במבחנה מערכת לחקר תרדמת גידול ואת החלף ל גידול גרורתי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לצפות בזמן אמת ובסביבת תפוקה גבוהה (high throughput) בהשפעה של חומרים פוטנציאליים על רדמנות של תאי גידול ו/או על היציאה מרדמנות של גידול, באמצעות בדיקת in vitro הבאה למידול רדמנות גידולים או המעבר לצמיחה גרורתית. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול של תאי גידול רדומים ו/או גרורתיים בתרבית תלת-ממדית של תמצית ממבס בסיסי (basement membrane extract), או מערכת BME המותאמת לפלטפורמת פלטה של 96 בארות. כאשר הם מגודלים במערכת ה-3D, תאים גרורתיים נכנסים לשלב זמני של רדמנות או שבירה (quiescence).

לעומת זאת, תאי גידול הרדומים in vivo נכנסים למצב ממושך של שקיטה (quiescence). במערכת תרבית תלת-ממדית, ניתן לטפל בתאים גרורתיים בחומרים מועמדים כדי למנוע את המעבר שלהם משקיטה להתרבות. מנגד, ניתן לטפל בתאי גידול רדומים בחומרים מועמדים שעשויים להשרות את המעבר שלהם משקיטה להתרבות.

את התנהגות הפroliferation של התאים הרדומים והגרורתיים כתוצאה מהטיפול יעריכו באמצעות הוספת ערכת בדיקת שגשוג תאים cell titer 96 aqueous one solution cell proliferation assay kit בנקודות הזמן הרצויות לניתוח באמצעות קורא לוחות ELISA. התוצאות המתקבלות מראות את השפעת הטיפול על שגשוג תאים של תאי גידול רדומים או גרורתיים, בהתבסס על בדיקת שגשוג תאים במערכת תלת-ממדית (3D). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הגרורות, כגון אילו גורמים ומנגנונים תאיים משמרים תאי גידול מפוזרים במצב רדום, ואילו גורמים ומנגנונים תאיים משרים את המעבר מרדום של הגידול לגרורה קלינית.

יש להשרות את ה-BME עם גורמי גדילה במקרר בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה שלפני ביצוע בדיקת השגשוג. לאחר מכן, ביום הבדיקה, יש לבחור בתרבית תאי גידול רדומיים או גרורתיים עבור הניסוי. לאחר מכן, הנח פלטת 96 בארות על מגש קרח בתוך מנדף כימי.

לאחר מכן, השתמשו במפיץ עם מזרק כדי לצפות כל באער של הפלטה ב-50 µL של BME שהופשר והוא קר מאוד. ודאו שלא נוצרו בועות בבאערים, והניחו את פלטת 96 הבאערים המצופה ב-BME באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. במקביל, הניחו בקבוק של trypsin בטמפרטורה של 37 °C כדי שיתחמם בזמן שהפלטה המצופה ב-BME דוגרת.

שאבו את המצע מתאי הגידול. שטפו את צלחות התרבית ב-10 milliliters של PBS. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS והוסיפו שתי milliliters של טריפסין שחומם מראש לצלחות התרבית.

דגרו את הצלחות למשך חמש דקות. הוסיפו חמישה מיליליטר של DMEM high glucose, המועשר ב-10% FCS ואנטיביוטיקה, לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. במהלך זמן זה.

לאחר הדגירה, העבירו את התאים שהופרדו למבחנה של 15 milliliter וספרו את התאים. לאחר מכן, סובבו את סך התאים המיועדים לתרבית בצנטריפוגת תרביות רקמה במשך חמש דקות ב-1500 G בטמפרטורת החדר. שאבו בזהירות את הנוזל.

השאירו כמות קטנה של מצע, שכן ברוב המקרים המשקע אינו נראה לעין. לאחר מכן, הקפישו את תחתית המבחנה כדי להבטיח קבלת תרחיף תאים בודדים. לאחר מכן, השביו את המשקע ב-100 microliters של מצע בדיקה עבור כל 2×10³ תאים.

טרטרו את התאים מספר פעמים באמצעות פיפט של 5 mL כדי להבטיח שמירה על תליה של תאים בודדים. פזרו 100 µL של תליית תאים לכל באר לתוך פלטת 96 באערים מצופה BME עבור פלטת בקרת הפחתת רקע. הוסיפו 100 µL נוספים של מצע בדיקה לכל באר למספר קטן של באערים בלבד בפלטת 96 הבאערים מצופה BME. לאחר מכן דגרו את הפלטות, שאבו את המצע הישן והזינו את התאים במצע בדיקה חדש מדי ארבעה ימים.

כדי להעריך את שגשוג התאים, הוסף לכל באער בלוח של 96 באערים המנותח בנקודת הזמן הניסויית הרצויה 20 microliters של תמיסה מימית של cell titer 96 מתוך ערכה לבדיקת שגשוג תאים. דגרי את הלוחות למשך שעתיים. לאחר מכן, באמצעות קורא לוחות ELISA, רשום את הבליעה של הבאערים הניסויים ובאערים הרקע ב-490 nanometers כהכנה לבדיקה אימונופלואורסצנטית.

צביעה של מולקולות העברת אותות תאיים ותאי גידול. הפשיר BME במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לילה לפני היום שבו תבוצע הצביעה. ביום הצביעה, הנח מערכת של שקופיות זכוכית בעלות שמונה תאים על מגש קרח בתוך מנדף כימי. לאחר מכן, השתמש בפיפט של 200 microliter כדי לצפות כל באר במערכת שקופיות הזכוכית ב-50 microliters של BME קר מאוד.

וודאו שה-BME מפוזר באופן אחיד ושלא נוצרו בועות בבארות. דגרו את השקופיות המצופות למשך 20 דקות. בחרו שורת תאי גידול רדומה או גרורתית.

קצור את התאים באמצעות טריפסין כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, רכז את סך התאים המיועדים לתרבית במבחנה קונית של 15 מיליליטר. כעת סובב את התאים בצנטריפוגה, שאב את העלייה בזהירות פעם נוספת, והשאר מעט מתווך.

כדי לפרק את המשקע, דפקו על תחתית המבחנה הקונית בנפח 15 milliliter לקבלת תרחיף של תאים בודדים. השביו את המשקע ב-400 microliters של מצע בדיקה עבור כל 5×10³ תאים. בצעו טריטורציה של התאים מספר פעמים באמצעות פיפט של 5 milliliter כדי להבטיח את השמירה על תרחיף התאים הבודדים; העבירו 400 microliters מתמיסת התאים לכל באר בכל אחת משמונה התאים המצופים ב-BME.

לאחר מכן דגרו את מערכת הלמינתיות (glass slide system), שאבו את המצע הישן והזינו את התאים במצע בדיקה חדש בכל ארבעה ימים בנקודות הזמן הניסיוניות הרצויות. שאבו את השכבה העליונה של המצע והוסיפו 200 µL של מקבע (fixative) מועשר ב-tritton ודגרו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן שאבו את המקבע המועשר ב-triton והוסיפו 200 µL של מקבע בלבד ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות נוספות.

שאבו שוב את חומר הקיבוע והוסיפו כעת 400 µL של PBS לכל באר. דגרו את הפלטה למשך 10 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS והוסיפו 400 µL של PBS המכיל 0.05% בין 20 לדגירה למשך 10 דקות נוספות.

גם בטמפרטורת החדר. כעת חסמו את התאים המקובעים באמצעות 200 microliters של תמיסת חסימה. לאחר מכן דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך שעה; לאחר הדגירה, שאבו את תמיסת החסימה והוסיפו לכל אחד 200 microliters של נוגדן ראשוני המדולל בתמיסת חסימה.

דגרו את השקופיות עם הנוגדן הראשוני למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, שאבו את הנוגדן, ולאחר מכן שטפו את הבארות שלוש פעמים על ידי הוספת 400 µL של PBS למשך 15 דקות ושאיבת התמיסה לאחר כל פעולה. לאחר שאיבת ה-PBS מהשטיפה האחרונה, הוסיפו 200 µL של נוגדן משני המצומד ל-rod domine red.

לאחר מכן, כסו את מערכת השקופיות בעלת שמונה התאים בנייר אלומיניום והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הבארים שלוש פעמים ב-PBS כפי שבוצע קודם לכן, ולאחר השטיפה השלישית, בצעו הרכבה של השקופיות בתווך הרכבה beta shield עם dpi.

לבסוף, ייבשו את השקופיות במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר בחשיכה. דוגמה של ניתוח פרוליפרציה של תאי גידול רדומים מסוג D 2.0 R ותאי גידול גרורתיים מסוג D two A one בתרבית תלת-ממדית (3D) מוצגת כאן. תאי D 2.0 R נשארים רדומים לאורך כל תקופת התרבית הניסויית שנמשכה 14 יום, בעוד שתאי D two A one הגרורתיים מאוד נשארים רדומים רק למשך ארבעה עד שישה ימי תרבית, שלאחריהם הם מתחילים להתרבות במהלך שלב הרדמיות הראשוני.

תאים רבים נותרים בודדים בתרבית התלת-ממדית, כפי שניתן לראות כאן בתמונה מייצגת של תרבית ביום הרביעי, בעוד שתאים שאינם מתרבים אחרים יוצרים מבנים רב-תאיים. המעבר של תאי D two A one ממצב רדום למצב של התרבות בתרבית תלת-ממדית מוצג כאן בתמונה זו של תרבית ביום ה-12. מעבר זה כרוך בשינויים דרמטיים במורפולוגיית התאים, כפי שמוצג באיור זה.

דוגמה לסוכן המונע מתאי D two A one לעבור ממצב רדום למצב פרולפרטיבי מוצגת בטיפולים של תאי D two A one עם מעכב ספציפי נגד myosin light chain kinase. שמירה של תאי D two A one במצב רדום כפי שמוצג באיור זה. עלייה משמעותית ב-phosphorylation של myosin light chain בתאי D two A one באדום, ואחריה ארגון מחדש של סיבי F actin היוצרים סיבי דחף (stress fibers) של actin בירוק, מתרחשת במהלך המעבר שלהם מרדמה בימים 1 עד 4 לפרולפרציה.

יום שבע. עם זאת, חסימת הפעילות של myosin light chain kinase בתאי D two A one באמצעות SHRA או באמצעות התרופה ML seven, שומרת על תאי D two A one במצב רדום ומובילה לעיכוב של הפספורילציה של myosin light chain, ושל ארגון F act וסיבי מאמץ (stress fibers), כפי שנראה כאן. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להקים את מערכת המודל in vitro לחקר רדומות של גידולים והמעבר לצמיחה גרורתית.