Bromodeoxyuridine (BrdU) תיוג ומיון לאחר פלואורסצנטי תא פעיל עבור זיהוי, תרבות עצמאית של פחמן אורגני מומסים משפיל Bacterioplankton

מיקרובים מתווכים את פירוקם של מצעים רבים של פחמן אורגני מומס או תרכובות DOC, כגון בסביבות מימיות. כדי להבין באופן מלא את תפקידם של המיקרובים בטרנספורמציה של DOC, נדרש זיהוי סימולטני של הטקסונומיה והתפקוד שלהם. סרטון זה מדגים פרוצדורה לזיהוי טקסונומי של חיידקים חופשיים או פלנקטון חיידקי המבצעים טרנספורמציה של מאגרים ספציפיים של DOC בסביבות מימיות.

דגימות מים שנאספו מסביבת בדיקה מעובדות ומודגכרות עם תרכובת רצויה ועם ברומו-דאוקסי-יורידין, BRDU, אשר נטמע ב-DNA שסונטז לאחרונה ובתאים הגדלים באופן פעיל. לאחר מכן, פלנקטון חיידקי המסומן ב-BRDU מסומן באמצעות נוגדני anti-BRDU המשולבים עם ZI. פלנקטון חיידקי עם רמות גבוהות של סימון BRDU מבודל באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS).

לאחר מכן מופק DNA מהתאים הממוינים, וזיהוי טקסונומי מבוצע על בסיס תוצאות של אנליזת הגן 16 s ribosomal RNA באמצעות PCR. שלום, שמי סטיבן רובינס מהמעבדה של ד"ר Chen Mao במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת Kent State. היום אני ו-lu נדגים לכם שיטה ללא תרבית לזיהוי פלנקטון חיידקי המפרק DOC בסביבות מימיות.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תיסוף רכיבי תזונה ולאחריו ניתוח של DNA של קהילת החיידקים, הוא שהיא ממקדת את הניתוח בחיידקים פעילים מאוד ומסירה תאים רדומים או בעלי קצב גדילה איטי. אנו מראים כאן זיהוי של פלנקטון חיידקי המשתמש בתרכובת DOC ספציפית אחת. עם זאת, ניתן ליישם שיטה זו גם כדי לחקור פלנקטון חיידקי המשתמש בתרכובת DOC בודדת אחרת או בקבוצה של DLCs, כגון הפרשות של אצות.

אם כן, נבצע דגימת מים ונתחיל. לפני ביצוע בדיקה של דגימות מים עבור פלנקטון בקטריאלי המפרק DOC, יש לעבד את דגימות המים באופן מתאים. הדגימות המוצגות כאן נאספו מחופי ג'ורגיה כדי להסיר חלקיקים גדולים ו-ER VREs מדגימת המים.

השתמש במשאבה פריסטלטית כדי להעביר מים ממיכל האיסוף ליחידת סינון בעלת מסנן עם גודל נקבוביות של 1 µm. לאחר מכן, העבר מנות של 36 mL מהתסנין לשלוש מבחנות פוליפרופילן סטריליות בנפח 50 mL. כל מבחנה צריכה להכיל 4 mL של תמיסת 10% Paraformaldehyde שהוכנה טרייה. הדגר למשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי לשמר את התאים לאחר ההדגרה.

שפכו את המים לתוך מגדל הסינון של יחידת סינון בוואקום מזכוכית עם מסנני ממברנה לבנים בעלי גודל נקבים של 0.22 micrometer והפעילו ואקום כדי לשאוב את התמיסה דרכם. שטפו את המסנן על ידי העברת 10 milliliters של PBS דרך מסנן הוואקום. סמנו את המסננים כביקורות שליליות ואחסנו אותם בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.

כדי להקים מערכת אקולוגית ניסויית או מיקרוקוסמוס, התחילו במילוי של שישה בקבוקי זכוכית של ליטר אחד, שנשטפו מראש, ב-800 milliliters של דגימת המים שעברה סינון מוקדם. הוסיפו BRDU לכל מיקרוקוסמוס עד לריכוז סופי של 10 micromolar. סובבו את הבקבוק במהירות ביד כדי לערבב.

כל דגימה תיבדק בשלוש חזרות. לכן, לשלושה מהמיקרוקוסמוסים, יש להוסיף את תרכובת ה-DOC המודלית. כאן, ה-reine מתווסף למיקרוקוסמוסים בריכוז סופי של 100 nanomolar.

לאחר מכן, הוסיפו PBS סטרילי לשלושת המיקרוקוסמוסים האחרים. אלו ישמשו כביקורות ללא DOC. הניחו את כל המיקרוקוסמוסים באינקובטור עם ניעור במהירות של 100 RPM, בחשכה ובטמפרטורה המקומית (insitu), שהיא 25 °C. דגמיות יילקחו בנקודות זמן של 0, 8, 16 ו-24 שעות.

אסוף 36 מיליליטר מכל מיקרוקוסמוס לשפופרת פוליפרופילן סטרילית בנפח 50 מיליליטר המכילה ארבעה מיליליטר של 10% paraform aldehyde טרי; הדגר למשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי לקבע את התאים. לאחר מכן, סנן את התאים המשומרים דרך מסנני ממברנה לבנים בעלי גודל נקבים של 0.22 מיקרומטר. העבר 10 מיליליטר PBS דרך מסנן הוואקום כדי לשטוף את שאריות ה-PFA.

עברו מיד לזיהוי אימונו-סיטואציה של INS או שמרו את המסננים בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס לצורך בדיקת שילוב BRDU בפלנקטון חיידקי. התחילו בטיפול במסנני הדגימות בטמפרטורת החדר כדי לפגוע בדופן התא החיידקי. הניחו את המסנן על יחידת סינון, ולאחר מכן טפטפו באמצעות פיפטה 1 mL של תמיסת ליסוזיים על המסנן כדי לכסות את התאים והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר האינקובציה, השתמש בוואקום כדי להסיר את התמיסה. ברגע שהתמיסה עוברת דרך המסנן, שטוף את התאים על ידי הוספת 10 milliliters של PBS והפעל ואקום. לאחר מכן, כדי לפגוע עוד יותר בדופן התא, הוסף למסנן מיליליטר אחד של תמיסת proteinase K כך שתכסה את התאים.

דגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו עם PBS כדי להפיק שכבות DNA בודדות. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת exonuclease כדי לכסות את התאים שעל המסנן.

דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את המסנן על ידי העברת 10 milliliters של PBS דרך מסנן הוואקום. לאחר מכן, גזרו את קצוות המסנן כדי להסיר את החלק שאינו מכיל תאים.

לאחר מכן, על משטח יבש שנוקה באלכוהול, השתמשו בלהב סטרילי כדי לחתוך את המסנן לשמונה חלקים שווים בגודלם. נדרשות שמונה תאי דגירה עם אטם מסגרת עבור כל דגימה; הניחו שמינית מהמסנן לתוך תא הדגירה המורכב עם אטם המסגרת, כאשר צד הדגימה פונה כלפי מעלה. לאחר הרכבת התאים, השתמשו בערכת Roche Intu cell proliferation kit כדי לזהות תאים מסומנים ב-A-B-R-D-U in situ.

עם סיום הפרוצדורות המקובעות, הוצא את מקטע המסנן מתא האינקובציה והנח אותו על משטח סטרילי. בעזרת להב סטרילי, חתוך את מקטע המסנן לחתיכות קטנות. העבר את חתיכות המסנן לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 2 ml המכילה 1 ml PBS, סגור את השפופרת היטב ואטום אותה עם פאראפילם. לאחר מכן, הדגר את השפופרת באינקובטור נער בטמפרטורה של 37 °C ובמהירות של 200 RPM למשך 10 דקות.

לאחר הדגירה, סגור את המבחנה וערבב אותה בוורטקס במהירות מרבית. במשך חמש דקות, העבר בעזרת פיפט את הנוזל העליון (SUP natant) למבחנה סטרילית מפוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר. לאחר מכן, השב את המסנן לתוך PBS וחזור על שלבי הוורטקס והדגירה פעמיים נוספות, ובכל פעם הוסף את הנוזל העליון לאותה מבחנה של 15 מיליליטר עבור כל דגימה.

יש לאחסן את התאים לאחר התליה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. יש לנתח את הדגימה באמצעות fax בתוך יומיים. לבסוף, יש לבצע מיון תאים כדי להשיג את האוכלוסייה בעלת רמה גבוהה של שילוב BRDU.

בניסוי זה נעשה שימוש בציטומטר זרימה מסוג BD FACS ובתכנה התואמת. לאחר מיון התאים, ניתן לבצע בדיקה של האוכלוסייה המועשרת ב-BRDU כדי לקבוע את זהותה הטקסונומית. כדי להגביר את גני ה-16s ribosomal RNA של החיידקים שמוינו באמצעות PCR, העברו בעזרת פפיטה את התאים הממוינים למסנן ממברנה פוליקרבונטית לבנה בעלת נקבוביות של 0.22 µm, והפעילו את משאבת הוואקום. בעזרת להב סטרילי, הסִירו את הקצוות נטולי התאים של המסנן.

חתוך את המסנן לארבעה חלקים שווים עבור כל תנאי, והנח חלק מסנן אחד בכל אחת משלוש מבחנות תגובת PCR, כאשר התאים פונים פנימה אל תוך המבחנה. הוסף 45 µL מים בדרגת PCR. השאר את חלק המסנן טבול לחלוטין במים.

בשלב הבא, הוסיפו שני כדוריות PCR מסוג Roche illustra pure T ready to go ובצעו ערבוב קצר ב-vortex כדי לסייע בהמסת הכדוריות. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של כל אחד מהפריימרים forward ו-reverse לגן ה-16 s ribosomal RNA.

הוסיפו מיקרוליטר אחד של BSA כדי לסייע בספיחת מעכבי הגברה, או מיקרוליטר אחד של מים. בצעו הגברת PCR במכשיר thermal cycler. מומלץ להשתמש בתוכנית touchdown PCR, שבה טמפרטורת ההתחלה (annealing) יורדת באופן רציף מ-62 ל-52 °C בצעדים של מעלה אחת לכל מחזור, ולאחריה 15 מחזורים ב-52 °C.

יש לאשר את הגברת ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז בריכוז 1% שנצבע בברומיד, לחתוך את תוצרי ה-PCR מהג'ל ולנקות אותם באמצעות ערכה למיצוי מהיר מג'ל של KaiGen cayo. לאחר טיהור תוצרי ה-PCR מהג'ל, יש לאחד את התוצרים מאותה דגימה. תוצרי DNA ריבוסומלי 16s מטוהרים מוכנים כעת למספר ניתוחים מולקולריים.

דגימות נאספו מאתר חופי בג'ורג'יה ועובדו כדי לחקור חיידקים מפרקי Racine בהתאם לנהלים המתוארים בסרטון זה. Racine הוא תרכוב פוליאמורי שניתן למצוא באופן נפוץ בסביבות ימיות. הוא יכול לשמש כמקור להזנה ואנרגיה עבור חיידקים ימיים, כפי שמוצג כאן.

ניתוח נתונים של הדגימות גילה כי לאחר דגירה של 24 שעות, התפתחה במיקרוקוסמוסים המתוקנים ב-Racine קבוצת חיידקים בעלת עוצמת פלואורסצנציית FXI גבוהה יותר, שהייתה קשורה באופן חיובי להיקף ההטמעה של BRDU. תאים אלה הוגדרו כתאי הטמעת BRDU גבוהה או HI, והם היו אמורים להכיל בעיקר חיידקים המפרקים Racine. לא נמצאו תאי hi.

תאים נמצאו בביקורות ללא תוספת, אשר הכילו תאים בלבד עם רמות נמוכות יותר של השתלבות BRDU, שהוגדרו כתאי lii; צפוי היה שהם יכילו בעיקר פלנקטון חיידקי שלא היה מסוגל להשתמש. תאי Racine HI שהוספו מוינו לשפופרות נפרדות ולאחר מכן נאספו על מסנני ממברנה. אמפליקונים חלקיים של הגן 16 ribosomal RNA התקבלו לאחר PCR של המסנן ואושרו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.

לאחר סינון המיון, ניתן לבצע גם הגברת PCR של גנים תפקודיים כדי לבחון את השונות התפקודית בין התאים הממוינים. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להפריד פיזית ולזהות תאי חיידקים תפקודיים בסביבה מימית באמצעות גישה המשלבת מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) והטמעה של BRDU. זכרו, BIDU הוא מסוכן, ויש ללבוש תמיד חלוק מעבדה וכפפות בעת ביצוע הליך זה.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.