ReAsH / פלאש סימון ניתוח מקדימה של חלבונים בתאים חיישן Tetracysteine

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסמן תאים המבטאים טטרה ציסטאין וחלבון מתויג פלואורסצנטי עם הבזק הצבעים או האפר, ולנתח כמותית את התוצאות. זה מושג על ידי טרנסקציה ראשונה, פלסמיד הנושא חלבון פלואורסצנטי וחלבון המטרה המכיל תג טטרה ציסטאין לקו התאים המעניין. לאחר מכן, החלבון המבוטא מסומן ב-R או Flash, והדיאטה הלא קשורה ספציפית מוסרת על ידי שטיפה עם BAL כדי להתכונן להדמיה מיקרוסקופית.

לאחר מכן משתמשים במיקרוסקופ קונפוקלי לאיסוף תמונות פלואורסצנטיות של התאים עם תעלות האפר או ההבזק והחלבון הפלואורסצנטי. לבסוף, התמונות מנותחות באמצעות תמונה J כדי לכמת קשירה של אפר או הבזק לחלבון המטרה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את היקף קשירת האפר או ההבזק לחלבון המטרה בתאים באמצעות המתאם בין פלואורסצנציה של אפר עם פלואורסצנציה של חלבון פלואורסצנטי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו פשוט לקיחת חלבון המטרה עם GFP, הוא שיכולה לעקוב אחר תכונה שנייה של החלבון, כגון שינוי קונפורמציה בנוסף ללוקליזציה שלו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התשתית והתפקוד של החלבון, כגון אירועי איזציה, שינויים קונפורמטיביים ואירועי קשירת LI המשנים את יכולתו של ה-TAC לאסור אפר או הבזק. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כשרצינו להעריך כיצד פוליגמיה תת-מיקרוסקופית קטנה של הנטינגטון נוצרה בתאים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלב ניתוח הנתונים מכיוון שהם מורכבים מבחינה טכנית המדגימים את הליכי הניסוי. שלבים 1 עד 3 יהיו יסמין רנסון, עוזרת מחקר מהמעבדה שלנו, שתדגים את ניתוח הנתונים. השלב הרביעי יהיה Sevki GaN, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו המשתמש בשיטות תרבית תאים סטנדרטיות עבור קו העניין של התאים שלך ושקופית הדמיית תאים חיים מוכנה לטרנספקציה.

הכן תרבית של תאי היצמדות להעביר את הפלסמיד שלך המכיל את גן תג ה-TC המעניין. על פי שיטת טרנספקציה לבחירה, חשוב שיהיו בקרות חיוביות ושליליות כדי להעריך את מידת הקישור הספציפי לתגי TC, כמו גם להעריך את זרימת האקונומיקה של שטף בין ערוצים בעת איסוף מיקרוגרפים קונפוקליים. לכן, עבור שני צבעים, ודא שהדגימות מוכנות לצבעים בודדים, או החלבון הפלואורסצנטי בפני עצמו ואם אפשר, חלבון T ctech הקשור לבשר או

לעומת אך ללא חלבון פלואורסצנטי. יום עד יומיים לאחר הטרנספקציה, שטפו בעדינות את התאים עם 300 מיקרוליטר של תמיסת מלח האיזון של האנק לפני המלחמה או HBSS, הכינו HBSS טרי עם 10 מיקרומולר, אחד, שניים, וכו' איתן דיא תיול או EDT והבזק מיקרומולר או אפר אחד. ולאחר הוצאת ה- HBSS מהתאים, החלף בעדינות ב -300 מיקרוליטר של מדיום האפר למשך 30 דקות בדיוק ב -37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית רקמות.

מניסיוננו, זמני דגירה ארוכים יותר מגדילים משמעותית את הקרינה ברקע. שאפו בעדינות את תמיסת התיוג מהתאים והחליפו אותה ב-300 מיקרוליטר של HBSS חם מראש עם 250 מיקרומולר, שניים שלושה דימר, מכסה פרופנול או BAL למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. הסר את תמיסת הכביסה על ידי שאיפה עדינה והחלף אותה ב -300 מיקרוליטר HBSS חם מראש.

לאחר שטיפה זו, התאים עשויים להיות מקובעים בגובה פרפורמים, אם כי מצאנו שזה מגביר את הקרינה הצינית הלא ספציפית. לפיכך, אנו בדרך כלל מדמים את התאים חיים בטמפרטורת החדר. בנוסף, קיבוע תאים לפני התיוג מונע קשירת צבע דו-צדדי.

כדי להתחיל לדמות תאים במיקרוסקופ קונפוקלי, הגדר פרמטרים להדמיית הפלואורופורים הבודדים וודא שיש דימום זניח בין הערוצים. לאחר מכן, התאם את הגדרות מכפיל הצילום כך שהפלואורסצנטיות המקסימלית בדגימה לא תרוויח את הגלאי. לאחר קביעת הגדרות ההדמיה הטובות ביותר, אל תשנה אף אחת מהן בין הדגימות.

השתמש בקצב סריקה של 200 הרץ, אסוף ארבעה ממוצעי קווים והגדר את קוטר החור ליחידת שטח אחת. ניתן להרחיב את קוטר חור הסיכה אם אות לרעש מהווה בעיה. עם זאת, הדבר עלול לגרום לאובדן מסוים של רזולוציית ההדמיה.

אסוף את התמונות הקונפוקליות בפורמט של 12 סיביות ומעלה במידת האפשר. למקסם את איכות ניתוח הנתונים הכמותיים. אסוף תמונות עבור תעלת החלבון הפלואורסצנטי וגם עבור ערוץ התבנית של ארסנל BI עבור כל הדגימות.

כדי לנתח את הנתונים, השתמש בתוכנת Image J עם התוספים הבאים. אם אתה משתמש בגרסה ישנה יותר מגרסה 1.32 C, לחץ על האפשרויות הבאות. כדי לאפשר פתיחה של תמונות מרובות בו-זמנית, אפשרויות עריכה הזן פלט קו נטוי ולחץ על התיבה כדי להשתמש בבורר הקבצים j לפתיחת שיתוף לוכסן.

לחץ על אישור. פתח את התמונות המעניינות. תמונה J תגדיר באופן אוטומטי את עוצמות הפיקסלים המקסימליות והמינימליות המוצגות על המסך עבור כל תמונה בנפרד, מכיוון שלתמונות שונות יהיו עוצמות פיקסלים שונות.

המשמעות היא שהתמונות המוצגות אינן ניתנות להשוואה כפי שנצפו. כדי להבטיח שכל התמונות שנפתחו יהיו באותו קנה מידה, הגדירו פיזית את עוצמות הפיקסלים העליונות והתחתונות שיש להציג. כדי להגדיר ערכים אלה, בחר תמונה, התאם את ניגודיות הקו הנטוי של הבהירות.

לחץ על הגדרה, הגדר את ערכי המינימום והמקסימום המוצגים. לאחר מכן בחר הפץ לכל התמונות הפתוחות ולחץ על אישור. לחלופין, מקמו את כל התמונות של ערוץ מסוים יחד בקובץ או באוסף אחד.

לאחר מכן, תמונה J תתאים אוטומטית את כל התמונות לאותו קנה מידה. לשם כך, בחר תמונות באוספי תמונות לערימה, הזן שם משותף לכל קובץ ובחר כותרות בשימוש כתוויות. לחץ על אישור.

המר את כל התמונות הפתוחות לשמונה סיביות לצורך ניתוח. על ידי בחירת סוג תמונה שמונה סיביות, זה ישנה את קנה המידה של טווח הצפייה למרווח של אפס עד 255. חשוב לא לשמור בפורמט המקורי של 12 סיביות ומעלה, מכיוון שהדבר יאבד את תוכן המידע.

שמור עותק בתיקיה חדשה בשם שמונה סיביות שהומרה באמצעות האפשרות שמירה בשם. שיטה אחת לבחון את מידת קשירת התבנית הדו-ארסלית בתמונה שלמה היא לבצע תרשים מתאם עוצמת פיקסלים. תרשים זה הוא כל ערך פיקסלים בערוץ אחד ביחס לערך הפיקסלים המתאים בערוץ שני.

לפיכך, מיקום פיקסלים גבוה בקרינה GFP יהיה גבוה גם בקרינה של אפר אם יש כריכה גבוהה. כדי לנתח את מתאם הפיקסלים co, ודא שתמונות REA ו- GFP של שמונה סיביות פתוחות בתמונה J.לאחר מכן, פתח את תוסף מתאם התמונות על-ידי בחירת תוספים מתאם תמונה. הקצו את קובצי התמונה לתמונה הראשונה ולתמונה השנייה.

לאחר מכן לחץ על אישור. ייתכן שהערימה שתתקבל לא תציג מידע מפורט. זה נורמלי.

שמור את המחסנית בתיקיה חדשה בשם scatterplots ותן לה את אותו שם קובץ כמו הדגימה שאליה היא מתייחסת. לדוגמה, עלילת מתאם GFP של אפר. כדי להציג את הנתונים, בחר אחת משתי אפשרויות.

ראשית, שנה את הנתונים כך שיהיו פורמט יומן על ידי בחירה ביומן מתמטיקה אוטומטי של תהליך. לאחר מכן, כדי לשנות את קנה המידה החזותי של הנתונים, לחץ על התאמת בהירות, קו נטוי ניגודיות ובחר אוטומטי. שנית, שנה את קנה המידה של הנתונים באופן חזותי כדי להציג ערכים נמוכים בלבד ולהציג את הנתונים באמצעות טבלת בדיקת מידע מיוחדת או LUT כדי ליצור טבלת LUT מותאמת אישית.

לחץ על עריכת צבע תמונה LUT לקבלת LUT פשוט מאוד. לחץ על הפיקסל השמאלי העליון ובחר את הצבע השחור. לאחר מכן בחר את הפיקסל הבא מימין ובחר את הצבע האדום.

לאחר מכן, לחץ על הפיקסל השלישי, ותוך כדי לחיצה ממושכת על לחצן העכבר, גרור את הבחירה לפיקסל הימני התחתון. בחר את הצבע האדום, לחץ על אישור ולאחר מכן בחר את הצבע הלבן ולחץ על אישור. בחר את טווח הניגודיות של קו נטוי בהירות מאפס עד 255 כפי שתואר קודם לכן כדי לנעול את התמונה לזו המוצגת על המסך.

המר אותו לפורמט RGB כדי להעתיק ולהדביק תמונות לתוכניות אחרות. ראשית, פתח את התמונות של שמונה סיביות או 16 סיביות כפי שתואר קודם לכן. הקצה ערכת צבעים של LUT לתמונות עבור GFP.

הקצה את ה-LUT הירוק על ידי לחיצה על התמונה. חפש טבלאות ירוקות. לבסוף בחר את התמונה להעתקה והעתק אותה ללוח על ידי בחירה בעריכת העתק למערכת, איור זה מציג תוצאה אופיינית לגרב הקינאז שהתמזגה, ה-GFP ותג TC שהוכתם במשך 30 דקות.

עם אפר בתאי HEC 2 9 3, נראה כי ASH נקשר ביעילות לחלבון המטרה הנושא תג TC עם זיקה גבוהה. לעומת זאת, איור זה מציג את דגימת הבקרה המקבילה של SARK התמזגה ל-GFP, אך חסרה את תג ה-TC, החיוני לאימות הן הספציפיות של תג ה-TC והן את רמת צביעת הרקע. תוצאה זו מראה של-RH אין תגובתיות עם חלבון המטרה, חסר תג TC, מה שמעיד על הספציפיות של תג TC לקשירת SSH.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לאפשר לתאים להיות מתכנסים ורגועים, מכיוון שהדבר ישפיע על קשירת V בתאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד פשוט לנתח את הנתונים שלך בצורה כמותית, ותוכל לחדד את השיטות הללו כדי לפתח IUTS ייחודי משלך להדמיית נתונים.