עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור שחזור עור אנושי תלת מימדי למחקרים של מלנוציטים, מלנומה וביולוגיה של תאי גזע של העור. זה מושג על ידי ציפוי תחילה של תוספת של מגשי תרבית רקמות בקולגן בקר מנוטרל. השלב השני הוא לייצר את התא העורי מפיברובלסטים וקולגן.

לאחר מכן, הכינו את תא האפידרמיס מקרטינוציטים מעורבבים עם מלנוציטים או תאי מלנומה. השלב האחרון של ההליך הוא לקצור שחזור עור ביום ה-18 ולהשתיל שחזור עור על עכבר. בסופו של דבר, ניתוחים אימונוהיסטוכימיים ואימונו-פלואורסצנטיים של השתל מראים את הארכיטקטורה של עור נורמלי המכיל מלנוציטים, את הנדידה וההתמיינות של תאי גזע נורמליים ופנוטיפים של מלנומה ספציפית לשלב.

פיתחנו את מודל שחזור העור לפני 20 שנה מכיוון שבשלב מוקדם במחקר שלנו מצאנו שמלנוציטים רגילים או תאי מלנומה שגודלו על צלחת מתנהגים בצורה שונה מאוד מתאים שנמצאים בהקשר של רקמה. לכן מודל שחזור העור אידיאלי עבורנו כדי לראות כיצד תאים עוברים מתא אחד בעור לכל מקום אחר. תערובת הקולגן בשכבה האסלולרית שהוכנה בעבר על קרח, ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תמיסת הקש הצהובה לכל תוספת של שש.

ובכן, מגש תרבית רקמות דוגר על המגש למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לג'ל להתמצק. במהלך תקופה זו, התמיסה אמורה לשנות את צבעה מצהוב לוורוד בזמן שהג'ל ממצק את עיני הטריפסין, פיברבלסט אנושי מבקבוק התרבית שלהם עם 0.25% טריפסין EDTA לאחר חמש דקות. הוסף DMEM המכיל 10% FBS כדי לנטרל את תהליך האיזציה.

אסוף את התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב -200 G בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן השהה מחדש את התאים ב -4.5 כפול 10 לתאים החמישיים לכל 1.5 מיליליטר. DMEM בתוספת 10% FBS. לאחר מכן, מלאו צינור של 50 מיליליטר בתערובת הקולגן של שכבת התא שהוכנה בעבר והניחו את הצינור על קרח.

הוסף 1.5 מיליליטר מתרחיף הפיברובלסטים לצינור וערבב.ובכן. הוסף שלושה מיליליטר מתמיסת השכבה התאית הצהובה קש לכל תוספת מצופה שכבה א-תאית. לאחר מכן דגרו את מגש תרבית הרקמה למשך 45 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית רקמות פחמן דו חמצני של 5% במהלך תקופת הדגירה.

צבע תמיסת השכבה הסלולרית צריך להשתנות גם מצהוב לוורוד. לאחר שג'ל השכבה העליונה מתמצק, הוסף שני מיליליטר DMEM המכילים 10% FBS לחלק הפנימי של התוספת במגש תרבית הרקמות, ו-10 מיליליטר לחלק החיצוני של התוספת. דגרו על מגשי תרבית הרקמות למשך ארבעה ימים.

בדיקה ביום הרביעי שהג'ל מתכווץ ביום הרביעי לדגירה שואבים את המדיום הן מבפנים והן מבחוץ של כל תוספת. הוסף שני מיליליטר של מדיום כביסה מבפנים ו -10 מיליליטר לחלק החיצוני של התוספות כדי לשטוף את הסרום הרגיל. לאחר מכן דגרו את המגשים למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס ליצירת האפידרמיס.

טריפסין ראשון הוא קרטינוציטים אנושיים. לאחר חמש דקות, השתמש במעכב טריפסין פולי סויה כדי לנטרל את הטריפסין לאחר סיבוב התאים המנותקים ב-200 גרם למשך חמש דקות. ראוס משהה את כדור התא ב-4.17 כפול 10 לששת התאים למיליליטר בעור.

שחזר את המדיום הראשון לאחר קציר הקרטינוציטים. טריפסין קרח מלנוציטים אנושיים למשך דקה עד שתיים. שוב, נטרל את הטריפסין עם מעכב טריפסין פולי סויה.

לאחר מכן לאחר סיבוב התאים באותם תנאים כמו קודם, השעו מחדש את כדור המלנוציטים ב-8.3 כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר בעור. שחזר גם את המדיום הראשון. לאחר מכן, הסר את אמצעי הכביסה מבפנים ומבחוץ של כל תוספת של מגש תרבית רקמות מוכן בשכבת עור.

החלף את אמצעי הכביסה על ידי הוספת 1.5 מיליליטר עור, מדיום שחזור, אחד מבפנים ו -10 מיליליטר מבחוץ של כל תוספת. לאחר מכן מערבבים 600 מיקרוליטר של תרחיף תאי הקרטינוציטים עם 600 מיקרוליטר של מתלה המלנוציטים. הוצא 200 מיקרוליטר מתרחיף התאים המעורבים.

טיפה אחר טיפה לחלק הפנימי של כל תוספת. דגרו על מגש תרבית הרקמה למשך יומיים בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה של התאים, יש לשאוב את העור, לשחזר מדיום אחד מבפנים ומבחוץ של כל תוספת, ואז להוסיף שני מיליליטר עור, לשחזר מדיום, שניים מבפנים ו-10 מיליליטר מבחוץ של התוספת.

לאחר מכן דגרו על השחזורים למשך יומיים נוספים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר יומיים של הדגירה השנייה יש לשאוב את העור, לשחזר את המדיום שניים מבפנים ומבחוץ של כל תוספת. כעת הוסף 7.5 מיליליטר מהעור, שחזר את מדיום שלוש רק לחלק החיצוני של התוספות.

החזירו את השחזורים לאינקובטור והחליפו את העור. שחזר את המדיום שלוש כל יומיים עד היום ה-18. ביום ה-18 לדגירה יש לשאוב את המדיה מבפנים ומבחוץ של התוספות של מגש תרבית רקמה טעון לשחזר את העור.

הסר את התוספות מהמגש בעזרת מלקחיים. גזרו את המבנה כולל מסנן הפוליקרבונט על ידי מעקב אחר עיגול קרוב לקצה בעזרת להב אזמל. לאחר מכן הניחו את השחזור בפילטר על משטח קשה וחתכו אותם לשניים בעזרת הלהב.

הניחו מחצית מהשחזור על נייר ביופסיה שחור של TBS, ולאחר מכן הניחו את הנייר בקלטת היסטולוגיה. משרים את כל הקסטה בפורמלין 10% למשך יותר מארבע שעות. לאחר מכן הניחו את הקסטה באתנול 70% ואחסנו אותה בארבע מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכן לעבד את השחזור להטמעת פרפין.

הניחו את החצי השני של השחזור ב-50% סוכרוז בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן החליפו את הסוכרוז לשתי טוחנות ולאחר מכן אחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים נוספות. מלאו תבנית בסיס באמצע הדרך בטמפרטורת חיתוך אופטימלית, אמצעי הקפאה או OCT.

הימנע מבועות. אחזו בקצה השחזור בעזרת מלקחיים והוציאו את השחזור מהסוכרוז. מניחים אותו על מגבוני קים עד שהסוכרוז נספג.

בעזרת מלקחיים ומרית, העבירו את השחזור לסירה על גבי ה-OCT. כסו את החלק העליון של השחזור בעוד OCT עד שהסירה מלאה לחלוטין. שוב, הימנעות מבועות.

הנח את הסירה באופן שווה על קרח יבש כתוש כדי לאפשר ל-OCT לקפוא לחלוטין. לאחר מכן עוטפים את תבנית הבסיס ונייר הכסף ומאחסנים אותה במינוס 70 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכן לחתוך אותה עם קריוסטט. כדי להתכונן להשתלת שחזור עור על עכבר, מלאו מיכל בחנקן נוזלי והוסיפו חמישה מיליליטר DMEM לצינור של 50 מיליליטר.

מלאו ב-600 מיליליטר מי ברז והניחו את הכוס על גבי פלטה חמה לחימום. לאחר מכן בחר נקבת עכבר החלקה חסר שיער בסביבות גיל שישה שבועות. לאחר הרדמת העכבר עם איזוף פלואור.

השתמש בקונוס אף כדי לשמור על ההרדמה לאורך כל ההליך. מרחו חומר סיכה עיניים סטרילי וספקו תמיכה בחום למניעת היפותרמיה. לאחר מכן, נקה את עור העכבר עם תמיסת בנזואין מורכבת וספוגיות הכנה לאלכוהול.

סמן קו על גבי גב העכבר כדי לשמור על אותו מיקום לתפירה מאוחרת יותר. חותכים מצע פצע עגול על גב העכבר בעזרת מספריים ומלקחיים לקשתית ואז מכסים את מיטת הפצע בספוגי גזה סטריליים. הכניסו את עור העכבר העגול לשפופרת של 50 מיליליטר של DMEM.

טבלו את הצינור במיכל חנקן נוזלי עד שכל המדיה והרקמות קפואות לחלוטין. לאחר מכן, הפשירו את הצינור בכוס מים חמים עד להפשרה מלאה. חזור על הליך זה, הקפאה והפשרה שלוש פעמים.

השתמש בלהב כירורגי כדי לנתק שחזור עור מתוספת. הסר את הממברנה בזהירות רבה ואז העביר את שחזור העור לחלק העליון של מיטת הפצע של העכבר. כעת, הנח את עור העכבר על גבי שחזור העור.

ודא שהתפר הראשון נמצא על גבי הסמן שסומן קודם לכן ושהשני נמצא בתחתית. לאחר מכן השתמש בשני תפרים נוספים בצידי שחזור העור כדי לתקן את עור העכבר. נקה את עור העכבר לאחר ההשתלה, ולאחר מכן הכניס את העכבר לכלוב חדש.

ביום ה-18. האפידרמיס של שחזורי העור מורכב משכבות קרטינוציטים מרובדות, שכבת הבסיס הלא מובחנת והשכבות המובחנות ברצף מכוונות אנכית. צביעת קטע השחזורים בטוש המלנוציטי.

S 100 כפי שמצוין על ידי החיצים השחורים, מראה כי מלנוציטים מיושרים בשכבת הבסיס של האפידרמיס ומתקשרים עם קרטינוציטים מרובים באמצעות הרחבות דנדריטים. התא העורי מכיל פיברובלסטים המשובצים במטריצת קולגן מסוג 1 קולגן שהופקד ארבע מציין את קרום הבסיס, המפריד בין האפידרמיס לדרמיס. האיורים הבאים ממחישים כיצד מתפתחות שכבות מרובות של קרטינוציטים באפידרמיס.

כאשר תאי גזע עוריים המסומנים בווקטור GFP lentiviral משובצים בפיברובלסטים. במטריצת קולגן מסוג 1, הם נודדים לאפידרמיס ומתמיינים למלנוציטים ביום החמישי. לאחר זריעת קרטינוציטים, תאים בודדים מתחילים לנדוד החוצה מהכדורים.

שימו לב שהאפידרמיס עדיין מורכב משכבה אחת. ביום השמיני. תאים מעטים מגיעים לממשק האפידרמיס דרמיס.

ביום 10 תאים חיוביים ל-GFP מיושרים היטב במיקום קרום המרתף כפי שניתן לראות כאן. תאים חיוביים ל-GFP שהועברו באפידרמיס מבטאים את הסמן המלנוציטי HMB 45. כאשר שלבים שונים של קווי תאי מלנומה משולבים בשחזורי העור, התנהגות התאים משקפת את מאפייני ה-in vivo שלהם.

כאן ניתן לראות באיור זה מלנוציטים ותאי מלנומה רגילים הגדלים בתרביות דו-ממדיות. המיקום וקצב הצמיחה של מלנוציטים נורמליים נשלטים היטב בשחזורי עור כפי שניתן לראות כאן, שלב צמיחה רדיאלי, מלנומות ראשוניות מתפשטות בעיקר באפידרמיס, ואילו מלנומות בשלב הצמיחה האנכית צומחות באופן פולשני לתוך הדרמיס כפי שניתן לראות באיור זה. לבסוף, ניתן לראות כאן את האופן שבו מלנומות גרורות פולשות באגרסיביות עמוק לתוך הדרמיס.

המחקרים שלנו בעור רגיל מספקים את הבסיס לידע טוב יותר על התפתחות והתקדמות מלנומה.