Name: Agrobacterium בתיווך Virus-induced גין השתקת Assay כותנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: למד שתיקת גנים מושתקת בכותנה באמצעות Agrobacterium-mediated VIGS עם וקטור TRV. שיטה זו מאפשרת תצפית בפנוטיפ אלבינו בחלוף שבועיים ומסייעת בחקר תפקוד גנים בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בני הזוג. SP-דינש קומאר חג המולד ליו עבור TRV-VIGS וקטורים, ואת בני הזוג. צ&#39;אק Kenerley, טרי וילר, ג&#39;ים סטר ו Bayer CropScience למתן זרעי כותנה. עבודה זו מומנה על ידי LS-NSF ו-NIH ל PH

1. לגדול שתילי גפן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעו את זרעי הכותנה הגבעות (Gossypium hirsutum) מגוון Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR ו Deltapine 90 בעציצים (7 ס"מ קוטר) המכיל מערבבים מטרו 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הסירים על מגש מכוסה כיפה פלסטיק ב 23 ° C, 120 μE מ -1 S -2 קל, עם photoperiod 12 light/12 שעה שעה חשוך בחדר צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכיפה כאשר שני cotyledons צמחו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשבועיים לאחר מכן, השתמש צמחים עם שתי cotyledons הרחיב באופן מלא עבור assay VIGS. בשלב זה, את העלים האמיתיים עדיין לא הופיעו (איור 1). </li></ol> 2. Construct VIGS וקטור נושאת GrCLA1 ​​גן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את alterados Cloroplastos 1 גן של כותנה (GrCLA1) על ידי PCR עם פריימרים GrCLA1 ​​F-5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'ו GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3 "מספריית cDNA של G. raimondii עלה רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר המוצרים PCR של GrCLA1 ​​עם EcoRI ו KpnI ולהכניס לתוך pYL156 (pTRV-RNA2) וקטור ידי קשירת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך שיבוטים על צלחות אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Kanamycin. בדוק את המבנים על ידי אנזים העיכול הגבלה וסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הפלסמיד לתוך Agrobacterium tumefaciens GV3101 ידי electroporation ולשחזר במדיום נוזלי LB ב 28 ° C. בחר את transformants על צלחות עם LB + Kanamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל) + Gentamycin (25 מיקרוגרם / מ"ל). החיידק יכול להיות מאוחסן גליצרול 25% ב -80 ° C לשימוש לטווח ארוך. </li></ol> 3. בצע VIGS חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לפני, חיסון פס מניות גליצרול קפוא של tumefaciens Agrobacterium נושאת pYL192 (TRV): RNA1, pYL156 (TRV): RNA2 (וקטור לבד) ו pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​על צלחות אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל של Kanamycin ו 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Gentamycin. דגירה צלחות ב 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני חדירת VIGS, בחר לבנות מושבת יחיד עבור כל אחד מן הלוחות לעיל לחסן אותו לתוך 5 מ"ל של מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Kanamycin ו 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Gentamycin; לגדל את תרבית החיידקים על 28 ° C עבור לילה תוף הרים במהירות של 50 סל"ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התרבות לעיל כדי בקבוקון עם 50 מ"ל של מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Kanamycin ו 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Gentamycin, בתוספת 10 mM MES (2 - (4 morpholino), אתאן חומצה sulfonic) ו 20 acetosyringone מיקרומטר. לגדול התרבות ב 28 מעלות צלזיוס למשך לילה שייקר עם מהירות של 50 סל"ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, ספין למטה אגרו תאים חיידקיים בסל"ד 4000 למשך 5 דקות; מחדש להשעות את התרבות חדירה למאגר המכיל 10 mM MgCl 2, 10 mM ו - MES acetosyringone 200 מיקרומטר. התאם את OD 600 של התרבות על 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את התרבות על הספסל בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני חדירת Agrobacterial, אגרוף התחתון של cotyledons של צמחי הכותנה עם מחט 25 G בלי פירסינג דרך cotyledons. אחד או שני חורים (תלוי הרכות של רקמה) היו אגרופים על כל מקטע של טבורית (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים ההשעיה תרבות Agrobacterial של pYL192 (TRV): RNA1 ו pYL156 (TRV): RNA2 או pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​ביחס 1:1; יד לחדור את התערובת מן החלק התחתון של cotyledons באמצעות אתרי ופצע באמצעות 1 מ"ל מזרק מחטים (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצמחים עם כיפה הפלסטיק ולהשאיר את הצמחים שחדרו בטמפרטורת החדר בתנאי אור עמום במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צמחים לחדר עם צמיחה בטמפרטורה של 23 ° C, 120 מ 'אור μE -1 S -2 עם במחזור אור / 12 שעות 12 שעות חושך. </li></ol> הערה: VIGS עובד כאשר הצמחים נמצאים תחת או 23 ° C או החממה (25-28 ° C). כאשר הטמפרטורה נמוכה יחסית (23-25 ​​מעלות צלזיוס), קל יותר עבור חיסון לבין פנוטיפ הוא יותר אחיד, לעומת יותר (28-30 מעלות צלזיוס) או הטמפרטורה נע. כיסוי הצמחים עם כיפה גם עושה VIGS יעיל יותר. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הפנוטיפ השתקה ב 7 ימים חדירה ~ 8 לפרסם. העלים של צמחים נכון מושתקים על ידי pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​החלו להציג את הפנוטיפ לבקן (איור 4). הצמחים שחדרו עם נושאים Agrobacteria pYL156 (TRV): RNA2 לשמש כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את היעילות להשתקת גנים באמצעות בחינת רמת הביטוי של גנים אנדוגניים באמצעות שעתוק לאחור polymerase תגובת שרשרת (RT-PCR) עם RNA שבודד מלאה צמחי הכותנה השתיק. </li></ol> הערה: VIGS-ed צמחים צריך להישמר בתנאי הסגר צמחים הכלול צריך להיות autoclaved שצריך להיפטר לאחר מבחני כמו TRV יש מגוון רחב מארח הוא פתוגן רשומות. 4.נציג תוצאות: כשבועיים לאחר חדירה ביד עם תערובת Agrobacterial, הפנוטיפ לבקן הנגרמת על ידי השתקת GrCLA1 ​​נצפתה בבירור על העלים נכון. יעילות ההשתקה מגיע כמעט 100% בניסויים רבים עם יותר מ 50 צמחים. הצמחים השתיק להציג פנוטיפ לבקן מפוזרים באופן אחיד וחזק מאוד לאחרונה על פיתוח עלים בפסיפס על העלים הבכור (איור 4). <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. שתיל גפן על הבמה שבועיים הישן עם שני cotyledons הרחיב באופן מלא המשמש חדירה Agrobacterial. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> איור 2. ניקוב חורים זעירים על החלק התחתון של cotyledons של צמחי הכותנה באמצעות מחט 25 G כדי להקל על חדירת Agrobacterial. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> איור 3. הסתננות יד של תערובת Agrobacterial לתוך cotyledons כותנה באמצעות אתרי ופצע באמצעות מזרק מחטים <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 4"> איור 4. פנוטיפ אלבינו הופיע VIGS השתיק צמחי הכותנה. ארבעה זנים מוצגים. א) Fibermax 832; B) Phytogen 480WR: C) Phytogen 425RF: D) Deltapine 90.

<ol><li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+sequencing+cotton+%28Gossypium%29+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li>
<li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li>
<li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li>
<li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li>
<li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+expression+of+CLA1%2C+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li>
<li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLA1%2C+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development%2C+is+highly+conserved+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li>
<li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

VIGS הוכח להיות כלי רב עוצמה לניתוח גנומיקה תפקודית על ידי transiently מפילה את הביטוי של גנים אנדוגניים. במחקר זה, פיתחנו Agrobacterium בתיווך VIGS ידי ניצול וקטור TRV מבוססי בינארי. כותנה CLA1 (GrCLA1) גן פותחה כסמן ויזואלי כדי לעקוב אחר יעילות ההשתקה. השגנו בעקביות 100% יעילות השתקת הגן, שהפגינו פנוטיפ לבקן המופיעים העלים נכון כל הזנים שנבדקו, החל חדירה על שבועיים פירסום. עם זאת, CLA1-השתיק צמחי הכותנה כמעט שלא פיתחה לתוך הסיבים או בשלב הזרע, אשר צפוי עקב פגמי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם של ריאגנטים וציוד </th><th> חברה </th><th> קטלוג / מספר סידורי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> רולר תוף </td><td> גלאס, קול, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> אגרו חיידק תרבות </td></tr><tr><td> מדגרה </td><td> שלדון ייצור, Inc </td><td> 01046209 </td><td> אגרו חיידק תרבות </td></tr><tr><td> UV / Vis ספקטרופוטומטר </td><td> Beckman Coulter </td><td> דגם: DU530 </td><td> מדידת OD </td></tr><tr><td> ג&#39;ין Pulser </td><td> BioRad </td><td> דגם: 1652076; סידורי: 154BR3880 </td><td> Electroporation </td></tr><tr><td> Pulser Controller </td><td> BioRad </td><td> דגם: 1652098; סידורי: 232BR4833 </td><td> Electroporation </td></tr><tr><td> Micropulser electroporation קובט </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Electroporation </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;ל מזרק </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> הרכבה של החיידק-אגרו </td></tr><tr><td> מטרו מערבבים 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> גידול שתיל </td></tr><tr><td> טרה קוטה סיר </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> גידול שתיל </td></tr><tr><td> MES monohydrate </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> הסתננות חיץ </td></tr><tr><td> Acetosyringone </td><td> סיגמא </td><td> D134406 </td><td> הסתננות חיץ </td></tr></tbody></table>

agrobacterium בתיווך virus-induced ג&#39;ין השתקת assay כותנה

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

כותנה (Gossypium hirsutum) הוא אחד הגידולים החשובים ביותר בעולם. מאמצים רבים נעשו על הריבוי המולקולרי של זנים חדשים. ניתוח בקנה מידה גדול גן תפקודית כותנה כבר פיגרה רוב מיני הצמחים המודרנית, ככל הנראה בשל גודלו של הגנום, שכפול גנטי polyploidy, מחזור צמיחה סרבנות ארוך לשינוי גנטי 1. כדי להקל על מחקר גנטי גבוה התפוקה / גנומית פונקציונלית כותנה, אנו מנסים לפתח מבחני חולף מהיר ויעיל כדי להעריך את גן פונקציות כותנה. Virus-induced להשתקת גנים (VIGS) היא טכניקה רבת עוצמה אשר פותחה על בסיס לארח את הפוסט תעתיק להשתקת גנים (PTGS) לדכא התפשטות ויראלית 2,3. Agrobacterium בתיווך VIGS יושם בהצלחה במגוון רחב של מינים dicots כגון Solanaceae, ארבידופסיס ומינים קטניות, מינים monocots כולל שעורה, חיטה, תירס, עבור מחקרים שונים גנומית תפקודית 3,4. כפי גישה זו מהיר ויעיל ימנע שינוי הצמח מתגבר יתירות פונקציונלית, הוא אטרקטיבי במיוחד ומתאימה המחקר הגנומי תפקודית מינים כמו יבול הכותנה לא ניתנות לשינוי. במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט של מערכת VIGS Agrobacterium בתיווך כותנה. בין וקטורים ויראליים VIGS מספר, טרטור טבק וירוס (TRV) פולש מגוון רחב של המארחים, והוא מסוגל להתפשט נמרצות ברחבי המפעל כולו עדיין לייצר סימפטומים קלים על hosts5. כדי לבדוק את יעילות השתקה, GrCLA1, גן homolog של Cloroplastos ארבידופסיס alterados 1 גן (AtCLA1) כותנה, כבר משובטים ונוסף וקטור בינארי VIGS pYL156. CLA1 גן עוסקת בפיתוח הכלורופלסט 6, מחקרים קודמים הראו כי ההפסד-of-פונקציה של AtCLA1 הביא פנוטיפ לבקן על העלים נכון 7, מתן סמן ויזואלי מצוין השתקה יעילות. בסביבות שבועיים שלאחר חדירת Agrobacterium, את הפנוטיפ לבקן החלו להופיע על העלים נכון, עם יעילות ההשתקה של 100% כל הניסויים משוכפל. השתקה של ביטוי גנים אנדוגניים אושרה גם על ידי ניתוח RT-PCR. ראוי לציין, השתקה potently יכול להתרחש בכל הזנים שנבדקו, כולל זנים מסחריים שונים גדל בטקסס. זה מהיר ויעיל Agrobacterium בתיווך assay VIGS מספק כלי רב עוצמה עבור ניתוח בקנה מידה גדול מהירה של פונקציות גן ברמת הגנום כולו כותנה.

אנו מציגים את פרוטוקול מפורט עבור Agrobacterium בתיווך וירוס-Induced assay השתקה (VIGS) גנים כותנה. רעשן טבק וירוס (TRV) הנגזרות וקטורים VIGS נפרסו לגרום RNA השתקת GrCLA1 ​​כותנה, Cloroplastos alterados 1 הגן. פנוטיפ לבקן הנגרמת על ידי השתקת GrCLA1 ​​נצפתה בשלב שתיל בתוך 2 שבועות לאחר חיסון.

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

כותנה (*Gossypium hirsutum*) היא אחד הגידולים החשובים ביותר בעולם. השקעות משמעותיות הושקעו בביהור מולקולרי של זנים חדשים. ה...

המטרה הכללית של הליך זה היא לפתח בדיקה של השתקת גנים מושרית על ידי וירוס בתיווך אגרו-בקטריה (Agrobacterium) בכותנה, לצורך חקר תפקודי גנים. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול שתילים של כותנה עד לשלב של 10 ימים עד שבועיים. לאחר מכן, הגן rados 1 של כלורופלסטי הכותנה משתבט לתוך וקטור VIGS המבוסס על tobacco rattle virus.השלב השלישי הוא הכנת תרבימי agrobacterium המכילים את P-T-R-V-R-N-A one ואת P-T-R-V-G-R-C-A one. השלב האחרון הוא הזרקה ידנית של תרבימי ה-agrobacterium לתוך גו அணி של כותנה. לבסוף, ניתן להוכיח השתקה גנית על ידי תצפית על פנוטיפ לבנוני בעלים האמיתיים של צמחי הכותנה כעבור כשבועיים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טרנספורמציה, הוא ש-VIGs מספקת פלטפורמה מהירה ויעילה לחקר תפקוד גנים בכותנה. אף ששיטה זו עשויה להתגלות ככלי רב עוצמה לניתוח מהיר ורחב היקף של תפקוד גנים ברמת הגנום כולו בכותנה, ניתן להחילה גם על מיני גידולים חשובים אחרים. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עשויים להתקשות, מכיוון שהזרקה ידנית של תרביות agrobacterium אל תוך ה-coan של הכותנה היא משימה מאתגרת.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הגנטיקה והגנומיקה של הכותנה, כגון חקר תפקודי גנים. לצורך גידול שתילים של כותנה עבור השתקת גנים מושרית וירוס (virus induced gene silencing), הוסיפו metro mix 700 למספר עציצים בני שבעה סנטימטרים והניחו את העציצים המלאים במגש. לאחר מכן, שתלו זרעים של מספר זני כותנה מסוג upland, כגון fiber max 8 3 2 phyto, gen 4, 2 5, RF phyto, gen four 80 WR, ו-delta pine 90.בכלים שהוכנו, כסו את המגש המכיל את הכלי כיפה פלסטית והכניסו את המגש לחדר גידול, בטמפרטורה של 23 °C, תאורה של 120 µE/m²/s עם פוטו-תקופה של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך. לאחר שלושה עד ארבעה ימים, ברגע שהופיעו שני עלים ראשוניים (cotyledons), הסירו את הכיפה הפלסטית. אפשרו לצמחי הכותנה לגדול במשך כ-10 ימים עד שהצמחים יגיעו לשלב שבו התפתחו שני עלים ראשוניים פרוסים לחלוטין, אך לפני הופעת העלים האמיתיים; בשלב זה הצמחים מוכנים לשימוש בניסוי השתקת גנים מושרית וירוס (virus induced gene silencing).יש לבצע הליכי שיבוט אלה במהלך תקופת השבועיים שבהם צמחי הכותנה מגיעים לשלב הפריסה המלאה. ראשית, הגבירו את הגן GCA1 של הכלורופלסטים של הכותנה מספריית cDNA של רקמות עלים של CACI remondi, באמצעות הפריימרים המסופקים בפרוטוקול הכתוב ובהתאם לנהלי PCR סטנדרטיים. לאחר מכן, בצעו עיכול של תוצר ה-PCR של GCA1 באמצעות EcoR I ו-Kpn I, בהתאם לפרוטוקולים של יצרן האנזימים.בצע ויזואליזציה של תוצר ה-PCR באורך 500 base pair על ג'ל אתניום ברומיד. גזור את הפס והפק את ה-DNA; לigate את תוצר ה-PCR המטוהה אל תוך הווקטור PYL 1 56. באמצעות T four DNA Ligase, בצע טרנספורמציה לתאי e coli קומפטנטיים עם הווקטור המולחם, ולאחר מכן פזר 10 עד 50 µL של התאים שעברו טרנספורמציה על צלחות אגר LBA המכילות 50 µg/mL של kanamycin.הדגרירו את הצלחת למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, בחרו מושבות מהצלחת וגדלו אותן למשך לילה ב-2 mL של מצע LB broth המכיל 50 µg/mL של kanamycin. אספו את החיידקים באמצעות סנטריפוגציה ובצעו הפקות DNA לפי פרוטוקולים סטנדרטיים. כדי לטהר את ה-plasmid DNA, אששו את המבנים (constructs) באמצעות עיכול באנזימי הגבלה וריצוף.לאחר שאישור הנוכחות והכיוון של המקטע המוכנס בווקטור PYL 1 56, בצעו אלקטרופורציה של הפלסמיד אל תוך agrobacterium tumor fas GV 3 1 0 1 והחלימו את התאים במצע נוזלי LB בטמפרטורה של 28 °C. בחרו את התרמיספורמנטים על מצעי אגר LB המכילים 50 µg/mL של kanamycin ו-25 µg/mL של gentamycin. במידת הצורך, ניתן לשמור את החיידקים ב-25% glycerol בטמפרטורה של 80- °C.שלושה ימים לפני ההחדרה, בצעו מריחה של מ 원래י גליצרול קפואים של Agrobacterium tumefaciens הנושאים את PYL 1 9 2 RNA one PY, 1 56 RNA two ו-PY 1 56 RNA two GLA one על צלחות אגר LB עם אנטיביוטיקה; דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 28 °C למשך 24 שעות. למחרת, בחרו מושבה בודדת עבור כל מבנה והחדירו כל מושבה ל-5 mL של מצע LB, המועשר ב-50 µg/mL של Kanamycin וב-25 µg/mL של Gentamycin.גדלו את תרבית החיידקים בטמפרטורה של 28 °C למשך לילה במכשיר שייקר המכוון למהירות של 50 rpm. העבירו את תרבית ה-PYL 1 56 RNA two GLA one ואת תרביות הביקורת לבקבוחים נפרדים המכילים 50 milliliters של מצע LB מועשר ב-50 µg/mL של can mycin ו-25 µg/mL של Gentamycin, בתוספת 10 millimolar MES ו-20 micromolar aceto. Cy Ringy. גדלו את התרבית בטמפרטורה של 28 °C למשך לילה במכשיר שייקר המכוון למהירות של 50 rpm.ביום למחרת, העבירו את התרביות למבחנות צנטריפוגה וסובבו את תאי ה-Agrobacterium ב-4,000 סל"ד למשך חמש דקות. השעיקו מחדש את התרבית בבופר אינפילטרציה המכיל 10 millimolar magnesium chloride, 10 millimolar MES ו-200 micromolar acetosyringone. מדדו את ה-OD 600 של התרבית והביאו אותה לריכוז של 1.5 באמצעות בופר אינפילטרציה. דגרו את התרבית על המדף בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות לפני ביצוע אינפילטרציה של ה-Agrobacterium לעלה.נקב את הצד התחתון של ה-cott leadin בצמחי כותנה באמצעות מחט בכילוב (gauge) 25, מבלי לנקב את ה-cott leadin עד לעברו השני. יש לנקב חור אחד או שניים בכל חלק של ה-Cott Leadin. לאחר מכן, ערבב את תרבית ה-agro bacterial של PYL 1 92 RNA one עם PYL 1 56 RNA two או עם PY 1 56 RNA two GRCA one ביחס של אחד לאחד.לאחר מכן, באמצעות מחט או מזרק של מיליליטר אחד, יש להחדיר את התערובת לחלק התחתון של מוליכי ה-cott דרך החורים הנקובים. כסה את הצמחים בכיפת פלסטיק והשאר את הצמחים שעברו אינפילטרציה בטמפרטורת החדר בתנאי תאורה עמומה למשך הלילה.העבירו את הצמחים לחדר גידול בטמפרטורה של 23 °C, עוצמת תאורה של 120 µEin m⁻² s⁻¹, במחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך. בחנו את הפנוטיפ של השתיקה שבעה עד שמונה ימים לאחר האינפילטרציה לעלים. בנקודה זו, העלים האמיתיים של צמחים שהושתקו על ידי PY 1 56 RNA two GLA one מתחילים להפגין את הפנוטיפ האלבינו.הצמחים שהוחדרו באגרובקטריות הנושאות את RNAi של PYL 1 56 ישמשו כביקורת. יש לאמת את יעילות השתיקת הגנים על ידי בדיקת רמת הביטוי של גנים אנדוגניים באמצעות reverse transcription PCR של RNA, שבודד מצמחי כותנה של ביקורת ומצמחים מושתקים בהתאם לנהלים סטנדרטיים.תמונה זו מציגה זן fiber max 8 3 2 לאחר השתקה גנטית של הגן GLA one המושגית על ידי וירוס. שימו לב לעלים בצבע לבן שבהם התרחשה ההשתקה הגנטית. זן PHYTO four 80 WR מראה גם הוא פנוטיפ אלבינו לאחר השתקה גנטית המושגית על ידי וירוס.באופן דומה, זן phyto 4 2 5 RF זה מציג עלים לבנים במקומות שבהם התרחש השתקה גנטית מושרית וירוס (virus induced gene silencing). לבסוף, תמונה זו מציגה ניסוי מוצלח נוסף של השתקה גנטית מושרית וירוס, הפעם בזני Delta PINE 90. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להוסיף אצטון לתרביות האגרובקטריום לפני השארתן על השולחן למשך שלוש השעות העוקבות לפרוצדורה זו.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון שיבוט ספריית cDNA, כדי להשיב על שאלות נוספות, כמו חקירת תפקודים גנטיים חדשים לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הגנטיקה של צמחים לחקור את תפקוד הגנים ואת תגובת ההגנה למעיקות אביוטיות וביוטיות בצמחי גידול בעלי חשיבות כלכלית. ברגע שנתוני המס זמינים, ניתן להשלים טכניקה זו תוך יומיים עד שלושה ימים אם היא מבוצעת כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה מעמיקה לגבי אופן ביצוע השתקה של גנים המונחית על ידי וירוס בכותנה.

agrobacterium-mediated-virus-induced-gene-silencing-assay-in-cotton

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תיאור וירוס-Induced שיטה להשתקת (VIGS) הגן לדפוק למטה של ​​ביטוי...

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

מקור: שי, ג'. ואחרים. סינון וזיהוי מדכאי השתקת RNA מאפקטורים מופרשים של פתוגנים צמחיים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים מבחן חדירה משותפת לזיהוי חלבוני אפקטור פתוגנים המדכאים השתקת RNA בניקוטיאנה בנתמיאנה 16c. דיווח פלואורסצנטי וגן אפקטור מועמד מועברים לעלי הצמח דרך אגרובקטריום. בדרך כלל, השתקת RNA מפחיתה את תמלולי המדווחים, ומפחית את הפלואורסצנציה. אפקטורים מדכאים חוסמים תגובה זו, ושומרים על פלואורסצנציה. בדיקה זו מציעה שיטה מהירה ויזואלית לסינון אפקטורים מיקרוביאליים שמפריעים להגנת המארח.

מבחן קו-אינפלטרציה לבדיקת אפקטורים פתוגנים המדכאים השתקת RNA בצמח

מקור: שי, ג', ואח', סקר וזיהוי מדכאי השתקת RNA מאפקטורים מופרשים של פתוגנים צמחיים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את ההליך להכנת תרבית Agrobacterium tumefaciens על ידי השראת ביטוי גנים של אלימות באמצעות אצטוסירינגון, ולאחר מכן הסרת אנטיביוטיקה באמצעות שטיפה והשעיה מחדש, ליצירת השעיה מוכנה לשינוי להעברת גנים לרקמות הצמח.

הכנת תרבית אגרובקטריום להעברת גנים לתאי הצמח

מקור: בירנינק, ב. מ. ואחרים. הזרקה ישירה של שתילי תירס באמצעות הזרקה של וירוס הפסיפס של זנב שועל רקומביננטי ושיבוטים זיהומים של וירוס פסיפס קנה הסוכר. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון הזה מדגים את העברת שיבוטים ויראליים רקומביננטיים בתיווך אגרובקטריה לשתילי תירס לצורך השתקת גנים. הוא מתאר את תהליך זיהום האגרובקטרים , התפשטות וירוסית מערכתית ושינויים פנוטיפיים המונעים מהפרעות RNA.

העברת שיבוטים ויראליים רקומביננטיים בתיווך אגרובקטריום לשתילי תירס להשתקת גנים

וירוס-Induced השתקת הגן היא כלי שימושי לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות nonhost של צמחים. אנו מדגימים את השימוש בחיידקים פתוגנים המבטאים GFPuv בזיהוי גנים מושתקים צמחים רגישים לפתוגנים nonhost. גישה זו היא קלה, מהירה ומאפשרת הקרנה בקנה מידה גדולה ופרוטוקול דומה ניתן ליישם בחקר אינטראקציות צמח חיידק אחרים שונות.

הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost

ייצור חלוף חלבון בצמחי Nicotiana מבוססים על חדירת אבק עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה (מבוסס נגיף פסיפס טבק) הוא גישה מהירה וכלכלית להפקת אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים. אנחנו פישטנו את ההליך ושיפור בהצטברות יעד על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול חיידקים, בחירת מין מארח, ושיתוף מציג מדכאי RNA השתקה.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הכנת כמויות גדולות של סויה protoplasts ללמוד מנגנוני איתות ולניהולו מורכבים בתאים חיים.

שיטה פשוטה עבור בידוד של סויה Protoplasts, ליישום ניתוחים ביטוי גנים ארעית

כאן, אנו מציגים שיטת הקרנה שונה שניתן להשתמש בהרחבה כדי להקרין במהירות RNA השתקה דכאי במחלות צמחים.

הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

פרוטוקול הזרקה מבוסס אגרובקטריום (אגרובקטריה) מוצג לחיסון של וירוס פסיפס זנב שועל ווירוסי פסיפס קני סוכר לשתילי תירס. חיסון באופן זה מוביל לזיהום ויראלי, השתקת גנים הנגרמת על ידי וירוס של גנים סמן, ו overexpression ויראלי של GFP.

אגרוינוקולציה ישירה של שתילי תירס על ידי הזרקה עם וירוס פסיפס זנב שועל רקומביננטי ווירוס פסיפס קנה סוכר שיבוטים זיהומיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של שורשים שעירים סויה מהונדסים.

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול הראשון לחדירת ואקום מקומית למחקרי in vivo של טרנספורמציה גנטית של צמחים גדולים. באמצעות מתודולוגיה זו, השגנו לראשונה את הטרנספורמציה הארעית של קקאו בתיווך אגרובקטריום בפלנטה .

חדירה חקלאית כפויה בוואקום עבור בצמח טרנספורמציה של צמחים סרבנים: קקאו כמקרה בוחן

למד שתיקת גנים מושתקת בכותנה באמצעות Agrobacterium-mediated VIGS עם וקטור TRV. שיטה זו מאפשרת תצפית בפנוטיפ אלבינו בחלוף שבועיים ומסייעת בחקר תפקוד גנים בצמחים.

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג'ין השתקת Assay כותנה

גלה סרטונים נוספים