עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור שחזור תלת-ממדי של עור אנושי למחקרים של ביולוגיה של מלנוציטים, מלנומה ותאי גזע של העור. דבר זה מושג תחילה על ידי ציפוי של תבנית (insert) של מגשי תרבית רקמות בקולגן בקר מנוטרל. השלב השני הוא יצירת מדור הדרמיס התאי מפיברובלסטים וקולגן.

בשלב הבא, הכינו את מדור האפידרמיס מקראטינוציטים מעורבבים עם מלנוציטים או תאי מלנומה. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא קצירת שחזור העור ביום 18 והשתלת שחזור העור בעכבר. לבסוף, ניתוחים אימונוהיסטוכימיים ואימונופלואורסצנטיים של השתל מראים את הארכיטקטורה של עור נורמלי המכיל מלנוציטים, את הנדידה וההבחנה של תאי גזע נורמליים ופנוטיפים של מלנומה ספציפיים לשלב.

פיתחנו את מודל שחזור העור לפני 20 שנה מכיוון שגלינו בשלבים מוקדמים של מחקרינו כי מלנוציטים נורמליים או תאי מלנומה המגודלים בצלחת מתנהגים באופן שונה מאוד מתאים שנמצאים בהקשר רקמתי. לכן, מודל שחזור העור הוא אידיאלי עבורנו כדי לראות כיצד תאים נעים ממדור אחד בעור לכל מקום אחר. הכינו מראש את תערובת הקולגן השכבה חסרת התאים על קרח, ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של התמיסה הצהובה-קש לכל תבנית בשישייה.

הדגרירו את מגש תרבית הרקמות עם הבארות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לג'ל להתמצק. במהלך זמן זה, צבע התמיסה אמור להשתנות מצהוב לוורוד בעוד הג'ל מתמצק. בצעו טריפסינזציה לתאי human fibroblast מבקבוק התרבית שלהם באמצעות 0.25%trypsin EDTA. לאחר חמש דקות, הוסיפו DMEM המכיל 10%FBS כדי לנטרל את תהליך הטריפסינזציה.

אספו את התאים שהסתרו באמצעות סרקיגציה למשך חמש דקות ב-200 G בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן השעיו את התאים בריכוז של 4.5 times 10 to the fifth תאים ל-1.5 milliliters של DMEM המועשר ב-10%FBS. לאחר מכן, מלאו מבחנה של 50 milliliters בתערובת הקולגן של השכבה התאית שהוכנה קודם לכן והניחו את המבחנה על קרח.

הוסיפו 1.5 milliliters של תרחיף הפיברובלסטים למבחנה וערבבו היטב. הוסיפו שלושה milliliters של תמיסת השכבה התאית הצהובה-קש לכל תבנית (insert) מצופה בשכבה לא-תאית. לאחר מכן, הדגירו את מגש תרביות הרקמה למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך אינקובטור לתרביות רקמה עם 5% carbon dioxide במהלך תקופת ההדגרה.

צבעו של תמיסת השכבה התאית אמור להשתנות גם הוא מצהוב לוורוד. לאחר שהג'ל בשכבה העליונה מתמצק, יש להוסיף שני milliliters של DMEM המכיל 10%FBS לחלק הפנימי של התבנית (insert) במגש תרבית הרקמות, ו-10 milliliters לחלק החיצוני של התבנית. יש לדגור את מגשי תרבית הרקמות למשך ארבעה ימים.

בבדיקה ביום הרביעי, כדי לוודא שהג'ל התכווץ ביום הרביעי של הדגירה, שאבו את המצע מהחלק הפנימי והחיצוני של כל תבנית (insert). הוסיפו 2 mL של מצע שטיפה לחלק הפנימי ו-10 mL לחלק החיצוני של התבניות כדי לשטוף את הסרום הרגיל. לאחר מכן, דגרו את המגשים למשך שעה אחת ב-37 °C ליצירת האפידרמיס.

ראשית, בצעו טריפסינציה לתאי קרטוציטים אנושיים. לאחר חמש דקות, השתמשו במעכב טריפסין מסויה כדי לנטרל את הטריפסין, לאחר סבוב של התאים שהסתרו במהירות של 200 G למשך חמש דקות. השעיקו שוב את משקע התאים בריכוז של 4.17 × 10⁶ תאים למיליליטר בתוכנית העור.

החזר את המצע הראשון לאחר קצירת הקרטינוציטים. בצע עיכול של מלנוציטים אנושיים באמצעות טריפסין למשך דקה עד שתיים. שוב, נטרל את הטריפסין באמצעות מעכב טריפסין מפולי סויה.

לאחר מכן, לאחר סבוב של התאים בתנאים זהים לאלו שבוצעו קודם לכן, השביה מחדש את משקע המלנוציטים בריכוז של 8.3 times 10 to the fifth תאים למילליליטר בתוך skin. שחזר גם את medium one. לאחר מכן, הסר את תוכה השטיפה הן מהחלק הפנימי והן מהחלק החיצוני של כל הכנסה (insert) במגש תרבית רקמה שהוכן כשכבה דרמלית.

החליפו את תוך השטיפה על ידי הוספת 1.5 milliliters של skin, reconstruct medium לחלק הפנימי ו-10 milliliters לחלק החיצוני של כל insert. לאחר מכן, ערבבו 600 microliters של תרחיף תאי keratinocyte עם 600 microliters של תרחיף melanocyte. העבירו 200 microliters מתרחיף התאים המעורב.

טפטפו טיפה אחר טיפה אל תוך כל אינסרט. דגרו את מגש תרבית הרקמה למשך יומיים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר דגירת התאים, שאבו את ה-skin reconstruct medium one הן מהחלק הפנימי והן מהחלק החיצוני של כל אינסרט, ולאחר מכן הוסיפו 2 mL של skin reconstruct medium two לחלק הפנימי ו-10 mL לחלק החיצוני של האינסרט.

לאחר מכן, דגרו את השחזורים למשך יומיים נוספים ב-37 °C. לאחר הדגירה השנייה של יומיים, שאבו את ה-skin reconstruct medium two מהחלק הפנימי ומהחלק החיצוני של כל תבנית. כעת, הוסיפו 7.5 milliliters של skin reconstruct medium three לחלק החיצוני בלבד של התבניות.

החזיר את השחזורים לאינקובטור והחלף את המצע. החלף את מצע השחזור כל יומיים עד ליום ה-18. ביום ה-18 של הדגירה, שאב את המצע מהחלק הפנימי ומהחלק החיצוני של המבליטים (inserts) במגש תרבית רקמה טעון ברקמה משוחזרת של עור.

הסר את ההכנסות (inserts) מהמגש באמצעות פינצטה. גזור את המבנה הכולל את מסנן הפוליקרבונט על ידי שרטוט מעגל קרוב לשוליים בעזרת להב סכין מנתחים. לאחר מכן, הנח את המבנה שובחזר במסנן על משטח קשיח וחתוך אותם לחצי באמצעות הלהב.

הניחו מחצית אחת של השחזור על נייר ביופסיה שחור מסוג TBS, ולאחר מכן הכניסו את הנייר לקסטת היסטולוגיה. השרו את הקסטה כולה ב-10% formalin למשך למעלה מארבע שעות. לאחר מכן, העבירו את הקסטה ל-70% ethanol ואחסנו אותה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד עיבוד השחזור להטמעה בפרפין.

הנח את החצי השני של הרקמה המשוחזרת ב-50% sucrose בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן, החלף את ה-sucrose לריכוז של two molar ואחסן אותו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים נוספות. מלא תבנית בסיס עד מחציתה ב-optimal cutting temperature, freezing media או OCT.

הימנעו מהיווצרות בועות. אחזו בקצה השחזור בעזרת פינצטה והוציאו את השחזור מסוכרוז. הניחו אותו על נייר סופג (Kim wipes) עד לספיגת הסוכרוז.

באמצעות פינצטה ושפכטל, העבירו את השחזור אל תוך הסירה שמעל ה-OCT. כסו את החלק העליון של השחזור בעוד OCT עד שהסירה מלאה לחלוטין. שוב, תוך הימנעות מיצירת בועות.

הניחו את הסירה באופן אחיד על קרח יבש גרוס כדי לאפשר ל-OCT לקפוא לחלוטין. לאחר מכן, עטפו את תבנית הבסיס בנייר אלומיניום ואחסנו אותה בטמפרטורה של minus 70 °C עד למועד החיתוך באמצעות קריוסטט. כדי להתכונן להשתלת שחזור עור בעכבר, מלאו מכל בחנקן נוזלי והוסיפו 5 mL של DMEM לשפופרת של 50 mL.

מלאו כלי כימי ב-600 milliliters של מי ברז והניחו את הכלי על פלטה מחממת לחימום. לאחר מכן, בחרו עכברה נקבה מסוג skid hairless outbred בגיל של כשישה שבועות. הרדימו את העכברה באמצעות isof fluorine.

השתמשו במסיכת אף כדי לשמור על ההרדמה לאורך הפרוצדורה. מרחו חומר סיכוך עיני סטרילי וספקו תמיכת חימום למניעת היפותרמיה. לאחר מכן, נקו את עור העכבר באמצעות תמיסת בנזואין (compound benzoin tincture) וסבוני אלכוהול.

סמנו קו על גב העכבר כדי לשמור על אותו מיקום לצורך תפרים מאוחרים יותר. צרו פצע עגול על גב העכבר באמצעות מספרי איריס ופינצטה, ולאחר מכן כסו את אזור הפצע בספוגי גזה סטריליים. העבירו את פיסת עור העכבר העגולה למבחנה של 50 milliliter המכילה DMEM.

טבל את המבחנה במיכל חנקן נוזלי עד שכל המדיום והרקמה קפואים לחלוטין. לאחר מכן, הפשר את המבחנה בכלי זכוכית עם מים חמים עד להפשרה מלאה. חזור על תהליך ההקפאה וההפשרה זה שלוש פעמים.

השתמשו בלהב כירורגי כדי להפריד את השחזור העורי מהתבנית. הסירו את הממברנה בזהירות רבה ולאחר מכן העבירו את השחזור העורי לחלקו העליון של מיטת הפצע בעכבר. כעת, הניחו את עור העכבר מעל השחזור העורי.

ודא שהתפר הראשון נמצא מעל הסימון שסומן קודם לכן ושהשני נמצא למטה. לאחר מכן, השתמש בשני תפרים נוספים בצדדי שחזור העור כדי לקבע את עור העכבר. נקה את עור העכבר לאחר ההשתלה, ולאחר מכן העבר את העכבר לכלוב חדש.

ביום 18. האפידרמיס של השחזור העורי מורכב משכבות קרטונוציטים מרובדות, כאשר השכבה הבזאלית שאינה מובחנת והשכבות המובחנות שבאות אחריה oriented באופן אנכי. צביעת חתך של השחזורים באמצעות סמן למלנוציטים.

S 100, כפי שמודגש על ידי החצים השחורים, מראה כי המלנוציטים מסודרים בשכבה הבזאלית של האפידרמיס ומתקשרים עם מספר קרטינוציטים באמצעות שלוחות דנדריטיות. המדור הדרמלי מכיל פיברובלסטים המשובצים במטריקס של קולגן מסוג one; קולגן four ששקע מצביע על קרומי הבסיס, המפריד בין האפידרמיס לדרמיס. הדמויות הבאות ממחישות כיצד מתפתחות שכבות מרובות של קרטינוציטים באפידרמיס.

כאשר תאי גזע דרמליים המסומנים באמצעות וקטור לנטי-ויראלי GFP מוטמעים עם פיברובלסטים במטריקס של קולגן מסוג one, הם נודדים לאפידרמיס ומבדילים למלנוציטים ביום החמישי. לאחר זריעת קרטינוציטים, תאים בודדים מתחילים לנדוד החוצה מהספירות.

שימו לב שהאפידרמיס עדיין מורכב משכבה אחת. ביום השמיני, מספר תאים מגיעים לממשק שבין האפידרמיס לדרמיס.

ביום ה-10, תאים חיוביים ל-GFP מסודרים בצורה הדוקה במיקום של קרומי הבסיס, כפי שניתן לראות כאן. תאים חיוביים ל-GFP שנדדו לאפידרמיס מבטאים את הסמן המלנוציטי HMB 45. כאשר שורות תאי מלנומה משלבים שלבים שונים של התפתחות בתוך שחזורי עור, התנהגות התאים משקפת את מאפייניהם in vivo.

באיור זה ניתן לראות מלנוציטים נורמליים ותאי מלנומה שגודלו בתרביות דו-ממדיות (2D). המיקום וקצב הצמיחה של מלנוציטים נורמליים מבוקרים בקפידה בשחזורי עור כפי שניתן לראות כאן; בשלב הצמיחה הרדיאלית (radial growth phase), מלנומות ראשוניות שגשוגן הוא בעיקר באפידרמיס, בעוד שמלנומות בשלב הצמיחה האנכית (vertical growth phase) גדלות באופן פולשני אל תוך הדרמיס, כפי שניתן לראות באיור זה. לבסוף, ניתן לראות כאן את האופן שבו מלנומות גרורתיות פולשות באגרסיביות לעומק הדרמיס.

המחקרים שלנו בעור נורמלי מספקים את הבסיס להבנה טובה יותר של התפתחות והתקדמות המלנומה.