Name: דוגמנות איתות החיסון עצבית של מיגרנה אפיזודי כרוני באמצעות הפצת דיכאון במבחנה /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 13 s
Description: חקור את תפקיד האיתות החיסוני העצבי ברגישות למיגרנה באמצעות תרביות פרוסות היפוקמפוס של עכברוש. שיטה זו מאפשרת זיהוי מולקולרי רגיש של ציטוקינים ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NS-19108), המכון הלאומי לבריאות הילד מחלות (PO1-HD09402), המחקר מיגרנה קרן וקרן הלבן. גב &#39;פ&#39; מרשה Kraig סייעו בהכנת ותחזוקה של מערכות תרבות.

<ol><li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18 (9), 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25 (15), 3952-3961 (2005).</li>
<li>Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+IgG+is+neuroprotective+via+enhancing+microglial+recycling+endocytosis+and+TNF-%CE%B1lpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-αlpha.</a> J Neurosci. 28 (47), 12199-12211 (2008).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18 (4), 319-331 (1996).</li>
<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+physiology%3A+unique+stimuli%2C+specialized+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Mitchell, H. M., White, D. M., Domowicz, M. S., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+pre-conditioning+neuroprotection+depends+on+TNF-%CE%B1lpha+and+is+enhanced+by+blockade+of+interleukin-11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem+DOI%22%5BJournal%5D)">Cold pre-conditioning neuroprotection depends on TNF-αlpha and is enhanced by blockade of interleukin-11.</a> J Neurochem DOI. , (2010).</li>
<li>Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+study+of+neuroprotection+from+cold-preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Strategies for study of neuroprotection from cold-preconditioning.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17 (1), 26-43 (1997).</li>
<li>Grinberg, Y. Y., Milton, J. G., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+depression+sends+microglia+on+L%C3%A9vy+flights%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spreading depression sends microglia on Lévy flights.</a> PLoS ONE. 6 (4), (2011).</li>
<li>Koroleva, V. I., Oitzl, M. S., Bures, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+of+synaptically+elicited+cortical+spreading+depression%3A+drug-induced+changes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Threshold of synaptically elicited cortical spreading depression: drug-induced changes in rats.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 60 (1), 55-64 (1985).</li>
<li>Gubern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+housekeeping+genes+for+quantitative+real-time+PCR+in+in-vivo+and+in-vitro+models+of+cerebral+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Validation of housekeeping genes for quantitative real-time PCR in in-vivo and in-vitro models of cerebral ischaemia.</a> BMC Mol Biol. 10, 57-57 (2009).</li>
<li>Tian, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantification+of+ADAMTS+expression+in+an+animal+model+of+cerebral+ischemia+using+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anaesthesiol+Scand%22%5BJournal%5D)">The quantification of ADAMTS expression in an animal model of cerebral ischemia using real-time PCR.</a> Acta Anaesthesiol Scand. 51 (2), 158-164 (2007).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29 (9), e45-e45 (2001).</li>
<li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Pusic, A. D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+gene+micro+array+profiling+demonstrates+%22T-cell-like%22+activation+after+recurrent+spreading+depression+-+implications+for+migraine+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+abst%22%5BJournal%5D)">Inflammatory gene micro array profiling demonstrates "T-cell-like" activation after recurrent spreading depression - implications for migraine pathogenesis.</a> Soc Neurosci abst. , (2010).</li>
<li>Quinn, B., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiated+silver+intensification+procedure+for+the+peroxidase-diaminobenzidine+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A differentiated silver intensification procedure for the peroxidase-diaminobenzidine reaction.</a> J Histochem Cytochem. 44 (1), 71-74 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+nitric+oxide+influence+induction+of+reactive+gliosis+from+spreading+depression+in+microglia+but+not+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes.</a> J Comp Neurol. 369 (1), 93-108 (1996).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

SD הוא ההפרעות התקפי של המוח שתכונותיהם הן שמור ביותר בכל אזורי המוח המינים שנבדקו עד כה. SD הוא למד בדרך כלל הניאוקורטקס. עם זאת, את המורכבות של מעגלים עצביים המבנה הזה (לעומת ההיפוקמפוס), כמו גם חוסר היכולת לשמור הניאוקורטקס בחיים במבחנה עם פונקציות החיסונית שקט לתקופות ממושכות, להפוך אותו לשימושי פחות כהכנה במבחנה להגדרת השלכות ארוכות טווח הרגישות של SD. לעומת זאת, ההיפוקמפוס אינו רק מבנה המוח, כי הוא רגיש ביותר SD, הוא גם מבנה archicortical עם מבנה פשוט יותר מעגל תפקוד עצבי, וזה גם מתאים להגדרת אמצעי neuroimmune שבאמצעותו ניתן לווסת את הפעילות העצבית הרגישות SD .

דוגמנות איתות החיסון עצבית של מיגרנה אפיזודי כרוני באמצעות הפצת דיכאון במבחנה</em

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

מיגרנה והפיכתו ל מיגרנה כרונית הם נטל הבריאות הצורך של אפשרויות טיפול טובות. אנו מבקשים להגדיר כיצד איתות החיסונית העצבית מודולציה את הרגישות למיגרנה, הדגם במבחנה באמצעות הפצת דיכאון (SD), כאמצעי לפתח מטרות טיפולית חדשנית מיגרנה אפיזודי כרוני. SD הוא הגורם סביר של הילה מיגרנה וכאבי מיגרנה. זהו הפסד התקפי של תפקוד עצבי מופעלות על ידי פעילות עצבית מוגברת בהתחלה, אשר לאט מתפשטת בתוך אזורים במוח רגישים. תפקוד המוח רגיל הוא רגיש להפליא, והוא מסתמך על, חופפות ברמה נמוכה איתות החיסונית. לפיכך, סביר איתות החיסונית העצבית משפיעה הפעילות החשמלית של SD, ולכן מיגרנה. תפיסת הכאב מחקרים SD בבעלי חיים שלמים כרוך בקשיים, אבל כל החיות מתאימים גם לבחון מערכות היבטים בביולוגיה של מיגרנה מאז SD מפעיל מסלולים nociceptive trigeminal. עם זאת, מחקרים בבעלי חיים שלם לבדו לא יכול לשמש כדי לפענח את המנגנונים מעגל הסלולר העצבית של SD. במקום זאת, בהכנות במבחנה שבה התנאים הסביבתיים ניתן לשלוט נחוצים. כאן, חשוב להכיר במגבלות של פרוסות חריפה יתרונות ברורים של תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס. פרוסות המוח חריפה לא יכול לגלות שינויים עדינים איתות החיסונית מאז הכנת פרוסות לבדו מעורר: הפרו דלקתי השינויים הימים האחרונים, התנהגות epileptiform בשל רמות גבוהות של מתח החמצן הדרוש כדי להחיות את פרוסות, ופגיעה בלתי הפיכה תא במרכזי פרוסה anoxic. לעומת זאת, אנו בוחנים איתות החיסונית בוגרת תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס מאז תרבויות מקרוב מקבילים שלהם עמיתו vivo עם תפקוד trisynaptic בוגרת; להראות האסטרוציטים שקט, microglia, ורמות ציטוקינים, ו SD מושרה בקלות כהכנה unanesthetized. יתר על כן, פרוסות הם חיים ארוכים ו SD יכול להיגרם על ימים רצופים ללא פציעה, מה שהופך את ההכנה האמצעי היחיד עדכני המסוגל דוגמנות ההשלכות neuroimmune של כרוני SD, ו מיגרנה כרונית ובכך אולי. אנו משתמשים בטכניקות אלקטרו ולא פולשנית הדמיה כדי למדוד תא עצבי פונקציות במעגל ביחד עם SD. עצבית החיסונית ביטוי גנים משתנים נמדדים עם הקרנת qPCR, מערכי qPCR, וכן, חשוב מכך, השימוש preamplification cDNA לגילוי של Ultra-Low מטרות רמת כגון גמא אינטרפרון משופר באמצעות תא שלם, אזורית או ספציפי (באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה לייזר) דגימה. מפל איתות ציטוקין מוערכת נוספת עם מטרות phosphoprotein multiplexed קשור עם ביטוי גנים שינויים phosphoprotein אישר immunostaining דרך תא ספציפי. אסטרטגיות תרופתי ו siRNA משמשים לחקות לווסת את המערכת החיסונית מאותתים SD.

מיגרנה והפיכתו ל מיגרנה כרונית הם נטל עצום הבריאות זקוקה אפשרויות טיפול טובות. אנו מבקשים להגדיר כיצד איתות החיסונית העצבית מודולציה את הרגישות למיגרנה, על פי הדגם<em&gt; במבחנה</em&gt; דיכאון באמצעות הפצת בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס, כאמצעי לפתח מטרות טיפולית חדשנית.

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

מטרת הסרטון הזה היא להמחיש כיצד ניתן להשתמש בתרביות פרוסות היפוקמפוס כדי לפענח את האיתות החיסוני העצבי המווסת את הרגישות להתפשטות דיכאון, הגורם הבסיסי הסביר ביותר להילה של מיגרנה ואולי מיגרנה. דיכאון מתפשט בקלות בתרביות פרוסות היפוקמפוס. מכיוון שהתרביות נשמרות במבחנה במשך שבועות, ניתן למדוד, לחקות ולווסת את ההתנהגות של סוגי תאים בודדים לאורך תקופות ממושכות.זה חשוב במיוחד לחקר איתות חיסוני עצבי. מכיוון שפרוסות מוח בוגרות בהיפוקמפוס מגיעות למצב חיסוני שקט, ניתן להעריך תגובות חיסוניות של דיכאון מתפשט ללא ההשפעות המבלבלות של הרדמה באמצעות טכניקות ביולוגיות מולקולריות מודרניות. ניתן לקבוע בהתאם זיהוי רגיש של איתות ציטוקינים מ-50 תאים בלבד לכ-90,000 תאים בפרוסה בהתאם.תרביות פרוסות מוח בהיפוקמפוס מתאימות באופן אידיאלי לשימוש בפיתוח טיפולים חיסוניים עצביים חדשים להקלה על מיגרנה. שמי יאן ברג ואלה איה פוס והיידי מיטשל מהמעבדה של ריצ'רד קרייג והמחלקה לנוירולוגיה במרכז הרפואי של אוניברסיטת שיקגו. היום נדגים את השימוש בהיפוקמפוס של חולדות, כינים, תרביות וחקר איתות חיסוני ברמה נמוכה של התפשטות דיכאון.דיכאון מתפשט הוא אירוע עצבי פרוקסימלי המופעל על ידי פרץ של פעילות סינפטית מוגברת שאחריו במהירות אובדן חולף של כל הפעילות. עדויות הולכות וגדלות מראות כי איתות חיסוני ברמה נמוכה יכול להשפיע על הפעילות הסינפטית במוח ובתמורה להיות מושפע ממנה. אנו משערים שציטוקינים מווסתים את הרגישות להתפשטות דיכאון וכתוצאה מכך, הילה של מיגרנה ואולי גם מיגרנה.ההליכים שאנו מתארים כאן נועדו למזער את הפעלת תאי החיסון שעלולה לבלבל ולהגביר את יכולתנו לזהות איתות חיסוני ברמה נמוכה. זה מאפשר לנו לזהות את המגוון הרחב ביותר של איתות חיסוני עצבי ואת האינטראקציות שלו עם דיכאון מתפשט. כדי להתחיל בהליך זה, צור אלקטרודות קרקע על ידי חיתוך צינורות זכוכית באורך של 4.5 מילימטר.ואז יש ללטש בקצרה את החלקים החתוכים בשני הקצוות. לאחר מכן, הביאו לרתיחה 100 מיליליטר של אשלגן כלורי מולארי אחד, הוסיפו אליו 3.5 גרם אגר ו -0.5 גרם EDTA. מערבבים את התערובת ברציפות לקבלת תמיסה צהובה שקופה.התקן חתיכת צינור גמיש קצר מעל כל צינור זכוכית. לאחר מכן משוך את תמיסת האשלגן הכלורי החמה לתוך צינור הזכוכית ומרחק קצר לתוך הצינור הגמיש. שחרר את היניקה ואפשר לאגר האשלגן כלורי לטפטף לאט מהקצה הפתוח של צינור הזכוכית.כאשר האגר מטפטף החוצה, גע בחתיכת קרח עם קצה צינור הזכוכית הפתוח, מה שיגרום לאגר לג'ל בקצה האלקטרודה ולא לג'ל לאחר נסיגה חזרה לצינור צינור הזכוכית. לאחר שג'ל האגר, הסר בעדינות את הצינור הגמיש מבלי לשנות את מיקום האגרה. בצינורות הזכוכית, הכניסו 0.5 מיליליטר של אשלגן כלורי מולארי אחד לכל באר של מתלה צינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.לאחר מכן הנח את הקצה של כל צינור זכוכית אפיל אשלגן כלורי בבארות בודדות כדי לשמור על לחות הקצוות. לאחר מכן, החזק חוט כסף באורך 80 סנטימטר בגודל 15 עם המוסטט. נקו כל אחד מארבעת הצדדים על ידי גירוד החוט דרך לוח אמרי המוחזק על השיש.לאחר מכן, חותכים את החוט לאורכים של ארבעה סנטימטרים. הכניסו אותם לבקבוקון נצנוץ מלא באקונומיקה למשך 20 עד 30 דקות. על מנת להניח מעיל כלוריד כסף לכסף יציב על משטח הכסף הנקי, כופפו את החוט לשניים והכניסו אותו לצינור הזכוכית המלא באגר אשלגן כלורי והשאיר כארבעה עד שישה מילימטרים חשופים.לאחר מכן מצפים את קצה צינור הזכוכית המכיל את חוט הכסף וכמות קטנה של החוט בגו, דבק עמיד במים וגמיש כדי למנוע התייבשות של אגר האשלגן הכלורי, חזור על כל האלקטרודות ותן לדבק להתייבש למשך הלילה. לאחר הציור, אחסן את האלקטרודות בבקבוקוני נצנוץ עם חמישה מיליליטר של אשלגן כלורי טוחנת אחת ו -25 מיליגרם EDTA. כחמש עד שש אלקטרודות לבקבוקון בארבע מעלות צלזיוס.הכינו אלקטרודות הקלטה עם צינורות זכוכית בו סיליקט עם חוטים. לאחר מכן, הכינו אלקטרודה מגרה על ידי חיתוך באורך של כ-20 סנטימטר של מרידיום פלטינה מצופה טפלון. ואז כופפו את האורך לשניים, קשרו את הקצוות הרופפים לקשר מרובע רופף, והשאירו כשני סנטימטרים מהקשר לקצות החוט.אבטח את הקשר בצ'אק של מקדחה חשמלית המונחת על שולחן תוך החזקת הקצה השני של החוט עם המוסטט. הפעל וכבה את המקדחה בקצרה עד שהחוט מסובב היטב. כדי לחבר את חוטי המרידיום המעוותים של הפלטינה לחוטי עופרת, הדביקו תחילה את חוט המרידיום המעוות של הפלטינה לראש ספסל וזרקו שלולית של חומצה הידרוכלורית מרוכזת על קצה חופשי אחד של החוט המעוות.לאחר מכן הניחו את הקצה המופשט על חוט עופרת הסמוך לקצה החוט המעוות והפעילו חום ממלחם קצה עדין, ואז הלחמו עד ששני החוטים מחוברים היטב. החלק אורך קצר של צינורות כיווץ חום מעל חיבור החוט החשוף וכווץ אותו באש חום. יש ללטש את קצה הפיפטה באורך 15 סנטימטר ולהוביל את חוט המרידיאן המעוות של הפלטינה במורד הפיפטה.השתמש באפוקסי דוחה מים כדי לאטום את שני קצוות האלקטרודה. לבסוף, חבר פקקי בננה לקצוות חוטי העופרת לחיבור למבודד הגירוי תחת תצפית סטריאוסקופית. הנח את קצה האלקטרודה ב-PBS וחפש בועות המיוצרות אלקטרוליטיות המגיעות רק מהקצה החתוך של קצות האלקטרודה אם בועות כלשהן מגיעות מצידי החוטים המעוותים.חותכים את האלקטרודה לרוחב באמצעות סכין גילוח בקצה יחיד כדי להחזיר בידוד שלם לצירים הארוכים של החוטים. בעת פתרון בעיות כדי לפתור השפעות גירוי חריגות, נסה ליצור קצה אלקטרודה חתוך טרי. שלב חשוב נוסף הוא הכנת כלי ההקלטה, המורכבים מתוספת תרבית פרוסות וצלחת תרבית 35 מילימטר היושבת על שני מוטות זכוכית בגודל 1.0 על 12 מילימטר המרוחקים כ -1.0 סנטימטרים זה מזה.מוטות זכוכית מחוברים לבסיס הכלים על ידי חימום צינורות הזכוכית ואז לחיצה עליהם לבסיס בעזרת מלקחיים. לתנאי הקלטה סטטיים, הוסף 1.5 מיליליטר מדיה לצלחת. לאחר מכן יש להשרות חתיכת כותנה סטרילית ברוחב 10 מילימטרים ובאורך של שלושה עד ארבעה סנטימטרים.ב -1.0 מיליליטר מדיה, קפלו את הכותנה לשניים לאורך הציר הארוך והניחו אותה לאורך הקיר הפנימי על התוספת. בעזרת מלקחיים סטריליים, הכותנה הרטובה מסייעת בשמירה על לחות הכלים. שלוש חתיכות צינורות דחיסות באורך ארבעה מילימטר מרווחות באופן שווה סביב התוספת.מכסים את הכלי היטב בסרט פוליוויניל כלוריד כדי לאפשר חילופי גזים. לאחר מכן חתוך סביב הקיר האנכי האמצעי שלו עם סכין גילוח בקצה יחיד כדי להסיר עודפי פוליוויניל כלוריד. הסרט מעורר כשלושה פוטנציאל שדה עם פולסים של 100 מיקרו-שניות ב-0.2 הרץ, החל מזרם של כ-1 עד 5 מיקרו-אמפר המספיק כדי לעורר תגובה.הזז את אלקטרודת ההקלטה במרווחים לאורך הציר הארוך של נוירון הפרה-מתכת עד שפוטנציאל השדה הוא מקסימלי. לאחר מכן, הגדל את הזרם באמצעות אלקטרודת הקלטה במיקום זה ושים לב לתגובת הזרם המקסימלית של כ-10 עד 20 מיקרו אמפר. לבסוף, השתמש בחצי עוצמת גירוי מקסימלית לניסויים כדי לקבוע את הסף לדיכאון מתפשט טרנס-סינפטי.החלף את פרדיגמת הגירוי כדי לעורר באופן ידני התפרצויות בודדות של 100 מיקרו-שניות לכל פולס ב-10 הרץ. הגדל בהדרגה את עוצמת הזרם לכל פרץ גירוי עד להפעלת דיכאון מתפשט. דווח על סף דיכאון מתפשט בלומים טריגר להתפשטות דיכאון כל תשע דקות למשך שעה.רשום כשלושה אזורים פוטנציאל מהיר ושינויים פוטנציאליים איטיים באמצעות מערכות עיבוד אותות דיגיטליות נפרדות. לאחר השקע המתפשט האחרון, החזירו את הכנסת התרבות לתנאי דגירה רגילים וסמנו את מכסה צלחת התרבות. כדי לציין את התרבות שחוותה דיכאון מתפשט החלף מדיה כל שלושה עד ארבעה ימים עד קציר התרבית.התחל הליך זה על ידי דילול ISO סלקטין ל-20 מיקרוגרם למיליליטר במצעי גידול. לאחר מכן דגרו תרביות פרוסות בתנאי דגירה רגילים ארבע עד 10 שעות לפני ההדמיה, הפעילו את מצלמת המיקרוסקופ, בקרת טמפרטורת אור UV וגזים לפחות שעה לפני ההדמיה. לאחר מכן, הגדר את תוכנת המטמורף להדמיה לאחר מכן הנח את התוספת בצלחת תרבית של 35 מילימטר עם שני מוטות זכוכית של מילימטר אחד בתחתית.ואז התקן שלוש חתיכות של צינורות גומי של שני מילימטר בין קירות התוספת לצלחת התרבות. כדי לייצב עוד יותר את התוספת, הנח פיסת כותנה ברוחב 10 מילימטר ספוגה במיליליטר נוסף של מדיה בתוך התוספת. כדי לשמור על סביבה לחה, יש לכסות היטב את החלק העליון של צלחת התרבות בסרט פוליוויניל כלוריד.כדי למנוע אובדן נוזלים, ודא שמוקד ההדמיה הוא בשכבת תאי הפרמטאל CA שלוש. שימו לב לכיוון הפרוסות על ידי צילום תמונות פאזה ב-5 x 10 x ו-20 x בחלון המיקוד העדין, הגדר את טווח הזרם לשמונה ואת הדיוק להיות בלחיצה אחת, מצא מיקוד כדי להבטיח תמונה ממוקדת בחלון ה-time-lapse הנרכש. בחר מרווח זמן לדקה אחת ומשך זמן לשש שעות כדי ללכוד במדויק את תנועות המיקרוגליה.ההדמיה צריכה להיות לא פחות תכופה מפעם בדקה בסוף הסרט. בדוק אם יש פגיעה בתא על ידי בדיקת דיבור CY לניסויי PCR. טבלו תרבית פרוסות בשניים עד שלושה מיליליטר RNA מאוחר יותר ואחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס עד שלושה ימים עד לעיבוד נוסף.לקציר, הסר רקמות זרות בעזרת סכין זכוכית, הכניס את הפרוסות ל- RNA בודדים. צינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר ללא DNA המכילים 0.5 מיליליטר של מי מלח פוספט סטריליים. בעזרת דגימות סיבוב מכחול עדינות, 10,000 סל"ד למשך דקה אחת בצורה סטריאוטיפית כך שכל הפרוסות נדבקות לאותו צד של הצינורות שלהן.הסר את ה-PBS supernatant והשהה מחדש את הדגימה ב-500 מיקרוליטר טריול. אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס או השאר על קרח עד למיצוי RNA ניתן להעריך ברגישות שינויים בביטוי החלבון מהפלת SI RNA על ידי שיפור צביעה חיסונית מסורתית של DAB באמצעות העצמת כסף וכימות מטרי צפיפות לאחר מכן. מוצגת כאן פרדיגמת ההקלטה האלקטרופיזיולוגית של תרבית הפרוסות שבה מיקרו אלקטרודה מקליטה ממוקמת בשכבת הנוירונים של CA שלוש פרמטאליות ואלקטרודה מגרה דו קוטבית ממוקמת בפיתול המשונן.הנה דוגמה לשלושת פוטנציאלי השדה של CA מעוררים על ידי גירוי פיתול משונן, המשמש לקביעת התגובה החצי מקסימלית כאן מראה את שלוש תגובות פוטנציאל השדה של CA להתפרצויות של 10 הרץ שנותרו שהוגדלו בהדרגה בעוצמה כדי לעורר בסופו של דבר דיכאון מתפשט. בפינה השמאלית התחתונה. מוצג כאן תא חיוני למופת.הדמיה זו מדגימה לראשונה שחלק מהמיקרוגליה נע למרחקים ארוכים בדפוס חיפוש אופטימלי כפי שמצוין באדום המכונה טיסות היטל שהן ביחס הפוך לפעילות הסינפטית. הגברה מוקדמת של CDNA מאפשרת זיהוי של גמא IFN בתרביות פרוסות היפוקמפוס. בתחילה, ה-CT עבור גן ייחוס RPL 13 A היה 20.5 ו-IFN gamma לא היה ניתן לזיהוי משמאל.עם זאת, לאחר הגברת Preem שצוינה מימין, גמא IFN זוהתה בקלות ב-29.0. עם RPL 13 A שנרשם ב-14.1 כדי להצביע על עלייה של פי 12 בהגברת האות, אישור אימונוהיסטוכימי של יעילות מוצג כאן. העצמת כסף מובחנת של צביעה חיסונית של פרוקסידאז דיאמין בנזין משמשת לכימות ההפחתה המשמעותית של ייצור ציקלופילין B בתרביות פרוסות היפוקמפוס שטופלו ב-siRNA.ניתן לבצע את הטכניקות המתוארות בסרטון זה במשך מספר ימים. ברצוננו להדגיש כי תרביות פרוסות ההיפוקמפוס שלנו קרובות מאוד למקבילותיהן in vivo והן אידיאליות לחקר איתות חיסוני והפצת דיכאון. עם זאת, חיוני לשמור על סביבה חיסונית שקטה בתנאים מבוקרים ומזויפים.כדי למזער את ההפעלה החיסונית המבלבלת, יש לשמור על תרביות בתנאים סטריליים. אין לחשוף אותם להפרעות כימיות, מכניות או תרמיות מוגזמות. מכיוון שאיתות ציטוקינים פיזיולוגי מתרחש ברמה הטוחנת של הפמטו, יש ליישם טכניקות מדידה רגישות וניתנות לשחזור.אנו משתמשים בטכנולוגיית PCRA ובטכניקות פרוטאומיות רגישות. לבסוף, ציטוקינים הם גם פליאוטרופיים וגם מיותרים. בהתאם. מטרות ציטוקינים מרובות שנמדדו לאורך זמן שימושיות לחקר האופן שבו איתות חיסוני מווסת את הרגישות לנקע, דיכאון וכתוצאה מכך למיגרנה.

modeling-neural-immune-signaling-episodic-chronic-migraine-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במחקר זה, החוקרים מדווחים בפעם הראשונה רומן 3D-Immersive &amp; האינטראקטיבי Neuronavigation (3D-IIN) דרך ההשפעה של התקף מיגרנה ספונטני במערכת μ-אופיואידים של המוח של מטופל בגוף חי.

3D-Neuronavigation<em&gt; בVivo</em&gt; דרך המוח של חולה במהלך מיגרנה ספונטנית

כתב יד זה מתאר את השיטות לאינדוקציה וניקוד של מודל דלקת המוח האוטואימונית הניסויי (EAE), יחד עם הערכת התפלגות תאי החיסון ורמות ציטוקינים mRNA בבלוטות הלימפה, הטחול, הדם וחוט השדרה באמצעות ציטומטריית זרימה ו-PCR כמותי, בהתאמה, בשלבי מחלה שונים.

אינדוקציה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis עכברים וההערכה של הפצת מחלות התלויה של תאים חיסוניים ברקמות שונות

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לחקור ליקוי של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה ויוו. אנו הכתובת באופן ספציפי כיצד לקבוע את מחסום הדם - מוח חדירות ופעילות gelatinase מעורבים בהעברה ליקוציט לרוחב limitans עכשיו, דונלד.

להמחיש ירידת ערך של המחסומים אנדותל, גליה של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה In Vivo

מכרסמים אינם מסוגלים לדווח על תסמיני מיגרנה. כאן, אנו מתארים פרדיגמת בדיקה הניתנת לניהול (בדיקות שדה בהירות/כהות ופתוחות) למדידת סלידה קלה, אחד הסימפטומים הנפוצים והמטרידים ביותר בחולים עם מיגרנות.

חקירת התנהגות דמוית מיגרנה באמצעות סלידה קלה בעכברים

התסמין הבולט ביותר של מיגרנה הוא כאבי ראש חמורים, וההשערה היא כי הדבר מתווך על ידי נוירונים חושיים המחדירים את קרום המוח. כאן אנו מציגים שיטה ליישום מקומי של חומרים על הדורה באופן זעיר פולשני תוך שימוש ברגישות יתר לפנים כפלט.

גירוי דוראלי ובדיקות פריאורביטל פון פריי בעכברים כמודל פרה-קליני של כאב ראש

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכברי המשתמש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים וניטור תהליך המחלה באמצעות מערכת ניקוד קלינית. תסמינים אוטואימוניים ניסיוניים הקשורים לאנצפלומיאליטיס מנותחים באמצעות ניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של עצם הירך ובדיקת שדה פתוח כדי להעריך את תהליך המחלה באופן מקיף.

אינדוקציה ומדדי הערכה מגוונים של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה דו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין באמצעות מסגרת סטריאוטקסית כדי ליצור מודל דמילינציה יציב וניתן לשחזור בעכברים.

הזרקה דו-נקודתית מבוססת ביציבות של מודל דה-מילינציה מוקדית המושרה על-ידי ליזופוספטידילכולין בעכברים

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) משמשת כמודל של בעלי חיים לטרשת נפוצה. מאמר זה מתאר גישה לניקוד דלקת בחוט השדרה, דמיאלינציה ופגיעה אקסונלית ב- EAE. בנוסף, מוצגת שיטה לכימות רמות האור של נוירופילמנט מסיס בסרום העכברים, המאפשרת הערכה של פגיעה אקסונלית בעכברים חיים.

ניקוד דלקת במערכת העצבים המרכזית, דמיאלינציה ופגיעה באקסון באנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית היא אחד המודלים הנפוצים ביותר של טרשת נפוצה. בפרוטוקול הנוכחי, עכברי C57BL/6J משני המינים מחוסנים בפפטיד גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין, וכתוצאה מכך בעיקר פרזיס עולה של הזנב והגפיים. כאן אנו דנים בפרוטוקול של אינדוקציה והערכה של EAE.

מידול טרשת נפוצה בשני המינים: MOG35-induced ניסיוני אוטואימוני אנצפלומיאליטיס

פרוטוקול זה מדגים את השילוב של הדמיה ואלקטרופיזיולוגיה כדי לזהות באופן אמין דפולריזציה מתפשטת בעכברים בוגרים בעקבות פגיעה מוחית טראומטית קלה.

שילוב הדמיה ואלקטרופיזיולוגיה כדי להמחיש ולתעד דפולריזציה מתפשטת בעכברים

פרוטוקול זה מספק שיטה למעקב אחר פזילה אוטומטית של העיניים במכרסמים לאורך זמן באופן התואם נעילת זמן למדדים נוירופיזיולוגיים. פרוטוקול זה צפוי להיות שימושי לחוקרים החוקרים מנגנונים של הפרעות כאב כגון מיגרנה.

שיטת פזילה אוטומטית לסנכרון זמן התנהגות ודינמיקה מוחית במחקרי כאב עכברים

חקור את תפקיד האיתות החיסוני העצבי ברגישות למיגרנה באמצעות תרביות פרוסות היפוקמפוס של עכברוש. שיטה זו מאפשרת זיהוי מולקולרי רגיש של ציטוקינים ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

דוגמנות איתות החיסון עצבית של מיגרנה אפיזודי כרוני באמצעות הפצת דיכאון במבחנה

גלה סרטונים נוספים