Name: זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-25T12:03:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: למד צילום מיקרוסקופיה בזמן אמת של אירועים תת-תאיים בהתפתחות עוברית מוקדמת ב-Caenorhabditis elegans. השיטה משתמשת בחלבונים מסומנים בפלואורסצנציה לצפייה ב-DNA ובאברונים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות במימון המכון הלאומי לבריאות (R15 GM065444-03 ל LB) ואת תוכנית המחקר עירונית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) והמכון הלאומי של סוכרת עיכול מחלות כליה (KO). הפרס NSF (DBI-0923402) מימנה את רכישת מיקרוסקופ LSM700 confocal. אנחנו רוצים גם להודות סיוע כללי הערות מועילות על כתב היד של ד&quot;ר אנדי הזהב. אשראי הולך כולו C. elegans הקהילה שיתוף משאבים, פרוטוקולים, ורעיונות.

1. נמטודות תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את ג המתאימה elegans זן של גנטיקה Caenorhabditis במלאי מרכז (CGC) או מעמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול נמטודות על צלחות אגר NGM seeded עם דשא בקטריאלי OP50 (3). לניתוח של צמיחה זני ה-GFP של 25 ° C מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני הניסוי מיקרוסקופיה שלך, לקחת לפחות 40 L4 הזחלים על גבי צלחות seeded והמקום צלחות של 25 ° C במשך הלילה. תולעים אלה יהיו צעירים לצורך הניסוי. </li></ol> 2. זריקות אם רצוי להציג מבנים כגון lysosomes או המיטוכונדריה, מבוגרים ניתן להזריק עם צבע פלואורסצנטי לפני להדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יבשים רפידות agarose ההזרקה. (זה יכול להיעשות אחת ימים רבים מראש) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן agarose 2% מותכת במים. בעזרת פיפטה פסטר לשים 2 טיפות על coverglass 22X54 מ"מ. מקום אחר coverglass צולבות חכם על גבי הירידה. על מנת להשיג את העובי הנכון, לחץ על coverglass העליון עד קוטר של כרית הוא סביב 1.5 ס"מ. בואו לשבת במשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר coverglass העליון. מייבשים את הפנקס agarose ידי הצבת אותו בתנור 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 או לאפשר לשבת על benchtop לילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Mitotracker או פתרון Lysotracker. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל סוכן ניאון הצפת ביצה. אנו משתמשים בדרך כלל דילול של 1:10 Mitotracker או Lysotracker. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחט להזרקת עשוי זכוכית 1.2 OD נימי. משוך את המחט להזרקת חולץ באמצעות מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet Pastuer משך לגבות למלא את המחט עם צבע מדולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מחט בתא, אור ללא humidified עד לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום הזרקה: הגדרת מיקרוסקופ מחט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מחט הזריקה על מנגנון ההזרקה. המנגנון שלנו היא micromanipulator כונן ישיר Narishige רכוב על הבמה של מיקרוסקופ Nikon TE200 הפוך מצויד יכולת ההדמיה DIC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המחט צינור 1.2 מ"מ מזהה שמחובר וסת הלחץ. או אוויר דחוס או חנקן יכול לשמש מקור לחץ חיצוני. הגדר את הרגולטור כדי 20-25 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2 טיפות של שמן מינרלי כבד (שמן Parafin) על גבי משטח הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את כרית הזרקה אל המיקרוסקופ ולהפחית את המחט לתוך השמן. בדוק כדי לוודא זורם נוזל בחופשיות מן המחט כאשר הלחץ מוחל. החל הלחץ הזרקת ולבחון אם הנוזל זורם החוצה של המחט. אם לא, תצטרך לשבור בעדינות את קצה המחט. המחט ניתן לשבור על ידי נהיגה בעדינות את קצה לתוך קצת קטנה של coverglass שבור מונח על כרית ההזרקה. אחרי המחט זורם, לעבור לשלב הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 1 שעה לפני עוברים צפייה, העברת תולעים בוגרות צעירות לתוך טיפת שמן על משטח הזריקה. לבצע את ההעברה באמצעות מיקרוסקופ לנתח. השתמש חוט פלטינה תולעת לבחור עם קצה מחודד עבור העברת תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדר 3-10 תולעים, כך שהם משקרים ישירות על הנייר. עבור זריקה, זה הכי קל אם התולעים מסודרים במקביל אחד לשני קצת פחות אורך תולעת מזה. לאחר תולעים הן על משטח הזרקת חשוב לעבוד במהירות להשלמת תהליך ההזרקה לפני התולעים להיכחד מן התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverglass עם תולעים לבמה מיקרוסקופ של המיקרוסקופ ההזרקה. פוקוס על החלק המרכזי (rachis) של הצינור אשך דיסטלי. לאחר מכן השתמש micromanipulator להזיז את קצה המחט לתוך המטוס מוקד זהה. הזז את הבמה בצורה אופקית, כך התולעת הוא ניקב ידי המחט. לאחר קצה המחט נמצא בתוך rachis, להפעיל לחץ ולאפשר אשך כדי למלא בתערובת לצבוע. הזרק שתי הזרועות בלוטת המין של תולעים כל על כרית ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, השתמש pipet משך פסטר לספק כ 0.5 מ"ל של הצפת ביצה של תולעים. זה יהיה למנוע מהם מת מהתייבשות ולאפשר להם להתאושש הליך ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התולעים להתאושש במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר בתא, אור ללא humidified. </li></ol></li></ol> 3. Agarose לרפד עבור צפייה בעוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן agarose 2% מותך הצפת ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם pipet פסטר, לשים 3 טיפות agarose מותכת לשקופית מיקרוסקופ נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להחליק בין שתי שקופיות אחרות, כי יש שכבה אחת של תיוג קלטת מכסה אותם. אלה משמשים מפרידי שיבטיחו כרית agarose שלך ​​הוא עובי הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים השקופית השניה מיקרוסקופ נקי בניצב מטה אל טיפות agarose. לחץ כלפי מטה עד השקופית העליונה מוטלת על קלטת משקופיות מדריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני שאתם מוכנים לעלות עוברים להסתכלות, להסיר את החלק העליון. </li></ol>ילדה = "jove_title"&gt; 4. עוברים הרכבה לצפייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תולעים לא היה מוזרק, בצע את שני השלבים הבאים. אחרת לדלג עליהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תולעים בוגרות צעירות מהצלחת כי הוכן יום קודם לכן. אתה אמור להיות מסוגל לראות את העוברים בתוך ומבוגרים צעירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 5-20 תולעים לצלחת NGM unseeded. אפשר התולעים לזחול על הצלחת unseeded במשך כמה דקות, כך התולעים תאבד את רוב החיידקים הוא תקוע איתם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג עוברים צעירים תולעים בוגרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפה 5-20 μl של הצפת ביצה באמצע coverglass 18 2 כוס מ"מ (עובי של 1.5 coverglass עדיפה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר תולעים מהצלחת unseeded או כרית זריקה לתוך ירידה של הצפת ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור תולעים לפתוח עם מחט המזרק 26 מד. גזור לפתוח את תולעת ליד הפות. אתה צריך לראות את העוברים נשפכים מתוך התולעת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר לשקופית מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את השקופית מיקרוסקופ שהוכנה עם כרית agarose ומוריד אותה אל coverglass עם עוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זמן לשגות המורחבת נדרש, להשתמש בווזלין כדי לאטום את הקצוות של coverglass כדי למנוע dessication. </li></ol></li></ol> 5. מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מציאת העובר המתאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להחליק על הבמה מיקרוסקופ. סרוק עם עדשה 10X למצוא עוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למצוא עוברים בשלב מוקדם, לחפש, כי הם עוברים תהליך של השלמת המיוזה אימהית. עוברים meiotic ניתן להבחין מעוברים מאוחר יותר כי הם לא עברו קיצור. (אחרי העוברים סיימו המיוזה, ניתן לראות פער משמעותי בין קרום התא לבין קליפת ביצה בקצה הקדמי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שיש לך זיהה כראוי מבוים העובר, לעבור עדשה ההגדלה גבוה יותר עבור הקלטה של ​​העובר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוגמה זו, אנו עוברים לדמיין המבטאים את mCherry: H2B ו-GFP: החלבונים המתויגים UB. אנו משתמשים LSM700 Zeiss מיקרוסקופ סורק לייזר קונבנציונלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות נאספים באמצעות עדשה 1.4NA 63X. 488 ו 555 לייזרים משמשים עם כוח לייזר מינימלי ולהשיג מקסימלית. מחסנית AZ נאסף כל 10-15 שניות. בהתאם להיקף photobleaching, 30-60 נקודות הזמן נאספים. תמונות Z מחסנית הם התמוטטו לתוך תמונה הקרנה המקסימלי וידאו זמן לשגות הסופי. </li></ol></li></ol> 6. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הפריה כדי מיטוזה ראשונה ב C. elegans. <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Microinjection ההליך. וידאו משלים 1 זמן לשגות הווידאו של ה-GFP:.. כחול היוביקוויטין פלוס Lysotracker בעובר meiotic <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">לחץ כאן כדי להציג את הווידאו.</a>

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833-e833 (2008).</li>
<li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Transgenic+C.+elegans+by+Biolistic+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation.</a> J Vis Exp. (42), e2090-e2090 (2010).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+Caenrohabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Genetics of Caenrohabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Cell division WormBook. Oegema, K., Hyman, A. A. , WormBook. (2006).</li>
<li>McNally, K. L., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+initiates+the+transition+from+anaphase+I+to+metaphase+II+during+female+meiosis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fertilization initiates the transition from anaphase I to metaphase II during female meiosis in C. elegans.</a> Dev Biol. 282, 218-230 (2005).</li>
<li>Sato, K., Sato, M., Audhya, A., Oegema, K., Schweinsberg, P., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+caveolin-1+trafficking+in+the+germ+line+and+embryo+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of caveolin-1 trafficking in the germ line and embryo of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 17, 3085-3094 (2006).</li>
<li>Stitzel, M. L., Pellettieri, J., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+DYRK+Kinase+MBK-2+Marks+Oocyte+Proteins+for+Degradation+in+Response+to+Meiotic+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans DYRK Kinase MBK-2 Marks Oocyte Proteins for Degradation in Response to Meiotic Maturation.</a> Curr Biol. 16, 56-62 (2006).</li>
<li>Schetter, A., Askjaer, P., Piano, F., Mattaj, I., Kemphues, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoporins+NPP-1%2C+NPP-3%2C+NPP-4%2C+NPP-11+and+NPP-13+are+required+for+proper+spindle+orientation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleoporins NPP-1, NPP-3, NPP-4, NPP-11 and NPP-13 are required for proper spindle orientation in C. elegans.</a> Dev. Biol. 289, 360-371 (2006).</li>
<li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1, (2001).</li>
<li>Badrinath, A. S., White, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+patterns+of+mitochondrial+redistribution+in+the+early+lineages+of+Caenorhabditis+elegans+and+Acrobeloides+sp.+PS1146%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Contrasting patterns of mitochondrial redistribution in the early lineages of Caenorhabditis elegans and Acrobeloides sp. PS1146.</a> Dev. Biol. 258, 270-275 (2003).</li>
<li>Johnston, W. L., Krizus, A., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+is+required+for+meiotic+fidelity%2C+polar-body+extrusion+and+polarization+of+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The eggshell is required for meiotic fidelity, polar-body extrusion and polarization of the C. elegans embryo.</a> BMC Biol. 4, 35-35 (2006).</li>
<li>Parry, J. M., Velarde, N. V., Lefkovith, A. J., Zegarek, M. H., Hang, J. S., Ohm, J., Klancer, R., Maruyama, R., Druzhinina, M. K., Grant, B. D., Piano, F., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGG-4+and+EGG-5+Link+Events+of+the+Oocyte-to-Embryo+Transition+with+Meiotic+Progression+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans.</a> Curr Biol. 19, 1752-1757 (2009).</li>
<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75, 2015-2024 (1998).</li>
<li>Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+and+multidimensional+analysis+of+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics.</a> Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לאחר המיזוג עם הזרע, הביצית המופרית עוברת סדרה של אירועים דינמיים. אירועים אלה הופכים את הביצית מתא סטטי יחסית לתוך העובר המתפתח במהירות. באורגניזמים רבים, rearrangements cytoplasmic הן קריטיות לקביעת הקוטביות עובריים לצורך הפעלה ביצה. ג העובר elegans מספק הזדמנות מצוינת להתבוננות האירועים הראשונים של הפעלת ביצה embryogenesis. העובר הוא שקוף ואירועים התפתחותי מוקדם להתרחש מהר יחסית לאחר ההפריה. ג החוקרים elegans יצרו זנים רבים מהונדס שימושי להביע fluorescently חלבונים שכותרתו מעורב בפיתוח מוקדם. שימוש אלו זנים יחד עם RNAi או מוטציות מספק מערכת רבת עוצמה לנתח את המסלולים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות של האורגניזם הרב (5, 6, 7, 8). מאמר זה מציג וידאו גישה מעשית באמצעות כלים אלה וטכניקות לתעד אירועים במהלך embryogenesis בראשית ג elegans. בוגרים ג הביצית elegans הוא נעצר prophase של המיוזה I ו מופרית spermatheca של אנדרוגינוס מבוגר. לאחר ההפריה, הביצית התמורה באמצעות שאר המיוזה I ו-II. בשלבים אלה ניתן לצפות באמצעות H2B היסטון שכותרתו fluorescently (5). במהלך השלמת המיוזה אימהית, ה-DNA הזרע נשאר מרוכז (ראה איור 1). לאחר השלמת המיוזה, ה-DNA אימהי ואבהי הופך decondensed ואת ליצור שתי pronuclei. Pronucleus אימהית נודד לכיוון pronucleus אבהי והם להצטרף יחד ליד מרכז של העובר. מיטוזה מתפתח במהירות אחרי הפגישה pronuclear. כל האירועים הללו מתרחשים פחות משעה. לפיכך, זמן לשגות מיקרוסקופיה של רצף זה של אירועים יכול להתבצע בקלות. ביצוע הטכניקה הזו מחייבת מתקן מסוים culturing נמטודות, כמו גם מיומנויות בסיסיות מיקרוסקופיה בנוסף גישה מיקרוסקופ confocal. הדוגמה המוצג כאן מנצל ג מהונדס זן שמבטא elegans שני חלבונים פלורסנט, GFP: היוביקוויטין ו mCherry: H2B. מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר משמש כדי לצפות לוקליזציה דינמי של שני חלבונים. בנוסף, אנו מראים כי הזרקת Lysotracker שכותרתו fluorescently ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר גורלם של lysosomes העובר לאחר ההפריה. הזרקה של גשש שכותרתה יכול גם להתבצע עבור להדמיה של ריכוזי הסידן במיטוכונדריה או מקומי (9). בתיאוריה, פרוטוקול הזרקת יכול לשמש כדי להציג כל סוג של מולקולה שכותרתו fluorescently בעובר. זה יכול לכלול מולקולות קטנות שכותרתו, חלבונים, שומנים, וכו &#39;במקרים מסוימים, ייתכן שלא יהיה צורך להזריק למעשה עוקבים אחר שכותרתו התולעים ברצון ספיגת כמה צבעים כגון mitotracker (10). עם זאת, ניסינו גם השריית הזרקת lysotracker ומצאו תוצאות טובות הרבה יותר עם הזרקה להדמיה בעוברים. שיקולים טכניים: האתגרים הטכניים בפני הליך זה לכלול את הטכניקה microinjection כמו גם הקושי הדמיה עוברי מוקדם מאוד. לגבי microinjections, עובי משטח הזרקת agarose הוא קריטי עבור זריקות מוצלחות. אם כרית עבה מדי, התולעים dessicate ומתים במהירות. אם כרית היא רזה מדי, התולעים לא ידבק כרית במהלך תהליך ההזרקה. עוברי מוקדם יכולים להיות רגישים לתנאי הסביבה, כגון טמפרטורה ותנאי חיץ. עוברים סוג Wild ליזום decondensation-DNA של הזרע והגירה pronuclear בתוך דקה או שתיים של השלמת המיוזה השנייה (4). בתוך 20 דקות, cytokinesis הראשון צריך להתחיל. אם עוברים נחשפים עוצמת הלייזר גבוהה מאוד או יתר על המידה או כתוש במהלך ההרכבה, תהליך זה עשוי להיות מופרת. עוברים כאלה יעצרו פיתוח. במקרה זה, הניסוי יש לחזור עם כוח לייזר ירידה או משטח עבה agarose. C. elegans עוברי לא מפרישים פגז ביצה שלהם עד זמן קצר לאחר ההפריה. בזמן הקצר שבין ההפריה ואת הפרשת קליפת ביצה, העוברים אינם קיימא מחוץ לאם (11). במעבדות יש להימנע אתגר זה על ידי עוברי הדמיה ברחם (5, 12). ברחם הדמיה מציעה יתרונות מסוימים, כגון היכולת ללכוד האירועים המתרחשים במהלך או מיד לאחר ההפריה. עם זאת, טכניקה זו דורשת שימוש של מערכת מיקרוסקופית המאפשרת הדמיה רקמות עמוק. מערכות כגון שני פוטונים או רב פוטון מתאימים במיוחד בשביל זה (13, 14). בעת שימוש רגיל לייזר סריקה או ספינינג מיקרוסקופ דיסק confocal, את התמונות הטובות ביותר מתקבלים מעוברים כי חהיש נחתך מתוך התולעת הבוגרת כפי שמתואר כאן. הדמיה שיקולי המערכת: סוג של מערכת הדמיה confocal בשימוש תלוי הצרכים של המשתמשים. באופן כללי, סריקת מערכות לייזר מומלץ אם אדם רוצה לרכוש תמונות ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית. מצד שני, מערכות דיסק ספינינג מתאימים יותר עבור תהליכי הדמיה דינמית מאוד כמו רכישת התמונה היא מהירה יחסית photobleaching / phototoxicity מצטמצם. הפרמטרים הדמיה ספציפיות ישתנה בהתאם לעיצוב ניסיוני מערכת הדמיה confocal מועסק. בשנת הדמיה רב ממדית, צריך לשקול את מספר הערוצים, מטוסים מוקד, זמן נקודות נאספים. בשל ההשפעות של הגבלת photobleaching ו phototoxicity, מספר סופי של תמונות ניתן לרכוש בניסוי נתון. לכן, אם תבחר להגדיל את מספר ערוצי להיות נרכשת, סביר להניח שאתה צריך להקטין את מספר מטוסי מוקד ו / או בנקודות זמן ולהיפך. המספר הכולל של תמונות ניתן לרכוש תושפע מעוצמת fluorophore עתה הדמיה כמו גם הרגישות של מיקרוסקופ confocal בשימוש. Fluorophores אינטנסיבי יותר מכשירים רגישים יותר ידרוש זמן חשיפה קצר יותר ובכך לייצר photobleaching פחות phototoxicity. מספר גדול או מערכות הדמיה זמינים. אנו נותנים פרטים על מערכות שהיו בשימוש במעבדות שלנו. עבור עוברי תולעת הדמיה במיקרוסקופ על ידי ספינינג דיסק confocal, אנו משתמשים במיקרוסקופ TE2000U Nikon הפוך מצויד 60X/1.4 NA תוכנית המטרה Apo. המיקרוסקופ מחובר יחידת Yokogawa דיסק CSU10 ספינינג, Hamamatsu C9100 EM-13 מצלמת CCD, וכן Spectral Applied Research LMM5 מודול לייזר למזג ובה ארבע לייזרים של מצב מוצק עם תפוקה ב 405, 491, 561 ו - 655 ננומטר. באמצעות מערכת זו אנו יכולים ללכוד אחד או שני ערוצים, 6-12 מטוסי מוקד, ו - 25-50 timepoints (ב 30-60 במרווחים שנייה). זמן חשיפה טיפוסית 100-200 אלפיות השנייה. עבור עוברי הדמיה עם לייזר מיקרוסקופיית confocal, אנו משתמשים Zeiss LSM700 מצויד 2 ערוצים וארבעה לייזרים של מצב מוצק (405, 488, 555, ו 635 ננומטר). מערכת זו מחוברת מיקרוסקופ Zeiss אובזרוור Axio הפוכה עם מטרה, תוכנית Apo 63X/1.4NA המשמש הדמיה העובר. המערכת משתמשת בתוכנה ZEN Zeiss לרכישת תמונה אשר מספקת גם עיבוד תמונה ניתוח מוגבל. כאשר הדמיה עם שני fluorochromes, אנחנו בדרך כלל מתכנסים 1-5 מטוסים מוקד (~ 0.5 מיקרומטר בנפרד) ואוספת ערמה Z כל 15 שניות. אוספים הם נמשכו עד photobleaching משמעותי התרחש. כדי ליצור את הווידאו הסופי זמן לשגות, תמונות Z מחסנית מאוחדים באמצעות הכלי הקרנת המרבי בתוכנה ZEN. וידאו מיוצאים מהתוכנה כמו קבצי AVI.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הרכב </th></tr><tr><td> ביצה הצפת </td><td></td><td></td><td> PH 7.2 Hepes 5mm, 110mM NaCl, KCl 4mm Acetate, Mg 5mm, CaCl 2 5mm </td></tr><tr><td> Mitotracker </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td><td></td></tr><tr><td> Lysotracker </td><td> Invitrogen </td><td> L-7525 </td><td></td></tr><tr><td> הזרקת נימי Pipet </td><td> הרווארד Apparatus, קנט, בריטניה </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> מחט פולר </td><td> Kopf </td><td> דגם 700C </td><td></td></tr><tr><td> Microinjector Apparatus </td><td> Tritech מחקר </td><td> MINJ-1 microinjection הרגולטור </td><td></td></tr></tbody></table>

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans יש לעתים קרובות שימשו כמודל למערכת במחקרים של תהליכים התפתחותיים מוקדם. השקיפות של העוברים, את המשאבים הגנטי, ואת הקלות היחסית של טרנספורמציה הן תכונות שהופכות ג elegans מודל מצוין embryogenesis מוקדם. לייזר המבוסס על מיקרוסקופיה confocal תגי שכותרתו fluorescently לאפשר לחוקרים לעקוב אחר מבנים הסלולר ספציפי חלבונים העובר המתפתח. לדוגמה, אחד יכול לעקוב אברונים ספציפיים, כגון lysosomes או המיטוכונדריה, באמצעות צבעים שכותרתו fluorescently. צבעים אלה ניתן יהיה להעביר את העובר מוקדם באמצעות microinjection לתוך בלוטת המין המבוגרים. כמו כן, לוקליזציה של חלבונים ספציפיים ניתן בעקבות באמצעות תגי חלבון פלואורסצנטי. דוגמאות מוצגים כאן מפגין את השימוש של צבע lysosomal ניאון, כמו גם חלבונים היסטון ו היוביקוויטין מתויג fluorescently. היסטון שכותרתה משמש כדי להמחיש את ה-DNA ובכך לזהות את שלב של מחזור התא. GFP-tagged היוביקוויטין מגלה את הדינמיקה של שלפוחית ​​ubiquitinated בעובר בשלב מוקדם. תצפיות של lysosomes שכותרתו GFP: היוביקוויטין ניתן להשתמש כדי לקבוע אם יש colocalization בין שלפוחית ​​ואת lysosomes ubiquitinated. טכניקה עבור microinjection של הצבע lysosomal מוצג. טכניקות ליצירת זנים transgenenic מוצגים במקומות אחרים (1, 2). עבור הדמיה, עוברים נחתכים מתוך מבוגר נמטודות אנדרוגינוס ועלה על 2% רפידות agarose ואחריו מיקרוסקופיה זמן לשגות על לייזר רגיל סריקת מיקרוסקופ confocal או מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. מתודולוגיה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של העובר מוקדם.

מאמר זה מתאר טכניקה להדמיה של האירועים הראשונים של העובר בתוך נמטודות<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

*Caenorhabditis elegans* שימשה לעיתים קרובות כמערכת מודל במחקרים של תהליכים התפתחותיים מוקדמים. השקיפות של העובריים, הגנטיקה...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לתעד אירועים תת-תאיים במהלך השלבים המוקדמים של העובר ב-Caenorhabditis elegans. מטרה זו מושגת באמצעות שימוש בזנים טרנסגניים עם חלבונים מרובים המסומנים פלואורסצנטית, המאפשרים ויזואליזציה של DNA וכן של תתי-קבוצות של שלפוחיות. בעובר המוקדם, אברונים ספציפיים מסומנים באמצעות מיקרו-הזרקה של צבעים פלואורסצנטיים, כגון LysoTracker או MitoTracker, אל הגונדה של התולעת הבוגרת. לאחר מכן, עוברים מוצאים מהתולעים הבוגרות ונצפים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להשיג הקלטות time-lapse של תנועות החלבונים המסומנים באברונים.בסופו של דבר, הפרוטוקול חושף תנועה מעניינת של ליזוזומים ושל שלפוחיות המסומנות ב-GFP במהלך ההתפתחות המוקדמת ב-CL allergans. שמי קוני הדג'ר, והיום אראה לכם כיצד אנו מבצעים מיקרוסקופיה של צילום רצף (time-lapse) במעבדה שלנו, מעבדת בוייד באוניברסיטה של אלבמה בהנטסויל. עבור ניסוי זה, גדלו נמטודות על פלטות NGM agri, עם שכבת חיידקי OP 50, בטמפרטורה של 25 °C יום לפני הניסוי; העבירו לפחות 40 לרוות בשלב L4 לפלטות המוזמנות והדגירו אותן למשך הלילה בטמפרטורה של 25 °C.תולעים אלו יהיו בוגרות צעירות עבור הניסוי. הכינו משטח להזרקה על ידי דחיסה של שתי טיפות של 2% agros במים מפיפטה קודמת בין שתי זכוכיות כיסוי, תוך הפעלת לחץ כדי לעצב את ה-agros למעגל בקוטר של 1.5 סנטימטר.הסרו את זכוכית הכיסוי העליונה והתייבשו את הפד על ידי הנחתו בתנור בטמפרטורה של 80 °C למשך שעה אחת, או השאירו אותו על משטח העבודה למשך הלילה. ביום ההזרקה, הכינו תמיסת צבע MIT tracker או lyo tracker מדוללת, וחתכו מחטי הזרקה מקפילרית זכוכית בעלת קוטר חיצוני של 1.2 od. מלאו את המחטים בתמיסת צבע מדוללת ואחסנו אותן בתא לח וחשוך. התקינו מחט הזרקה על המיקרו-מניפולטור וחברו את המחט לווסת לחץ באמצעות צינור בעל קוטר פנימי של 1.2 mm.כעת טפטפו שתי טיפות של שמן מינרלי כבד על פד ההזרקה. הניחו את פד ההזרקה על המיקרוסקופ והורידו את המחט אל תוך השמן. הפעילו לחץ הזרקה ובדקו האם נוזל זורם מהמחט.אם לא, יהיה עליך לשבור בעדינות את קצה המחט על ידי דחיפה מתונה של הקצה לתוך שבב קטן של זכוכית כיסוי שבורה המונחת על פד ההזרקה. לאחר שהזרימה במחט תתחיל, בצע את ההזרקה כשעה לפני בחינת העובריים. השתמש בפיפט להעברת תולעים בוגרות צעירות לתוך טיפת השמן שעל פד ההזרקה.סדרו משלושה עד 10 תולעים במקביל, במרווחים הקטנים מעט מאורך תולעת אחת. בשלב זה חשוב להזריק לתולעים במהירות לפני שיתייבשו. העבירו את הפד עם התולעים אל במה המיקרוסקופ.מקדדו את המוקד על החלק המרכזי של הגונדה הדיסטלית. לאחר מכן, השתמשו במיקרו-מניפולטור כדי להזיז את קצה המחט לאותו מישור מוקד. נקבו את התולעת על ידי הזזת השולחן באופן אופקי.כאשר קצה המחט נמצא בתוך ה-cus, הפעילו לחץ כדי למלא את הגונדה בתערובת הצבע. הגונדה תתרחב בהתאם לנפח ההזרקה. המשיכו בהזרקה.שטפו את זרועות הרשת של כל תולעת לאחר ההזרקה. כסו את התולעות עם 0.5 milliliters של egg buffer שיוחלו באמצעות פיפט פסטור מלוטש, ולאחר מכן אפשרו לתולעות להתאושש במשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר, בתוך תא לח ומוגן מאור.התחילו בהכנת פד agros חדש לצפייה בעוברים המוזרקים באמצעות פפית פסט. הניחו שלוש טיפות של agros מומס על זכוכית כיסוי נקייה, והניחו זכוכית זו בין שתי זכוכית כיסוי אחרות העטופות בשכבה אחת של סרט סימון. השתמשו בסרט דבק כדי לשלוט על עובי הפד.לאחר מכן, לחצו את זכוכית המיקרוסקופ הנקייה כלפי מטה על טיפות ה-agros כך שתנוח על זכוכיות הסרט. אין להסיר את הזכוכית העליונה עד שהעובריים יהיו מוכנים להרכבה. כעת טפטפו 20 µL של תמיסת בופר לביצים למרכז של זכוכית כיסוי והעבירו את התולעים המוזרקות אל הבופר. תחת מיקרוסקופ סטריאו, חתכו את התולעים ליד הוולבה.באמצעות מחט היפודרמית בכיול 26 gauge, העוברים יזרמו החוצה מהתולעת. כעת יש להסיר את השקופית העליונה של שקופית הדימות ולהוריד את פד ה-aros כשהוא הפוך על גבי זכוכית המכסה עם העוברים. אם העוברים יצולמו לאורך פרק זמן ממושך, יש לאטום את קצוות זכוכית המכסה בוזלין כדי למנוע התייבשות.כעת, התחילו בדימות על ידי איתור עוברים תחת עדשה של 10x כדי למצוא עוברים בשלבים מוקדמים; חפשו עוברים הנמצאים בתהליך השלמת המיוזה האימהית. ניתן להבחין בעוברים בשלב המיוזה מעונהו של עוברים בשלבים מאוחרים יותר מכיוון שהם טרם עברו קיצור. לאחר השלמת המיוזה, נוצר מרווח משמעותי בין קרום התא לבין קליפת הביצה בקצה הקדמי של העובר.לאחר זיהוי עובר בשלב התפתחותי מתאים, עברו לעדשה בעלת הגדלה גבוהה יותר כדי להקליט את תהליך embryogenesis. עובר זה מבטא חלבונים המסומנים ב-M cherry histone two B ו-GFP ubiquitin. ה-DNA האימהי והאבהי נראים באמצעות ה-M cherry H two B, ובכך מוצגים שלבי ההתפתחות המוקדמים.עובר זה הוזרק ב-OC Tracker blue ומבטא GFP Ubiquitin. התמונות נאספו באמצעות עדשה של 63 x 1.4 NA עם לייזרים של 488 ו-555 המוגדרים בעוצמה מינימלית ובהגברה מרבית. בדרך כלל, נאספים Z-stacks כל 10 עד 15 שניות למשך עד 60 נקודות זמן לפני שמתרחש פוטובליצ'ינג (photobleaching).עבור סרטון TimeLapse זה, ה-Z stacks הומחאו לתמונות של היטל מקסימלי (maximum projection) במהלך ביצוע המיקרוסקופיה של ה-time-lapse. בעוברים צריכה להתחיל נדידת הפרונוקליאוסי (pronuclear migration) תוך מספר דקות מהשלמת המיוזה השנייה, ובתוך 20 דקות צריכה להתחיל הציטוקינזה הראשונה.אם נצפה עיכוב בהתפתחות העוברים, נסו להפחית את עוצמת הלייזר או להשתמש במצע תמיכה (augurous pad) עבה יותר.

time-lapse-microscopy-of-early-embryogenesis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים

כאן מוצג כיצד לעקוב ולכמת תהליכי התפתחות ב-C. elegans. השיטות המוצגות מבוססות על כלי קוד פתוח הניתנים ליישום בקלות. הוא מודגם כיצד לשחזר מודלים תלת מימדיים בצורת תא, כיצד לעקוב באופן ידני אחר מבנים תת-תאיים וכיצד לנתח זרימת התכווצות קליפת המוח.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

כאן אנו מפרטים פרוטוקולים שתוכננו במיוחד לניטור פגמים מורפוגניים המתרחשים בשלבים מוקדמים ומאוחרים של התארכות עוברית של הנמטודה Caenorhabditis elegans. בסופו של דבר, פרוטוקולים אלה נועדו לזהות גנים המווסתים את השלבים הללו ולאפיין את הדרישות הדיפרנציאליות שלהם לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר.

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת התקן מותאם אישית microfluidic. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים.

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה והרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans , רישום התפתחות תחת מיקרוסקופ 4D ואיתור שושלת תאים.

מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים וכלים להמחשת סידן במהלך הפריה ועובריות מוקדמות באמצעות מדווח סידן מקודד גנטית המתבטא בקו הנבט של נמטודת המודל C. elegans.

הדמיה in vivo של מעברי סידן במהלך הפריה והתפתחות מוקדמת ב - C. elegans

פרוטוקול זה מתאר הדמיית דולג זמן מבוססת מיקרופלואידית על פני כל ההתפתחות הפוסט-עוברית.

הדמיה ברזולוציה גבוהה של C. elegans בכל שלבי הזחל

למד צילום מיקרוסקופיה בזמן אמת של אירועים תת-תאיים בהתפתחות עוברית מוקדמת ב-Caenorhabditis elegans. השיטה משתמשת בחלבונים מסומנים בפלואורסצנציה לצפייה ב-DNA ובאברונים בזמן אמת.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

גלה סרטונים נוספים