דוגמנות איתות החיסון עצבית של מיגרנה אפיזודי כרוני באמצעות הפצת דיכאון במבחנה

מטרת הסרטון הזה היא להמחיש כיצד ניתן להשתמש בתרביות פרוסות היפוקמפוס כדי לפענח את האיתות החיסוני העצבי המווסת את הרגישות להתפשטות דיכאון, הגורם הבסיסי הסביר ביותר להילה של מיגרנה ואולי מיגרנה. דיכאון מתפשט בקלות בתרביות פרוסות היפוקמפוס. מכיוון שהתרביות נשמרות במבחנה במשך שבועות, ניתן למדוד, לחקות ולווסת את ההתנהגות של סוגי תאים בודדים לאורך תקופות ממושכות.

זה חשוב במיוחד לחקר איתות חיסוני עצבי. מכיוון שפרוסות מוח בוגרות בהיפוקמפוס מגיעות למצב חיסוני שקט, ניתן להעריך תגובות חיסוניות של דיכאון מתפשט ללא ההשפעות המבלבלות של הרדמה באמצעות טכניקות ביולוגיות מולקולריות מודרניות. ניתן לקבוע בהתאם זיהוי רגיש של איתות ציטוקינים מ-50 תאים בלבד לכ-90,000 תאים בפרוסה בהתאם.

תרביות פרוסות מוח בהיפוקמפוס מתאימות באופן אידיאלי לשימוש בפיתוח טיפולים חיסוניים עצביים חדשים להקלה על מיגרנה. שמי יאן ברג ואלה איה פוס והיידי מיטשל מהמעבדה של ריצ'רד קרייג והמחלקה לנוירולוגיה במרכז הרפואי של אוניברסיטת שיקגו. היום נדגים את השימוש בהיפוקמפוס של חולדות, כינים, תרביות וחקר איתות חיסוני ברמה נמוכה של התפשטות דיכאון.

דיכאון מתפשט הוא אירוע עצבי פרוקסימלי המופעל על ידי פרץ של פעילות סינפטית מוגברת שאחריו במהירות אובדן חולף של כל הפעילות. עדויות הולכות וגדלות מראות כי איתות חיסוני ברמה נמוכה יכול להשפיע על הפעילות הסינפטית במוח ובתמורה להיות מושפע ממנה. אנו משערים שציטוקינים מווסתים את הרגישות להתפשטות דיכאון וכתוצאה מכך, הילה של מיגרנה ואולי גם מיגרנה.

ההליכים שאנו מתארים כאן נועדו למזער את הפעלת תאי החיסון שעלולה לבלבל ולהגביר את יכולתנו לזהות איתות חיסוני ברמה נמוכה. זה מאפשר לנו לזהות את המגוון הרחב ביותר של איתות חיסוני עצבי ואת האינטראקציות שלו עם דיכאון מתפשט. כדי להתחיל בהליך זה, צור אלקטרודות קרקע על ידי חיתוך צינורות זכוכית באורך של 4.5 מילימטר.

ואז יש ללטש בקצרה את החלקים החתוכים בשני הקצוות. לאחר מכן, הביאו לרתיחה 100 מיליליטר של אשלגן כלורי מולארי אחד, הוסיפו אליו 3.5 גרם אגר ו -0.5 גרם EDTA. מערבבים את התערובת ברציפות לקבלת תמיסה צהובה שקופה.

התקן חתיכת צינור גמיש קצר מעל כל צינור זכוכית. לאחר מכן משוך את תמיסת האשלגן הכלורי החמה לתוך צינור הזכוכית ומרחק קצר לתוך הצינור הגמיש. שחרר את היניקה ואפשר לאגר האשלגן כלורי לטפטף לאט מהקצה הפתוח של צינור הזכוכית.

כאשר האגר מטפטף החוצה, גע בחתיכת קרח עם קצה צינור הזכוכית הפתוח, מה שיגרום לאגר לג'ל בקצה האלקטרודה ולא לג'ל לאחר נסיגה חזרה לצינור צינור הזכוכית. לאחר שג'ל האגר, הסר בעדינות את הצינור הגמיש מבלי לשנות את מיקום האגרה. בצינורות הזכוכית, הכניסו 0.5 מיליליטר של אשלגן כלורי מולארי אחד לכל באר של מתלה צינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן הנח את הקצה של כל צינור זכוכית אפיל אשלגן כלורי בבארות בודדות כדי לשמור על לחות הקצוות. לאחר מכן, החזק חוט כסף באורך 80 סנטימטר בגודל 15 עם המוסטט. נקו כל אחד מארבעת הצדדים על ידי גירוד החוט דרך לוח אמרי המוחזק על השיש.

לאחר מכן, חותכים את החוט לאורכים של ארבעה סנטימטרים. הכניסו אותם לבקבוקון נצנוץ מלא באקונומיקה למשך 20 עד 30 דקות. על מנת להניח מעיל כלוריד כסף לכסף יציב על משטח הכסף הנקי, כופפו את החוט לשניים והכניסו אותו לצינור הזכוכית המלא באגר אשלגן כלורי והשאיר כארבעה עד שישה מילימטרים חשופים.

לאחר מכן מצפים את קצה צינור הזכוכית המכיל את חוט הכסף וכמות קטנה של החוט בגו, דבק עמיד במים וגמיש כדי למנוע התייבשות של אגר האשלגן הכלורי, חזור על כל האלקטרודות ותן לדבק להתייבש למשך הלילה. לאחר הציור, אחסן את האלקטרודות בבקבוקוני נצנוץ עם חמישה מיליליטר של אשלגן כלורי טוחנת אחת ו -25 מיליגרם EDTA. כחמש עד שש אלקטרודות לבקבוקון בארבע מעלות צלזיוס.

הכינו אלקטרודות הקלטה עם צינורות זכוכית בו סיליקט עם חוטים. לאחר מכן, הכינו אלקטרודה מגרה על ידי חיתוך באורך של כ-20 סנטימטר של מרידיום פלטינה מצופה טפלון. ואז כופפו את האורך לשניים, קשרו את הקצוות הרופפים לקשר מרובע רופף, והשאירו כשני סנטימטרים מהקשר לקצות החוט.

אבטח את הקשר בצ'אק של מקדחה חשמלית המונחת על שולחן תוך החזקת הקצה השני של החוט עם המוסטט. הפעל וכבה את המקדחה בקצרה עד שהחוט מסובב היטב. כדי לחבר את חוטי המרידיום המעוותים של הפלטינה לחוטי עופרת, הדביקו תחילה את חוט המרידיום המעוות של הפלטינה לראש ספסל וזרקו שלולית של חומצה הידרוכלורית מרוכזת על קצה חופשי אחד של החוט המעוות.

לאחר מכן הניחו את הקצה המופשט על חוט עופרת הסמוך לקצה החוט המעוות והפעילו חום ממלחם קצה עדין, ואז הלחמו עד ששני החוטים מחוברים היטב. החלק אורך קצר של צינורות כיווץ חום מעל חיבור החוט החשוף וכווץ אותו באש חום. יש ללטש את קצה הפיפטה באורך 15 סנטימטר ולהוביל את חוט המרידיאן המעוות של הפלטינה במורד הפיפטה.

השתמש באפוקסי דוחה מים כדי לאטום את שני קצוות האלקטרודה. לבסוף, חבר פקקי בננה לקצוות חוטי העופרת לחיבור למבודד הגירוי תחת תצפית סטריאוסקופית. הנח את קצה האלקטרודה ב-PBS וחפש בועות המיוצרות אלקטרוליטיות המגיעות רק מהקצה החתוך של קצות האלקטרודה אם בועות כלשהן מגיעות מצידי החוטים המעוותים.

חותכים את האלקטרודה לרוחב באמצעות סכין גילוח בקצה יחיד כדי להחזיר בידוד שלם לצירים הארוכים של החוטים. בעת פתרון בעיות כדי לפתור השפעות גירוי חריגות, נסה ליצור קצה אלקטרודה חתוך טרי. שלב חשוב נוסף הוא הכנת כלי ההקלטה, המורכבים מתוספת תרבית פרוסות וצלחת תרבית 35 מילימטר היושבת על שני מוטות זכוכית בגודל 1.0 על 12 מילימטר המרוחקים כ -1.0 סנטימטרים זה מזה.

מוטות זכוכית מחוברים לבסיס הכלים על ידי חימום צינורות הזכוכית ואז לחיצה עליהם לבסיס בעזרת מלקחיים. לתנאי הקלטה סטטיים, הוסף 1.5 מיליליטר מדיה לצלחת. לאחר מכן יש להשרות חתיכת כותנה סטרילית ברוחב 10 מילימטרים ובאורך של שלושה עד ארבעה סנטימטרים.

ב -1.0 מיליליטר מדיה, קפלו את הכותנה לשניים לאורך הציר הארוך והניחו אותה לאורך הקיר הפנימי על התוספת. בעזרת מלקחיים סטריליים, הכותנה הרטובה מסייעת בשמירה על לחות הכלים. שלוש חתיכות צינורות דחיסות באורך ארבעה מילימטר מרווחות באופן שווה סביב התוספת.

מכסים את הכלי היטב בסרט פוליוויניל כלוריד כדי לאפשר חילופי גזים. לאחר מכן חתוך סביב הקיר האנכי האמצעי שלו עם סכין גילוח בקצה יחיד כדי להסיר עודפי פוליוויניל כלוריד. הסרט מעורר כשלושה פוטנציאל שדה עם פולסים של 100 מיקרו-שניות ב-0.2 הרץ, החל מזרם של כ-1 עד 5 מיקרו-אמפר המספיק כדי לעורר תגובה.

הזז את אלקטרודת ההקלטה במרווחים לאורך הציר הארוך של נוירון הפרה-מתכת עד שפוטנציאל השדה הוא מקסימלי. לאחר מכן, הגדל את הזרם באמצעות אלקטרודת הקלטה במיקום זה ושים לב לתגובת הזרם המקסימלית של כ-10 עד 20 מיקרו אמפר. לבסוף, השתמש בחצי עוצמת גירוי מקסימלית לניסויים כדי לקבוע את הסף לדיכאון מתפשט טרנס-סינפטי.

החלף את פרדיגמת הגירוי כדי לעורר באופן ידני התפרצויות בודדות של 100 מיקרו-שניות לכל פולס ב-10 הרץ. הגדל בהדרגה את עוצמת הזרם לכל פרץ גירוי עד להפעלת דיכאון מתפשט. דווח על סף דיכאון מתפשט בלומים טריגר להתפשטות דיכאון כל תשע דקות למשך שעה.

רשום כשלושה אזורים פוטנציאל מהיר ושינויים פוטנציאליים איטיים באמצעות מערכות עיבוד אותות דיגיטליות נפרדות. לאחר השקע המתפשט האחרון, החזירו את הכנסת התרבות לתנאי דגירה רגילים וסמנו את מכסה צלחת התרבות. כדי לציין את התרבות שחוותה דיכאון מתפשט החלף מדיה כל שלושה עד ארבעה ימים עד קציר התרבית.

התחל הליך זה על ידי דילול ISO סלקטין ל-20 מיקרוגרם למיליליטר במצעי גידול. לאחר מכן דגרו תרביות פרוסות בתנאי דגירה רגילים ארבע עד 10 שעות לפני ההדמיה, הפעילו את מצלמת המיקרוסקופ, בקרת טמפרטורת אור UV וגזים לפחות שעה לפני ההדמיה. לאחר מכן, הגדר את תוכנת המטמורף להדמיה לאחר מכן הנח את התוספת בצלחת תרבית של 35 מילימטר עם שני מוטות זכוכית של מילימטר אחד בתחתית.

ואז התקן שלוש חתיכות של צינורות גומי של שני מילימטר בין קירות התוספת לצלחת התרבות. כדי לייצב עוד יותר את התוספת, הנח פיסת כותנה ברוחב 10 מילימטר ספוגה במיליליטר נוסף של מדיה בתוך התוספת. כדי לשמור על סביבה לחה, יש לכסות היטב את החלק העליון של צלחת התרבות בסרט פוליוויניל כלוריד.

כדי למנוע אובדן נוזלים, ודא שמוקד ההדמיה הוא בשכבת תאי הפרמטאל CA שלוש. שימו לב לכיוון הפרוסות על ידי צילום תמונות פאזה ב-5 x 10 x ו-20 x בחלון המיקוד העדין, הגדר את טווח הזרם לשמונה ואת הדיוק להיות בלחיצה אחת, מצא מיקוד כדי להבטיח תמונה ממוקדת בחלון ה-time-lapse הנרכש. בחר מרווח זמן לדקה אחת ומשך זמן לשש שעות כדי ללכוד במדויק את תנועות המיקרוגליה.

ההדמיה צריכה להיות לא פחות תכופה מפעם בדקה בסוף הסרט. בדוק אם יש פגיעה בתא על ידי בדיקת דיבור CY לניסויי PCR. טבלו תרבית פרוסות בשניים עד שלושה מיליליטר RNA מאוחר יותר ואחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס עד שלושה ימים עד לעיבוד נוסף.

לקציר, הסר רקמות זרות בעזרת סכין זכוכית, הכניס את הפרוסות ל- RNA בודדים. צינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר ללא DNA המכילים 0.5 מיליליטר של מי מלח פוספט סטריליים. בעזרת דגימות סיבוב מכחול עדינות, 10,000 סל"ד למשך דקה אחת בצורה סטריאוטיפית כך שכל הפרוסות נדבקות לאותו צד של הצינורות שלהן.

הסר את ה-PBS supernatant והשהה מחדש את הדגימה ב-500 מיקרוליטר טריול. אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס או השאר על קרח עד למיצוי RNA ניתן להעריך ברגישות שינויים בביטוי החלבון מהפלת SI RNA על ידי שיפור צביעה חיסונית מסורתית של DAB באמצעות העצמת כסף וכימות מטרי צפיפות לאחר מכן. מוצגת כאן פרדיגמת ההקלטה האלקטרופיזיולוגית של תרבית הפרוסות שבה מיקרו אלקטרודה מקליטה ממוקמת בשכבת הנוירונים של CA שלוש פרמטאליות ואלקטרודה מגרה דו קוטבית ממוקמת בפיתול המשונן.

הנה דוגמה לשלושת פוטנציאלי השדה של CA מעוררים על ידי גירוי פיתול משונן, המשמש לקביעת התגובה החצי מקסימלית כאן מראה את שלוש תגובות פוטנציאל השדה של CA להתפרצויות של 10 הרץ שנותרו שהוגדלו בהדרגה בעוצמה כדי לעורר בסופו של דבר דיכאון מתפשט. בפינה השמאלית התחתונה. מוצג כאן תא חיוני למופת.

הדמיה זו מדגימה לראשונה שחלק מהמיקרוגליה נע למרחקים ארוכים בדפוס חיפוש אופטימלי כפי שמצוין באדום המכונה טיסות היטל שהן ביחס הפוך לפעילות הסינפטית. הגברה מוקדמת של CDNA מאפשרת זיהוי של גמא IFN בתרביות פרוסות היפוקמפוס. בתחילה, ה-CT עבור גן ייחוס RPL 13 A היה 20.5 ו-IFN gamma לא היה ניתן לזיהוי משמאל.

עם זאת, לאחר הגברת Preem שצוינה מימין, גמא IFN זוהתה בקלות ב-29.0. עם RPL 13 A שנרשם ב-14.1 כדי להצביע על עלייה של פי 12 בהגברת האות, אישור אימונוהיסטוכימי של יעילות מוצג כאן. העצמת כסף מובחנת של צביעה חיסונית של פרוקסידאז דיאמין בנזין משמשת לכימות ההפחתה המשמעותית של ייצור ציקלופילין B בתרביות פרוסות היפוקמפוס שטופלו ב-siRNA.

ניתן לבצע את הטכניקות המתוארות בסרטון זה במשך מספר ימים. ברצוננו להדגיש כי תרביות פרוסות ההיפוקמפוס שלנו קרובות מאוד למקבילותיהן in vivo והן אידיאליות לחקר איתות חיסוני והפצת דיכאון. עם זאת, חיוני לשמור על סביבה חיסונית שקטה בתנאים מבוקרים ומזויפים.

כדי למזער את ההפעלה החיסונית המבלבלת, יש לשמור על תרביות בתנאים סטריליים. אין לחשוף אותם להפרעות כימיות, מכניות או תרמיות מוגזמות. מכיוון שאיתות ציטוקינים פיזיולוגי מתרחש ברמה הטוחנת של הפמטו, יש ליישם טכניקות מדידה רגישות וניתנות לשחזור.

אנו משתמשים בטכנולוגיית PCRA ובטכניקות פרוטאומיות רגישות. לבסוף, ציטוקינים הם גם פליאוטרופיים וגם מיותרים. בהתאם. מטרות ציטוקינים מרובות שנמדדו לאורך זמן שימושיות לחקר האופן שבו איתות חיסוני מווסת את הרגישות לנקע, דיכאון וכתוצאה מכך למיגרנה.