablation) של תאי נפרון נבחרים באמצעות מערכת לייזר פולסיבית.
- הערכה של שינויים מורפולוגיים ומולקולריים באמצעות היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה.
- ניתוח של שינויים בביטוי גנים במהלך התחדשות הנפרון.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של תאי פרוקסימליים בצינור הכליות לצורך אבלציה ממוקדת.
- נצפתה רגנרציה של תאי נפרון בעקבות אבלציה בלייזר.
- ניתוח היסטולוגי חשף שינויים משמעותיים בביטוי גנים לאחר האבלציה.
- השיטה מאפשרת תצפית בזמן אמת על תהליכי רגנרציה.
מסקנות
- טכניקת אבלציה בלייזר ממוקדת היא כלי בעל ערך לחקר התחדשות הכליות.
- שיטה זו מתגברת על מגבלות של מודלים נפרוטוקסיים מסורתיים.
- התובנות שיירכשו עשויות להנחות גישות טיפוליות עתידיות עבור AKI.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אבלציה ממוקדת בלייזר בpronephros של זבבור (zebrafish) מאפשרת חקירה מדויקת של מנגנוני התחדשות של אפיתל הכליות, ובכך נותנת מענה לפער קריטי במחקר של פגיעה כלייתית חריפה (AKI). גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לפגיעה מבוקרת וניתוח בזמן אמת של תגובות התחדשות. השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ומספקת מידע לקבלת החלטות לגבי פורטפוליו של פיתוח טיפולים כלייתיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה מדויקת של היפותזות רגנרטיביות במודל חוליתרשמר.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות אפיתליאליות כלייתיות לאחר פגיעה.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד אוכלוסיות תאים ספציפיות לצורך אבלציה.
- משפר את הביטחון החזוי עבור תוכניות להבאת תרופות כלייתיות בשלבים מאוחרים יותר.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מבסס מודל פגיעה הניתן לשחזור לצורך הערכה כמותית של יכולת הרגנרציה.
- מאפשר סטנדרטיזציה של היקף הפגיעה ומיקומה להבטחת עקביות הבדיקה.
- מייצר תוצרים חסונים וכמותיים להערכת התערבויות מועמדות.
- מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת משנים גנטיים או פרמקולוגיים של הרגנרציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מנגנונים רלוונטיים למחלה שנצפו ב-AKI אנושי.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מסלולי רגנרציה.
- תומך בהתקדמות מותאמת סיכונים על ידי הבהרת הפוטנציאל הרגנרטיבי in vivo.
- מציע מערכת ניתנת לניהול לגילוי סמנים ביולוגיים הקשורים לתיקון אפיתל.
שילוב זרימה ותהליכי עבודה
שיטה זו משתלבת בשלבים המוקדמים של הגילוי ותיקוף המטרה, ומגשרת למחקר פרה-קליני על ידי מתן אפשרות למחקרי פגיעה והתחדשות מבוקרים במודל של חולייתנים.
- ביולוגיית גילוי: תומכת בבדיקה מבוססת-השערות של מנגנוני התחדשות כלייתית ובבירור של מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת מודל פגיעה סטנדרטי וניתן לשחזור לצורך פיתוח בדיקות כמותיות.
- אנליטיקה: מספקת תוצרים מדידים, כגון שינויים מורפולוגיים ומולקולריים לאחר אבלציה.
- מחקר תרגומי: מקלה על ההלימה לפיזיולוגיה הפתולוגית של AKI בבני אדם ותגובות התחדשותיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה הניתנת להתאמה למערכות איברים אחרים ולהקשרי התחדשות נוספים בדגי zebrafish.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי התחדשות כלייתית.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, את השחזוריות ואת יכולת ההרחבה (scalability) של בדיקות פגיעה והתחדשות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי הבהרה מוקדמת של מנגנוני התחדשות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות כלייתיות ואסטרטגיות טיפוליות בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בדגי zebrafish, מיקרו-הזרקה וטכניקות של ablating בלייזר.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ולמכשור לייזר פולסתי.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית להשראת פגיעה ומדידת תוצאות.
- ניתן להתאימו למערכות איברים אחרות ב-zebrafish באמצעות ביצוע שינויים בפרוטוקול.
- מוגבל לשלבי זחלה שקופים לצורך דימוי אופטימלי ודיוק ב-ablation.
