Name: עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: למד ליצור מודל עור תלת ממדי האדם לחקר מלנוציטים, מלנומה ותאי גזע עוריים. שיטה זו משלבת קולגן, פיברובלסטים וקרטינוציטים עם ניתוח אימונוהיסטוכימי לבחינת התנהגות תאים ופיתוח תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מתקן המכון Wistar בעלי חיים, מתקן מיקרוסקופית, מתקן Histotechnology ואספקה ​​מרכז המחקר. המחקר מומן בחלקו על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות ע&quot;א 076674, קליפורניה 098101, 025874 ו - CA CA 10815.

<ol><li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).</li>
<li>Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+3D+cell+culture+system+for+investigating+cell+interactions+with+electrospun+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers.</a> Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).</li>
<li>Kremer, M., Lang, E., Berger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypical+engineering+of+differentiated+composite-skin+equivalents+of+human+keratinocytes+in+a+collagen-GAG+matrix+%28INTEGRA+Artificial+Skin%29+in+a+perfusion+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system.</a> Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).</li>
<li>Escámez, M. J., Garcí, M., Larcher, F., Meana, A., Muñoz, E., Jorcano, J. L., Del Río, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).</li>
<li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).</li>
<li>Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs%3A+biological+significance+of+bFGF%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF.</a> Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).</li>
<li>Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+BRAF+mutation+and+p53+inactivation+during+transformation+of+a+subpopulation+of+primary+human+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes.</a> Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).</li>
<li>Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLX4032%2C+a+potent+inhibitor+of+the+B-Raf+V600E+oncogene%2C+selectively+inhibits+V600E-positive+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).</li>
<li>Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+selective+inhibitor+of+oncogenic+B-Raf+kinase+with+potent+antimelanoma+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תיארנו יצירת עור 3D משחזר עם מלנוציטים אדם נורמלי, לתאי גזע עורי ותאי מלנומה. כאשר גדל בתרבות monolayer, תאים melanocytic להציג מורפולוגיה דומה (שטוח, כישור או יותר דנדריטים בצורת), ללא קשר למוצאם של השלב הקליני. לעומת זאת, עור 3D משחזר לשחזר הבמה מאפיינים ספציפיים של תאים מלנומה. מלנוציטים אדם רגיל מתגוררים בבית ממברנות במרתף בין שכבות האפידרמיס ואת עורי כמו תאים בודדים. תאים RGP מלנומה ראשונית לגדול בקבוצות קטנות לאורך הממברנה במרתף בעוד יותר אגרסיביים תאים VGP מלנומה לגדול ככל אשכולות גדולים שבירת דרך הממברנה אל תוך מרתף בדרמיס. בתאי מלנומה גרורתית לגדול לכל הכיוונים לפלוש עמוק לתוך הדרמיס כמו תאים או אשכולות יחיד. ניתוח כמותי יכול להתבצע על המודל הזה על ידי מדידת עומק הפלישה והיקף התפוצה. בנוסף ואפיון של תאים ממאירים melanocytic נורמלי, באמצעות מודל שאנחנו יכולים לגרום ישירות התמיינות בתאי גזע עורי לתוך מלנוציטים התבגר, אשר בבית אל שכבת הבסיס של האפידרמיס ליצור תקשורת בתום לב עם קרטינוציטים דרך upregulation של E-cadherin ( 6). באמצעות וקטורים ויראליים, אנו מסוגלים גם להפעיל או להשבית פונקציה גן הבנה טובה יותר של הדינמיקה ואת משמעות תפקודית של גנים לידי ביטוי כל סוג תא העור משחזר, אשר מבטיח להיות מודל יעיל ללמוד לא רק על מנגנוני טרנספורמציה של מלנוציטים , אלא גם התקדמות של מלנומה (8). לטווח ארוך של התבוננות פנוטיפים הסלולרי הפך אפשרי באמצעות השתלת עור משחזר לבעלי חיים immunodeficient. אדם כזה העור עכבר הכימרה היא כלי מחקר מעולה ללמוד melanomagenesis וגרורות מלנומה. העור משחזר יכול להיות גם פלטפורמה יעילה להערכת תרופות. תרופות רבות אשר לחסל תאים סרטניים בתנאי תרבות 2D לעיתים קרובות יש השפעה מועטה ביישומים הניסוי הקליני. כפי שניתן לראות בגידול vivo, בתאי מלנומה בתרבויות 3D הם לעתים קרובות עמידים לתרופות אשר התאים בתרביות 2D להגיב, מה שמראה כי microenvironment מודולציה מסלולי איתות מלנומה. לגילוי סמים מוצלח, העור לשחזר מודל 3D הוא כלי אידיאלי פרה לחזות את ההשפעות של תרכובות in vivo (9,10). לסיכום, העור לשחזר מודלים לגשר על הפער בין במבחנה במחקרים vivo. הם יובילו להבנה טובה יותר של אילו גנים מעורבים טרנספורמציה וכיצד בתאי גזע לתרום השינוי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> 10x EMEM </td><td> ביו וויטאקר </td><td> 12-684F </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> Hyclone </td><td> SH-30,071.02 </td></tr><tr><td> גיד שור חומצה חולץ קולגן </td><td> Organogenesis </td><td> 200/50 </td></tr><tr><td> תרביות רקמה של 6 גם מגשים עם תוספות </td><td> Organogenesis </td><td> 9285 </td></tr><tr><td> Keratinocyte בינונית חינם סרום </td><td> Gibco </td><td> 17005042 </td></tr><tr><td> Dialyzed עגל עוברית סרום </td><td> Hyclone </td><td> SH-30,079.03 </td></tr><tr><td> רקומביננטי גזע אנושיים Cell Factor </td><td> פיצג&#39;רלד תעשיות </td><td> RDI-307-255X </td></tr><tr><td> יסוד FGF </td><td> פיצג&#39;רלד תעשיות </td><td> 30R-AF015 </td></tr><tr><td> אנדותלין-3, אדם </td><td> האמריקאי פפטיד ושות </td><td> 88-5-10 </td></tr><tr><td> סידן כלוריד </td><td> סיגמא </td><td> C-7902 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> JRH מדעי החיים </td><td> 56430-10L </td></tr><tr><td> F12 (HAM של) </td><td> Gibco </td><td> 11765-54 </td></tr><tr><td> הידרוקורטיזון </td><td> סיגמא </td><td> H-0888 </td></tr><tr><td> אינסולין, transferrin, Ethanolamine, סלניום (ITES) </td><td> BioWhittaker </td><td> 17839Z </td></tr><tr><td> O-Phosphorylethanolamine </td><td> סיגמא </td><td> P0503 </td></tr><tr><td> אדנין </td><td> סיגמא </td><td> A9795 </td></tr><tr><td> הפרוגסטרון </td><td> סיגמא </td><td> P-8783 </td></tr><tr><td> Triiodothyronine </td><td> סיגמא </td><td> T-5516 </td></tr><tr><td> סרום סובך של יילוד </td><td> Hyclone </td><td> SH3011802 </td></tr><tr><td> חיץ 10% פורמלין </td><td> Surgipath </td><td> 00600 </td></tr><tr><td> טמפרטורה אופטימלית חיתוך קפוא התקשורת (אוקטובר) </td><td> סאקורה </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Multi קלטות </td><td> Surgipath </td><td> 02293-BX </td></tr><tr><td> TBS ביופסיה ניירות </td><td> משולש למדעי ביו </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> TBS ביופסיה ניירות </td><td> משולש למדעי ביו </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> מאגר תבניות חד פעמיות </td><td> דיג </td><td> 15-182-501C </td></tr><tr><td> הבנזואין מתחם תמיסת </td><td> Disposables Professional, Inc, </td><td> S42450 </td></tr><tr><td> מטליות אלכוהול Prep </td><td> בית המרקחת CVS </td><td></td></tr><tr><td> משי שחורה קלועה 5-0 </td><td> Ethicon </td><td> 682G </td></tr><tr><td> גזה ספוגים (סטרילי) </td><td> בית המרקחת CVS </td><td></td></tr><tr><td> מצבטים </td><td> Roboz </td><td> RS5070 </td></tr><tr><td> איריס מספריים </td><td> Roboz </td><td> RS5913 </td></tr><tr><td> כירורגי להבי </td><td> נוצה </td><td> 2976 </td></tr><tr><td> EZ הרדמה </td><td> Euthanex קורפ </td><td></td></tr><tr><td> SCID עכבר outbred שיער </td><td> צ&#39;ארלס הנהר </td><td></td></tr></tbody></table>

עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

רוב במבחנה בביולוגיה העור ניסיוני נעשו monocultures 2 ממדי (2D), תוך צבירת הראיות עולה כי התאים מתנהגים באופן שונה כאשר הם גדלו בתוך מטריצה ​​חוץ תאית 3D וגם אינטראקציה עם תאים אחרים (1-5) . מודלים עכבר כבר נוצלו בהרחבה ללמוד המורפוגנזה רקמה in vivo. עם זאת העכבר העור האנושי יש הבדלים משמעותיים בארכיטקטורה הסלולר פיזיולוגיה, אשר מקשה להסיק מחקרים העכבר לבני אדם. מאז מלנוציטים בעור עכבר מרוכזים בעיקר בזקיקי השיער, יש להם מאפיינים ביולוגיים שונים מאלה של בני אדם, אשר לאתר בעיקר בשכבת הבסיס של האפידרמיס. ההתפתחות האחרונה של העור האנושי לשחזר מודלים 3D אפשרה את השדה כדי לחקור תאים מטריקס תאים תאים אינטראקציות בין תאים מסוגים שונים. משחזר מורכב &quot;הדרמיס&quot; עם fibroblasts מוטבע קולגן אני מטריקס, &quot;האפידרמיס&quot;, אשר מורכבת, מרובדת קרטינוציטים מבודל קרום במרתף פונקציונלי, המפריד בין הדרמיס לאפידרמיס. קולגן מספק פיגומים, אספקת חומרי מזון, ואת הפוטנציאל לאינטראקציה התא אל התא. העור מודלים 3D המשלב תאים melanocytic לשחזר את המאפיינים הטבעיים של הומאוסטזיס מלנוציט והתקדמות מלנומה בעור האדם. כפי in vivo, מלנוציטים בעור משוחזר מרוכזים בבית קרום המרתף וביניהם קרטינוציטים שכבת הבסיס. בתאי מלנומה התערוכה אותם מאפיינים המשקף את שלב הגידול המקורי (RGP, VGP ותאי מלנומה גרורתית) in vivo. לאחרונה, בתאי גזע עורי זוהו בדרמיס אדם (6). אלה רב עוצמה בתאי גזע יכול לעבור האפידרמיס להבדיל כדי מלנוציטים.

בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את העור תלת ממדי לשחזר מודל אשר מחקה העור האנושי באדריכלות הרכב. הפיזיולוגיה מלנוציט, התקדמות מלנומה גורל בתאי גזע עורי נחקרו באמצעות העור לשחזר מודל. המודל שימושית גם ככלי קליני להערכת תרופות.

מרבית המחקרים במבחנה (in vitro) בביולוגיה ניסוייית של העור בוצעו במערכות של מונו-קלטורה דו-ממדית (2D), בעוד שראיות נערמות המצביעות על כך שתאים...

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור שחזור תלת-ממדי של עור אנושי למחקרים של ביולוגיה של מלנוציטים, מלנומה ותאי גזע של העור. דבר זה מושג תחילה על ידי ציפוי של תבנית (insert) של מגשי תרבית רקמות בקולגן בקר מנוטרל. השלב השני הוא יצירת מדור הדרמיס התאי מפיברובלסטים וקולגן.בשלב הבא, הכינו את מדור האפידרמיס מקראטינוציטים מעורבבים עם מלנוציטים או תאי מלנומה. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא קצירת שחזור העור ביום 18 והשתלת שחזור העור בעכבר. לבסוף, ניתוחים אימונוהיסטוכימיים ואימונופלואורסצנטיים של השתל מראים את הארכיטקטורה של עור נורמלי המכיל מלנוציטים, את הנדידה וההבחנה של תאי גזע נורמליים ופנוטיפים של מלנומה ספציפיים לשלב.פיתחנו את מודל שחזור העור לפני 20 שנה מכיוון שגלינו בשלבים מוקדמים של מחקרינו כי מלנוציטים נורמליים או תאי מלנומה המגודלים בצלחת מתנהגים באופן שונה מאוד מתאים שנמצאים בהקשר רקמתי. לכן, מודל שחזור העור הוא אידיאלי עבורנו כדי לראות כיצד תאים נעים ממדור אחד בעור לכל מקום אחר. הכינו מראש את תערובת הקולגן השכבה חסרת התאים על קרח, ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של התמיסה הצהובה-קש לכל תבנית בשישייה.הדגרירו את מגש תרבית הרקמות עם הבארות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לג'ל להתמצק. במהלך זמן זה, צבע התמיסה אמור להשתנות מצהוב לוורוד בעוד הג'ל מתמצק. בצעו טריפסינזציה לתאי human fibroblast מבקבוק התרבית שלהם באמצעות 0.25%trypsin EDTA. לאחר חמש דקות, הוסיפו DMEM המכיל 10%FBS כדי לנטרל את תהליך הטריפסינזציה.אספו את התאים שהסתרו באמצעות סרקיגציה למשך חמש דקות ב-200 G בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן השעיו את התאים בריכוז של 4.5 times 10 to the fifth תאים ל-1.5 milliliters של DMEM המועשר ב-10%FBS. לאחר מכן, מלאו מבחנה של 50 milliliters בתערובת הקולגן של השכבה התאית שהוכנה קודם לכן והניחו את המבחנה על קרח.הוסיפו 1.5 milliliters של תרחיף הפיברובלסטים למבחנה וערבבו היטב. הוסיפו שלושה milliliters של תמיסת השכבה התאית הצהובה-קש לכל תבנית (insert) מצופה בשכבה לא-תאית. לאחר מכן, הדגירו את מגש תרביות הרקמה למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך אינקובטור לתרביות רקמה עם 5% carbon dioxide במהלך תקופת ההדגרה.צבעו של תמיסת השכבה התאית אמור להשתנות גם הוא מצהוב לוורוד. לאחר שהג'ל בשכבה העליונה מתמצק, יש להוסיף שני milliliters של DMEM המכיל 10%FBS לחלק הפנימי של התבנית (insert) במגש תרבית הרקמות, ו-10 milliliters לחלק החיצוני של התבנית. יש לדגור את מגשי תרבית הרקמות למשך ארבעה ימים.בבדיקה ביום הרביעי, כדי לוודא שהג'ל התכווץ ביום הרביעי של הדגירה, שאבו את המצע מהחלק הפנימי והחיצוני של כל תבנית (insert). הוסיפו 2 mL של מצע שטיפה לחלק הפנימי ו-10 mL לחלק החיצוני של התבניות כדי לשטוף את הסרום הרגיל. לאחר מכן, דגרו את המגשים למשך שעה אחת ב-37 °C ליצירת האפידרמיס.ראשית, בצעו טריפסינציה לתאי קרטוציטים אנושיים. לאחר חמש דקות, השתמשו במעכב טריפסין מסויה כדי לנטרל את הטריפסין, לאחר סבוב של התאים שהסתרו במהירות של 200 G למשך חמש דקות. השעיקו שוב את משקע התאים בריכוז של 4.17 × 10⁶ תאים למיליליטר בתוכנית העור.החזר את המצע הראשון לאחר קצירת הקרטינוציטים. בצע עיכול של מלנוציטים אנושיים באמצעות טריפסין למשך דקה עד שתיים. שוב, נטרל את הטריפסין באמצעות מעכב טריפסין מפולי סויה.לאחר מכן, לאחר סבוב של התאים בתנאים זהים לאלו שבוצעו קודם לכן, השביה מחדש את משקע המלנוציטים בריכוז של 8.3 times 10 to the fifth תאים למילליליטר בתוך skin. שחזר גם את medium one. לאחר מכן, הסר את תוכה השטיפה הן מהחלק הפנימי והן מהחלק החיצוני של כל הכנסה (insert) במגש תרבית רקמה שהוכן כשכבה דרמלית.החליפו את תוך השטיפה על ידי הוספת 1.5 milliliters של skin, reconstruct medium לחלק הפנימי ו-10 milliliters לחלק החיצוני של כל insert. לאחר מכן, ערבבו 600 microliters של תרחיף תאי keratinocyte עם 600 microliters של תרחיף melanocyte. העבירו 200 microliters מתרחיף התאים המעורב.טפטפו טיפה אחר טיפה אל תוך כל אינסרט. דגרו את מגש תרבית הרקמה למשך יומיים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר דגירת התאים, שאבו את ה-skin reconstruct medium one הן מהחלק הפנימי והן מהחלק החיצוני של כל אינסרט, ולאחר מכן הוסיפו 2 mL של skin reconstruct medium two לחלק הפנימי ו-10 mL לחלק החיצוני של האינסרט.לאחר מכן, דגרו את השחזורים למשך יומיים נוספים ב-37 °C. לאחר הדגירה השנייה של יומיים, שאבו את ה-skin reconstruct medium two מהחלק הפנימי ומהחלק החיצוני של כל תבנית. כעת, הוסיפו 7.5 milliliters של skin reconstruct medium three לחלק החיצוני בלבד של התבניות.החזיר את השחזורים לאינקובטור והחלף את המצע. החלף את מצע השחזור כל יומיים עד ליום ה-18. ביום ה-18 של הדגירה, שאב את המצע מהחלק הפנימי ומהחלק החיצוני של המבליטים (inserts) במגש תרבית רקמה טעון ברקמה משוחזרת של עור.הסר את ההכנסות (inserts) מהמגש באמצעות פינצטה. גזור את המבנה הכולל את מסנן הפוליקרבונט על ידי שרטוט מעגל קרוב לשוליים בעזרת להב סכין מנתחים. לאחר מכן, הנח את המבנה שובחזר במסנן על משטח קשיח וחתוך אותם לחצי באמצעות הלהב.הניחו מחצית אחת של השחזור על נייר ביופסיה שחור מסוג TBS, ולאחר מכן הכניסו את הנייר לקסטת היסטולוגיה. השרו את הקסטה כולה ב-10% formalin למשך למעלה מארבע שעות. לאחר מכן, העבירו את הקסטה ל-70% ethanol ואחסנו אותה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד עיבוד השחזור להטמעה בפרפין.הנח את החצי השני של הרקמה המשוחזרת ב-50% sucrose בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן, החלף את ה-sucrose לריכוז של two molar ואחסן אותו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים נוספות. מלא תבנית בסיס עד מחציתה ב-optimal cutting temperature, freezing media או OCT.הימנעו מהיווצרות בועות. אחזו בקצה השחזור בעזרת פינצטה והוציאו את השחזור מסוכרוז. הניחו אותו על נייר סופג (Kim wipes) עד לספיגת הסוכרוז.באמצעות פינצטה ושפכטל, העבירו את השחזור אל תוך הסירה שמעל ה-OCT. כסו את החלק העליון של השחזור בעוד OCT עד שהסירה מלאה לחלוטין. שוב, תוך הימנעות מיצירת בועות.הניחו את הסירה באופן אחיד על קרח יבש גרוס כדי לאפשר ל-OCT לקפוא לחלוטין. לאחר מכן, עטפו את תבנית הבסיס בנייר אלומיניום ואחסנו אותה בטמפרטורה של minus 70 °C עד למועד החיתוך באמצעות קריוסטט. כדי להתכונן להשתלת שחזור עור בעכבר, מלאו מכל בחנקן נוזלי והוסיפו 5 mL של DMEM לשפופרת של 50 mL.מלאו כלי כימי ב-600 milliliters של מי ברז והניחו את הכלי על פלטה מחממת לחימום. לאחר מכן, בחרו עכברה נקבה מסוג skid hairless outbred בגיל של כשישה שבועות. הרדימו את העכברה באמצעות isof fluorine.השתמשו במסיכת אף כדי לשמור על ההרדמה לאורך הפרוצדורה. מרחו חומר סיכוך עיני סטרילי וספקו תמיכת חימום למניעת היפותרמיה. לאחר מכן, נקו את עור העכבר באמצעות תמיסת בנזואין (compound benzoin tincture) וסבוני אלכוהול.סמנו קו על גב העכבר כדי לשמור על אותו מיקום לצורך תפרים מאוחרים יותר. צרו פצע עגול על גב העכבר באמצעות מספרי איריס ופינצטה, ולאחר מכן כסו את אזור הפצע בספוגי גזה סטריליים. העבירו את פיסת עור העכבר העגולה למבחנה של 50 milliliter המכילה DMEM.טבל את המבחנה במיכל חנקן נוזלי עד שכל המדיום והרקמה קפואים לחלוטין. לאחר מכן, הפשר את המבחנה בכלי זכוכית עם מים חמים עד להפשרה מלאה. חזור על תהליך ההקפאה וההפשרה זה שלוש פעמים.השתמשו בלהב כירורגי כדי להפריד את השחזור העורי מהתבנית. הסירו את הממברנה בזהירות רבה ולאחר מכן העבירו את השחזור העורי לחלקו העליון של מיטת הפצע בעכבר. כעת, הניחו את עור העכבר מעל השחזור העורי.ודא שהתפר הראשון נמצא מעל הסימון שסומן קודם לכן ושהשני נמצא למטה. לאחר מכן, השתמש בשני תפרים נוספים בצדדי שחזור העור כדי לקבע את עור העכבר. נקה את עור העכבר לאחר ההשתלה, ולאחר מכן העבר את העכבר לכלוב חדש.ביום 18. האפידרמיס של השחזור העורי מורכב משכבות קרטונוציטים מרובדות, כאשר השכבה הבזאלית שאינה מובחנת והשכבות המובחנות שבאות אחריה oriented באופן אנכי. צביעת חתך של השחזורים באמצעות סמן למלנוציטים.S 100, כפי שמודגש על ידי החצים השחורים, מראה כי המלנוציטים מסודרים בשכבה הבזאלית של האפידרמיס ומתקשרים עם מספר קרטינוציטים באמצעות שלוחות דנדריטיות. המדור הדרמלי מכיל פיברובלסטים המשובצים במטריקס של קולגן מסוג one; קולגן four ששקע מצביע על קרומי הבסיס, המפריד בין האפידרמיס לדרמיס. הדמויות הבאות ממחישות כיצד מתפתחות שכבות מרובות של קרטינוציטים באפידרמיס.כאשר תאי גזע דרמליים המסומנים באמצעות וקטור לנטי-ויראלי GFP מוטמעים עם פיברובלסטים במטריקס של קולגן מסוג one, הם נודדים לאפידרמיס ומבדילים למלנוציטים ביום החמישי. לאחר זריעת קרטינוציטים, תאים בודדים מתחילים לנדוד החוצה מהספירות.שימו לב שהאפידרמיס עדיין מורכב משכבה אחת. ביום השמיני, מספר תאים מגיעים לממשק שבין האפידרמיס לדרמיס.ביום ה-10, תאים חיוביים ל-GFP מסודרים בצורה הדוקה במיקום של קרומי הבסיס, כפי שניתן לראות כאן. תאים חיוביים ל-GFP שנדדו לאפידרמיס מבטאים את הסמן המלנוציטי HMB 45. כאשר שורות תאי מלנומה משלבים שלבים שונים של התפתחות בתוך שחזורי עור, התנהגות התאים משקפת את מאפייניהם in vivo.באיור זה ניתן לראות מלנוציטים נורמליים ותאי מלנומה שגודלו בתרביות דו-ממדיות (2D). המיקום וקצב הצמיחה של מלנוציטים נורמליים מבוקרים בקפידה בשחזורי עור כפי שניתן לראות כאן; בשלב הצמיחה הרדיאלית (radial growth phase), מלנומות ראשוניות שגשוגן הוא בעיקר באפידרמיס, בעוד שמלנומות בשלב הצמיחה האנכית (vertical growth phase) גדלות באופן פולשני אל תוך הדרמיס, כפי שניתן לראות באיור זה. לבסוף, ניתן לראות כאן את האופן שבו מלנומות גרורתיות פולשות באגרסיביות לעומק הדרמיס.המחקרים שלנו בעור נורמלי מספקים את הבסיס להבנה טובה יותר של התפתחות והתקדמות המלנומה.

the-three-dimensional-human-skin-reconstruct-model-tool-to-study

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול המפורט ליצירת שחזורי עור אורגנוטיפיים תלת-ממדיים במבחנה לחקר התקדמות המלנומה. מודל עור זה מחקה הן את הארכיטקטורה והן את המורכבות הרב-תאית של איברים in vivo.

יצירת שחזורי עור מלא אורגנוטיפיים: הליך לביסוס מודל עור תלת ממדי באמצעות דגימות עור אנושיות

הסרטן הוא תהליך כרוך אינטראקציות בין תאים סרטניים וmicroenvironment הסרטן. כדי לנתח את האירועים המולקולריים, צריך לבודד את אוכלוסיות תאים שונות בשלבים שונים במהלך התפתחות הסרטן. שימוש במודל עכבר לקרצינומה של תאי בסיס, אנו מתארים פרוטוקול עבור ניתוחי תא במהלך היווצרות הסרטן.

ניתוח אוכלוסיית תאים בעור Carcinogenesis

המטרה של פרוטוקול זה היא לבנות עור תלת מימדי בעובי מלא, הדומה לעור טבעי. עם מכשיר פציעה אוטומטי שנבנה במיוחד, ניתן ליצור פצעים מדויקים וניתנים לשחזור תחת שמירה על סטריליות.

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

אנו מציגים פרוטוקול להשיג מטריצות תאים שמקורם עשירות בחלבונים תאים מטריקס, באמצעות crowders macromolecular (MMC). בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול אשר משלב MMC בדור העור 3D organotypic שיתוף התרבות, אשר מקטין את זמן תרבות תוך שמירה לפדיון של מבנה.

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת 3D organotypic מלנומה ספרואיד העור מודל recapitulates הן את הארכיטקטורה ואת multicellular המורכבות של איברים/גידול של ויוו , אבל באותו זמן מסתגלת שיטתית ניסיוני התערבות.

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לטיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי מחדש באופן ניתן לשחזור וחזק. בנוסף, הוא מאפיין את הקשר המבני-פונקציה של מודל מחסום האפידרמיס. התגובות הביולוגיות של האפידרמיס האנושי המחודש על גירויים proinflammatory מוצגים גם.

טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את הדור ואת הניתוח הנפחי של שווה ערך לעור אנושי וסקולרי באמצעות טכניקות נגישות ופשוטות לתרבות ארוכת טווח. ככל האפשר, הרציונל לצעדים מתואר כדי לאפשר לחוקרים את היכולת להתאים אישית בהתבסס על צרכי המחקר שלהם.

דור של שווה ערך לעור אנושי בהרכבה עצמית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתיל עור אנושי בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים (NOD)-scid interleukin-2 קולטן שרשרת גמא (NSG). בדו"ח נכללים תיאור מפורט של הכנת עור אדם להשתלה, הכנת עכברים להשתלה, השתלת עור אדם בעובי מפוצל והליך התאוששות לאחר ההשתלה.

מודל Xenograft לעור למניפולציה של תגובות חיסוניות אנושיות in vivo

כאן, אנו מציגים הליכים זולים ופשוטים להצגת מודלים שונים של עור תלת ממדי למחקר שגרתי במעבדה לתרביות תאים. חוקרים יכולים ליצור מודלים המותאמים לצרכיהם מבלי להסתמך על מודלים זמינים מסחרית.

בניית מודלים לעור עבור יישומים רבים - החל ממונוקולטורה דו-ממדית (2D) ועד רב-תרבותיות תלת-ממדית (3D)

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מתכתי מוליך מתואר. הגישה שלנו מספק אפיקים חדשים אלקטרוניים מודפסים בודה, אופטו, והתקנים ביו פריסות יוצא דופן בבית microscale.

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מוליך

למד ליצור מודל עור תלת ממדי האדם לחקר מלנוציטים, מלנומה ותאי גזע עוריים. שיטה זו משלבת קולגן, פיברובלסטים וקרטינוציטים עם ניתוח אימונוהיסטוכימי לבחינת התנהגות תאים ופיתוח תרופות.

עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

גלה סרטונים נוספים