Name: ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 15 s
Description: למדו ניתוח זרימה cytometry של תאים חיסוניים באאורטה ובאדוונטיציה של עכברים. שיטה זו מאפשרת אפיון פנוטיפי מפורט של לויקוציטים ותומכת במחקר מחלות לב וכלי דם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק: PO1 HL55798 (כדי KL) ו - American Heart Association המדען פיתוח גרנט 0525532U (אל למשל).

<ol><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-2341 (2000).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammatory+mechanisms+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis.</a> Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).</li>
<li>Hansson, G. K., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+in+atherosclerosis%3A+a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword.</a> Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+influx+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Leukocyte influx in atherosclerosis.</a> Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).</li>
<li>Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+atherosclerotic+plaque+cells+from+human+carotids%3A+a+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study.</a> Cytometry. 39, 158-165 (2000).</li>
<li>Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+macrophage-derived+foam+cells+from+human+atherosclerotic+lesions+by+using+a+%22mock%22+FL3+channel+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry.</a> Cytometry. 29, 155-164 (1997).</li>
<li>Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).</li>
<li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li>
<li>Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+interleukin-17A+results+in+reduced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circulation. 121, 1746-1755 (2010).</li>
<li>Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17+and+interferon-gamma+are+produced+concomitantly+by+human+coronary+artery-infiltrating+T+cells+and+act+synergistically+on+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells.</a> Circulation. 119, 1424-1432 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כאן, אנו מציגים שיטה זרימה cytometry מבוססי לחקירה של הרכב של תא החיסון aortas Murine. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לנתח תאים חיסוניים אבי העורקים בכל הרמות תא בודד כדי לאפיין את מצב ההפעלה של לויקוציטים אבי העורקים. שיטה זו אינה מוגבלת aortas Murine ואנחנו (נתונים שלא פורסמו) ועוד 10 השתמשו בגישה זו כדי לנתח דגימות אנושיות כגון עורק השד הפנימי, שסתומי העורקים ואת העורקים הכליליים. מגבלה אחת של שיטה זו הוא המספר הנמוך יחסית של לויקוציטים אבי העורקים Murine התאושש...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר </td><td> מספר קטלוגי </td><td> חברה </td></tr><tr><td> Collagenase XI </td><td> C7657 </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> H3506 </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> DNase אני, סוג 2 </td><td> D4527 </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> אני collagenase </td><td> C0130 </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> Collagenase II </td><td> LS004174 </td><td> וורטינגטון ביוכימיים Corporation </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> LS002292 </td><td> וורטינגטון ביוכימיים Corporation </td></tr></tbody></table>

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך aortas murine

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

טרשת עורקים היא תהליך דלקתי כרוני של כלי גודל בינוניים וגדולים אשר מאופיין על ידי היווצרות של פלאק המורכב תאים קצף, תאים של מערכת החיסון, כלי הדם לתאי השריר אנדותל וחלק, טסיות דם, תאי מטריקס, וגרעין שומנים עשירים עם נמק נרחב סיסטיק של הרקמות הסובבות. 1 נשק מולד אדפטיבית של התגובה החיסונית מעורבים בפיתוח ייזום, והתמדה של טרשת עורקים. 2, 3 יש גוף משמעותי של ראיות תת שונים של תאים חיסוניים, כגון מקרופאגים, דנדריטים תאים לימפוציטים מסוג T ו-B, נמצאים בתוך aortas של עכברים בריאים טרשת עורקים נוטה 4. בנוסף, תאים של מערכת החיסון נמצאים adventitia אבי העורקים המקיפים אשר טוען תפקיד חשוב של רקמת זה atherogenesis 2. במשך זמן מה, גילוי כמותי של סוגים שונים של תאים חיסוניים, מצב ההפעלה שלהם, את ההרכב התאי בתוך הקיר אבי העורקים היה מוגבל על ידי RT-PCR ושיטות immunohistochemical למחקר של טרשת עורקים. ניסיונות נעשו כדי לבצע cytometry זרימה באמצעות aortas האדם, מספר בעיות, כגון autofluorescence גבוה, דווחו 5,6. פלאק טרשת עורקים האדם היו מתעכל עם collagenase 1, ותאי חינם נאספו מוכתם עבור CD14 + / + CD11c להדגיש macrophage הנגזרות תאים קצף. במחקר זה, ערוץ &quot;מדומה&quot; שימש כדי למנוע חיוביות שגויות מכתים. 6 חומרי נקרוטי המצטבר במהלך תהליך העיכול להצמיח כמות גדולה של פסולת שיוצר autofluorescence גבוהה בדגימות אבי העורקים. כדי לפתור בעיה זו, פאנל של בקרות שלילי וחיובי הוצע, אבל רק מכתים כפול יכול להיות מיושם בדגימות אלה. פיתחנו תזרים חדש cytometry מבוססי שיטה 7 לנתח את ההרכב תא החיסון ולאפיין את ההפעלה, ההפצה, התמיינות של תאים חיסוניים באבי העורקים בריא טרשת עורקים נוטה. שיטה זו מאפשרת את החקירה של הרכב תא החיסון של הקיר אבי העורקים ופותחת אפשרויות לשימוש מגוון רחב של שיטות אימונולוגיות לחקירות היבטים החיסונית של מחלה זו.

מאמר זה מציג cytometry מבוססי זרימת שיטה לחקור את הרכב החיסון של aortas. העיתון גם מדגים טכניקה נוספת המאפשרת לבחון adventitia שמסביב קיר כלי בנפרד. שיטה זו פותחת אפשרויות לבצע ניתוחים phenotypical של לויקוציטים אבי העורקים וליישם מבחני החיסונית מספר מחקרים טרשת עורקים.

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

טרשכליות (Atherosclerosis) היא תהליך דלקתי כרוני של כלי דם בינוניים וגדולים, המאופיין ביצירת פלאקים המורכבים מתאי קצף...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לאפיין את ההרכב והפנוטיפ של לוקוציטים חודרים בעורק האורטיה ובשכבת האדוונטיציה באמצעות ציטומטריה של זרימה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד של אורטיה עם טרשעות כשלב שני. השכבה הסובבת, האדוונטיציה, מבודלת מהאורטיה, ומתכוננים תרחיפי תאים בודדים משני הרקמות.בשלב הבא, התKבלו תרחיפי תאים בודדים של לוקוציטים המסומנים פלואורסצנטית להבחנה בין תתי-אוכלוסיות ספציפיות של לוקוציטים מרקמת האדוונטיה (adventitia) ומהדופן האורטלית; תוצאות אלו מראות את הגמישות של סוגי הלוקוציטים החודרים לאורטה במהלך אתרוגנזה ואת ההיתכנות של בידוד לוקוציטים מרקמת האדוונטיה של האורטה בהתבסס על ניתוח ציטומטרי של תרחיפי תאים בודדים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אימונוהיסטוכימיה, הוא שניתן לבחון ולאפיין פנוטיפית לוקוציטים באמצעות מספר סמנים מאורטה בודדת. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות למתווכים התאיים של הדלקת בפתוגנזה של עטרת העורקים (אתרוסקלרוזיס) והפרעות דלקתיות וסקולריות אחרות.זיהוי לוקוציטים באבי העורקים ואפיון פנוטיפי של מתווכי דלקת קיימים וחדשים יסייעו להבנת המכניזמים של טרשת עורקים. הניחו מבחנה ריקה לאיסוף דם ומבחנה לאיסוף המכילה PBS על קרח. עבור כל אבי עורקים שייאסף, השרו קצרות עכבר שהורגד ב-70%ethanol וקבעו את העכבר למשטח ניתוח באמצעות סרט הדבקה למעבדה.לאחר מכן, בעזרת מזרק המכיל הפרין, שאבו דם מהעכבר באמצעות פנצ'ור של הלב (cardiac puncture). פתחו את חלל הבטן והבית בעזרת מספרי דיסקציה; השתמשו במזרק של 10 milliliter עם מחט במידה 25 gauge כדי לבצע פרפוזיה מלאה של כלי הדם ב-PBS המכיל 2%heparin. לאחר מכן, בצעו דיסקציה והסירו את האיברים הפנימיים, איברי מערכת השתן והמין, הסרעפת והטחול, תוך השארת הכליות, הלב והאאורטה שלמים.וודאו שאין דם בתוך רקמות האורטה. נתקו בזהירות את רקמות השומן ואת קשרי הלימפה הפרא-אאורטליים מהאורטה, תוך השארת האורטה והאדוונטיציה (Adventitia) שלמות. לאחר מכן, אספו את כל האורטה, כולל קשת האורטה והחלקים היורדים, החלק התורי היורד והחלק הבטני.הניחו את האורטה המבודדת במבחנת איסוף עם PBS. הסירו את ה-PBS ממבחנת האיסוף המכילה את האורטה. הוסיפו לאורטה 2.5 milliliters של תמיסת אנזים לעיכול adventitia של האורטה בריכוז one times.לאחר מכן, הדגרו את האורטה עם תמיסת האנזים למשך 10 עד 20 דקות, בטמפרטורה של 37 °C. הוסיפו PBS לצחנית פטרי במהלך ההדגרה.בסיום הדגירה, העבירו בזהירות רבה את האורטה שעברה עיכול חלקי מהתמיסה האנזימטית אל צלחת הפטרי עם ה-PBS. באמצעות שני זוגות של פינצטות קמורות, קלפו את שכבת רקמת האדוונטיה מהאורטה כיחידה אחת.לאחר שהסרה של ה-adventitia הושלמה במלואה, העבירו את ה-adventitia ואת ה-aorta לשפופרות fax נפרדות. לאחר מכן, הוסיפו 2.5 milliliters של תמיסת אנזים לפירוק aorta בריכוז פי 1 ל-aorta ול-adventitia. ניתן לחתוך את ה-aorta לחתיכות קטנות יותר.כדי להקל על העיכול האנזימטי, דגרו את האורטה והאדוונטיציה למשך 30 דקות נוספות ב-37 degrees Celsius. לאחר דגירה זו, הניחו את מבחנות הרקמות של האורטה והאדוונטיציה על קרח. הכינו תרחיפי תאים בודדים מהאורטה ומהאדוונטיציה באמצעות מסנני תאים של 70 micron ובוכנות של מזרקים כדי להפריד את שאריות הרקמה.העבירו את תרחיפי התאים למבחנות פוליפרופילן של 5 mL. השקיעו את התאים על ידי סבב צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-400 ×g בטמפרטורה של 4 °C. השביתו את התאים ב-1 mL של באפר FACS והשתמשו בצבע טריפאן כחול ובמנתר תאים (hemocytometer) כדי לספור את התאים.מכיוון שהטיפול באנזים עשוי להשפיע על ביטוי של אנטיגנים על פני השטח, יש להדגיר חתיכות קטנות של טחול עם או ללא תערובת האנזימים למשך שעה אחת ב-37 °C. לאחר שעה אחת, יש לאשר באמצעות פלואו ציטומטריה את היעדר ההשפעה על ביטוי האנטיגנים על פני השטח בניסוי.סמנו מספר מתאים של מבחנות FACS חדשות עבור קבוצת הניסוי והביקורת. הוסיפו למבחנות מסומנות נפרדות את תערובות הנוגדנים של הניסוי והביקורת עבור האנטיגנים החוץ-תאיים הרצויים. הניחו את מבחנות התערובת על קרח וכסו אותן כדי להגן על הפלואורופורים מאור.בשלב הבא, העבירו מנה של 5 עד 8 כפולות של 10⁵ תאי אאורטה ותאי אדוונטיציה למבחנות ה-fax המתאימות המסומנות מראש. הוסיפו 1 mL של בופר fax לכל מבחנה והשקיעו את התאים באמצעות סנטריפוגה. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) מהתאים שהשקיעו על ידי מזיגה, כדי להבדיל בין תאים חיים למתים.ניתן להשתמש תחילה בערכה לצביעת תאים חיים ומתים הניתנת לקיבוע; הכינו תמיסת live dead בריכוז 1x על ידי הוספת 1 µL של צבע live dead מומס מחדש ל-1 mL של PBS, וערבבו באמצעות וורטקס. לאחר מכן, הוסיפו 100 עד 200 µL של צבע live dead בריכוז 1x למבחנות של הדגימות הניסיוניות והביקורת. לאחר מכן, דגרו את הדגימות עם הצבע בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחשיכה.דגרו את מבחנת הבקרה הבודדת לבדיקת חי/מת (live dead) בטמפרטורה של 56 °C בחשיכה למשך 10 דקות כדי להמית את התאים באמצעות הלם תרמי. לאחר הדגירה, שטפו את כל התאים ב-1 mL של PBS והשקיפו את התאים באמצעות סרכזגה. לאחר מכן, שטפו את התאים על ידי הוספת 1 mL של fax buffer לכל מבחנה.ערבוב המבחנות באמצעות וורטקס ולאחר מכן שקיעת התאים על ידי צנטריפוגה. הסרת הנוזל העליון מהתאים באמצעות דקנטציה. הוספת 100 µL של FC blockin.הוסיפו buffer Fax לכל המבחנות וערבבו בעדינות במכשיר vortex כדי להשהות מחדש את התאים. דגרו את הדגימות במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, שטפו את התאים כפי שבוצע קודם לכן.הסר את ה-SUP natum מהתאים על ידי דקנטציה. הוסף 100 µL של תערובת הנוגדנים המתאימה למבחנות הרלוונטיות. ערבב בעדינות ב-vortex כדי להחזיר לתליה.שסעו את המשקע והדגירו את כל המבחנות למשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, לאחר הצביעה החוץ-תאית שנמשכה 20 עד 30 דקות. שטפו את התאים פעמיים כפי שנעשה קודם לכן, שפכו את הנוזל העליון ושסעו שוב את התאים המשקעים ב-300 µL של 2% Para formaldehyde. העבירו את הדגימות למכשיר ציטומטר זרימה לצורך צביעה. ה-TER 1 19 מדגים כי כלי דם שעברו עיכול, ולא דם פריפריאלי במחזור, הם המקור לרוב הלוקוציטים שנותחו בתליה של תאי האביס (aorta).TER 1 1 9 כסממן חיובי, כדוריות דם אדומות מהוות 18% מהתאים בתליה מייצגת זו של תרחיף תאי אביוט. הדבר מעיד על כך שפחות מ-0.02% מהתאים שבודדו מתרחיפי תאי אביוט נגזרו מהדם; נבחנו ההשפעות של תערובת האנזימים לפירוק האביוט על אנטיגנים של פני השטח של התא. לתערובת האנזימים אין השפעה על הביטוי של CD 45 או CD 19 כפי שניתן לראות כאן, וכן על CD three TCR, alpha beta TCR Gamma delta, ומספר אנטיגנים נוספים של פני השטח שאינם מוצגים בדמות זו.במספר האיורים הבאים, בוצע gating לתאי לוקוציטים חיים חיוביים ל-CD 45 מהאאורטה כדי לקבוע את אחוז תאי ה-T החיוביים לאינטרפרון גמא בתוך מאגר האאורטה של שתי עכברים צעירים עם חסר ב-APOLipoprotein E. כאן, מוצגים פרופילי ה-forward scatter וה-side scatter של אאורטה מייצגת של APOE; כדי לנתח לוקוציטים בלבד, נעשה שימוש באנטיגן הלוקוציטי המשותף CD 45 כדי לבצע gating ללוקוציטים של האאורטה, כפי שניתן לראות כאן. האוכלוסייה הגרנולרית הקטנה לאורך ציר ה-side scatter בפרופיל ה-forward וה-side scatter של לוקוציטים מהאאורטה המוצג באיור זה, מעידה על נוכחות תאים נמקריים ב-gait של הלוקוציטים שלנו; כדי להסיר תאים אלו, נעשה שימוש ב-live dead aqua כדי לבצע gating ללוקוציטים חיוניים, אשר היוו עד 30% מהאוכלוסייה המייצגת המוצגת כאן באיור זה.נוכחותן של תאים קטנים שאינם גרנולריים בפרופיל ה-forward and side scatter של תאים חיים שליליים ל-live dead וחיוביים ל-CD 45 מרמזת כי פרגמנטים תאיים עדיין נמצאים בתוך ה-gate של תאים חיים שליליים ל-live dead וחיוביים ל-CD 45. gate פוליגוני של forward side scatter סורט כדי לכלול בניתוח רק את התאים החיוניים הגדולים יותר, כפי שניתן לראות כאן. בדיקה של אוכלוסיית ה-forward side scatter של תאים חיים שליליים ל-live dead וחיוביים ל-CD 45 עבור TCR Alpha Beta ואינטרפרון גמא מגלה כי 6% מהלוקוציטים החיים באורטה הם תאי T helper one חיוביים ל-TCR alpha beta וחיוביים לאינטרפרון גמא. תוך שימוש בסכימת gating דומה לזו של סדרת האיורים הקודמת, ניתן לראות באיורים הבאים נתוני צביעה תו-תאית מייצגים עבור מקרופאגים חיוביים ל-CD 68 וחיוביים ל-CD 11 B, ותאים חיוביים לאינטרפרון גמא וחיוביים ל-TCR alpha beta, משני עכברים מסוג A P OE null שהוזנו בתזונה מערבית למשך 12 שבועות, כפי שצפוי וכפי שניתן לראות באיור זה.האורטה של עכבר APOE null שהוזן בתזונה מערבית. מרבית הלוקוציטים בתוך האורטה הם מקפאגים, כאשר 40% הם כפולי חיוביים ל-CD 68 ו-CD 11 B. תאים מיאלואידיים אחרים החיוביים ל-CD 11 B מהווים 15% מאוכלוסיית הלוקוציטים באורטה בתוך הטחול של אותו עכבר APOE null שהוזן בתזונה מערבית.7% מהתאים החיוניים ב-SP היו מקרופאגים חיוביים ל-CD 11 B וחיוביים ל-CD 68, ו-10% היו תאים מיאלואידיים אחרים החיוביים ל-CD 11 B. לעומת זאת, בדמות זו של דגימת ביקורת איזוטייפ מייצגת שנצבעה באופן דומה, רק 0.01% מהתאים החיוניים ב-APOE null הם חיוביים באופן שגוי לאיזוטייפ. בנוסף, בתוך 12 שבועות בעכברים APOE null שהוזנו בתזונה מערבית, תאי T helper חיוביים ל-TCR alpha, beta ושליליים own interferon gamma, ותאי TH one המייצרים interferon gamma, מהווים חלק נכבד מאוכלוסיות תאי T המסתננים לאורטה ואלה השוכנים בטחול.כפי שניתן לראות בדמות זו, בדיקה של aov, שבה תאים נצבעו עם בקרת איזוטייפ, מעידה כי רק 0.5% מהתאים החיוביים ל-TCR alpha beta וחיוביים ל-interferon gamma הם חיוביים באופן שגוי ל-interferon gamma. כדי להוכיח את ההיתכנות של בידוד adventitia של אבי העורקים לצורך צביעה בציטומטריה זרימה, מוצגים כאן צביעות נבחרות של לוקוציטים חיוביים ל-CD 45 עבור תרחיפי תאים מרקמת האבי העורקים ומרקמת ה-adventitia. לוקוציטים חיוביים ל-CD 45 חודרים ייצגו כ-18% מתרחיף התאים של ה-adventitia ו-11% מתרחיף התאים של אבי העורקים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור את הרכיבים ואת התאים על קרח ובחושך, אלא אם צוין אחרת.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן הבידוד וההכנה של תרחיפי תאים בודדים מהאאורטה ומהאדוונטיציה של האאורטה לשימוש בניסויי פלואו-ציטומטריה.

flow-cytometry-analysis-of-immune-cells-within-murine-aortas

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים הליכים לכימות ואפיון נגעים טרשת עורקים במודלים של עכברים באמצעות חתך מדויק של סינוס אבי העורקים ואבי העורקים העולה בשילוב עם ניתוח היסטוכימי ואימונוהיסטוכימי.

ניתוח כמותי ואפיון של נגעים טרשת עורקים בסינוס אבי העורקים של העכברים

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורט לזהות ולכמת תת T לימפוציטים תפקודית נוכח בתוך הכליה בעכברים, אבי העורקים ובלוטות לימפה על ידי מכתים תאיים cytometry הזרימה. המודל של יתר לחץ דם הנגרמת אנגיוטנסין II נבחר להסביר, צעד אחר צעד, את הנהלים ואת עקרונות יסוד של cytometry זרימה מכתים תאי.

תאיים מכתים cytometry זרימה לזהות לימפוציטים קבוצות משנה בתוך Murine אבי העורקים, כליות בלוטות לימפה מודל של יתר לחץ דם

מאמר זה מתאר שיטה למדידת alloreactivity באוכלוסייה מעורבת של תאי T באמצעות זרימת הדמית cytometry.

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

מאמר זה מתאר שיטה לניתוח תוכן תא החיסון של רקמת שומן על ידי בידוד של תאים חיסוניים של רקמת שומן וניתוח עוקבות באמצעות cytometry זרימה.

אפיון של תאים חיסוניים בתוך רקמת שומן אנושי באמצעות Cytometry זרימה

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד, לזהות ולכמת תאים חיסוניים המתגוררים במהלך מצב יציב או דלקת שריר הלב של עכברים. הפרוטוקול משלב עיכול אנזימטי ועל מכניים לדור של השעיה תא בודד מסוגל לנתח עוד יותר על ידי cytometry זרימה.

בידוד וזיהוי של תאים חיסוניים Extravascular של הלב

אנו מציעים פרוטוקול מתוקננים כדי לאפיין את ההרכב הסלולר של נגעים טרשת עורקים מאתר בשלב מאוחר, כולל שיטות שיטתית של דיסקציה בעלי חיים, רקמות הטבעה, חלוקתה, מכתים, וניתוח של העורקים brachiocephalic מ atheroprone שריר חלק תא שושלת היוחסין עקיבה עכברים.

ניתוח כמותי של הרכב הסלולר בנגעים טרשת עורקים מתקדמת של שריר חלק תא שושלת היוחסין-עקיבה עכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לצביעת התאים. האנדותל של בית העורקים של העכבר ישירות טכניקה זו שימושית כשאתה לומד את הפנוטיפים הסלולאריים והמולקולריים של תאי האנדותל בדפוסי זרימה שונים ובפיתוח טרשת עורקים.

שימוש בפני הפנים הללו Immunofluorescence כתמים כדי להתבונן בתאי כלי דם אנדותל ישירות

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ציטומיטרי זרימה מפורט ושחזור כדי לזהות מונוציט / מקרופאג ותת-תאים T-ערכות באמצעות שניהם אקסטרה-ותוך תאי כתמים כתמים בתוך הטחול murine, מח עצם, בלוטות הלימפה ורקמות synovial, ניצול מודל כירורגי מבוסס של דלקת מפרקים ניוונית מורין.

ניתוח ציתום זרימה של תת-סטים של תאים חיסוניים בתוך הטחול מורין, מח העצם, בלוטות הלימפה ורקמות Synovial במודל דלקת מפרקים ניוונית

בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור כדי לבודד את האוכלוסיות החיסוניות של מערכת הנשימה murine. אנו מספקים גם שיטה לזיהוי של כל תאי החיסון המולדים והמסתגלים השוכנים בריאות של עכברים בריאים, באמצעות לוח ציטומטריית זרימה מבוסס 9 צבעים.

ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לכימות והתמיינות של לימפוציטים B שריר הלב בהתבסס על מיקומם בחלל התוך-וסקולרי או האנדותל באמצעות ציטומטריה של זרימה.

כימות וניתוח מבוססי ציטומטריה של זרימה של תאי B שריר הלב

למדו ניתוח זרימה cytometry של תאים חיסוניים באאורטה ובאדוונטיציה של עכברים. שיטה זו מאפשרת אפיון פנוטיפי מפורט של לויקוציטים ותומכת במחקר מחלות לב וכלי דם.

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

גלה סרטונים נוספים