Name: הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: למד הכנת עיני Drosophila בוגרות לחיתוך דק וניתוח מיקרוסקופי. שיטה זו מאפשרת הערכת פגמים בעין וחקירת דרישות גנטיות בסוגי תאים ספציפיים במודל זה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אני רוצה להודות ד&quot;ר ג&#39;ניפר קרטיס עבור התמונות איור. 1 וג&#39;רמי פייגן וד&quot;ר פלורנס מרלו עבור אנושות לקרוא את כתב היד. העבודה שלנו היא נתמכת על ידי NIH מענק 1R01GM088202.

1. טוס לנתיחה ראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שיש לך את כל החומרים בהישג יד (כולל שקופיות מצופה ג'לטין). הכן glutaraldehyde ו fixatives אוסמיום (ראה להלן). לפי גנוטיפ להטביע, glutaraldehyde 200μl aliquot פתרון לתקן את הצינורות בתוך 1.5 מ"ל על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זבובים על כרית CO 2 (אנחנו בדרך כלל לנתח שבעה ראשים עפים להטביע שישה אחוזים גנוטיפ במקרה ראש אחד נהרס במהלך ההליך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק מעט בעיתונות החזה של הצד לעוף, הגב, עם פינצטה ולהשתמש אזמל חד לחתוך את הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את הראש לטוס ידי נגיעה בצוואר עם פינצטה ובזהירות לחתוך חלק קטן של עין אחת. זו משפרת חדירה של מקבע (אם אתם מתכוונים להשתמש במקטעים העין לניתוח המשובטים, לחתוך את העין עם שיבוטים או לא קטן). הימנע מנגיעה ומזיק העין שלמים אשר מאוחר יותר להיות מחולק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגע ראש עם פינצטה או אזמל על פני השטח של החתך מעל העין ולהעביר את הראש לתוך מקבע glutaraldehyde / פוספט על הקרח (ראשי קרובות לצוף על גבי מקבע) ראשי גזור לא צריך להיות כל הזמן לתקן glutaraldehyde למשך זמן ארוך יותר יותר מאשר 15 דקות לפני תוספת של אוסמיום. חזור על שלבים 1.2-1.5 עם זבובים אחרים של גנוטיפ זהה. </li></ol> 2. קיבוע והטבעה (להשתמש בכפפות במשך כל השלבים!) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין flyheads בצנטריפוגה Eppendorf דקה 1 בסל"ד 10,000. המשך גם אם הראש לא לשקוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200μl של פתרון 4 OSO ולתקן במשך לפחות 30 דקות עד 1 שעה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר, להסיר את הפתרון glutaraldehyde / אוסמיום (לוודא שימוש נכון לרשות נהלים בזבוז!) ולהחליפו פתרון אוסמיום 200μl. לדגור על הקרח במשך 1-6 שעות. תמיד להבטיח את ראשיהם מכוסים לגמרי בנוזל ולא להסיר את כל הפתרון כמו ראשי או העיניים עלול להתמוטט! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר, להשליך מקבע, להוסיף אתנול 0.5-1ml 30% ו דגירה במשך לפחות 5 דקות על קרח (כדי לוודא שימוש נכון סילוק פסולת הליכים מאז אתנול מכיל כעת אוסמיום!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב עם מעל 50%, 70%, (80%), 90% ו 100% אתנול פעמיים. כלול את הצעד אתנול 80% אם באמצעות העיניים לניתוח מיקרוסקופית אלקטרונים. לאחר השלב לשטוף 70%, הדגימות ניתן להסיר את הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את אתנול עם נפח שווה של פרופילן אוקסיד (נדיפים, להמשיך לעבוד למכסה המנוע). דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף פרופילן אוקסיד. עבודה בקבוצות אם עיבוד גנוטיפים רבים במקביל, כדי למנוע התמוטטות של העיניים עקב התאדות של פרופילן אוקסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביותר של פרופילן אוקסיד באמצעות פיפטה העברת פלסטיק, להוסיף על 500μl של 01:01 שרף: פתרון פרופילן אוקסיד. לאזן בין לילה בטמפרטורת החדר. </li></ol> 3. הטבעת ואת הסדר בתוך תבניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שכל תבניות מסומנים כדי לעקוב אחר גנוטיפים שונים שלך, ולאחר מכן למלא את תבניות עם שרף 100%. אל תמלא יותר מדי (לא 'ההרים הגבוהים' על פני השטח של תבניות כאשר מסתכל ישר על פני התבנית). השתמש שרף קשה לניתוח EM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה להעביר, להסיר את שרף 50% מן הראשים, להחליף עם שרף 100%, דגירה של 3-4 שעות בטמפרטורת החדר. כראשי הם הסתננו עם שרף, הם ישקעו לתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קיסם כי נפגעה על משטח קשה פעם אחת כדי ליצור וו קטן, להעביר ראש אחד בזמן לתוך תבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רדיד אלומיניום במקום על שטח העבודה של היקף הניתוחים שלך ולהגן עליו מפני דליפות שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת איזמל המנתחים ונראה כאילו מערבולת שלך, היקף הראש מעט שרף בזהירות להזיז אותו לתחתית התבנית קרוב לסוף הצביע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות ליישר את פני השטח של העין (!) הצוואר שלם (או מטוס העתיד שלך חתך אם אתה רוצה להיות חתכים) למטה עם הקיר הקדמי של עובש, והקפד לשמור את פני השטח של העין משיק בערך חצי ראש קוטר מהקיר עובש. במקרים נדירים, מתמוטט העין אשר ניתן לראות חלל ריק בין פני השטח את העין ואת הראש לציפורן. אם יש לך עין התמוטט, להחליף אותו עם העין חילוף 7 ה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם ראשי כל. פעם עשיתי עם מערכים כל, לבדוק מחדש את כל העיניים כדי לוודא שהם לא זז כאשר אתה מוסר את המחט של שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש לך בעיה עם העיניים לנוע כאשר אתה מסיר את איזמל המנתחים, מקם את העין לפי הצורך, לחזור בו במהירות את המחט מעט מן הראש ואז לאט לאט להוציא את המחט לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים את תבניות לילה בשעה 70 ° C. </li></ol> 4. זמירה ו חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוסמת מוקשה מתבניות על ידי כיפוף תבניות, kמסלול eeping מהם לחסום מתאים אשר גנוטיפ (למשל חנות צלוחיות קטנות הנצנץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זמירה, השתמש צ'אק מתאים microtome שלך ​​כי הוא רכוב על הפנים גוש של פלסטיק או אלומיניום. הר אבן לקצץ, עין למעלה, צ'אק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פי היקף לנתיחה באמצעות סכין גילוח מצופה טפלון בירך, בזהירות לחתוך רק את השכבה העליונה של הבלוק שלך. זה ישאיר משטח אשר ברור כי אתה צריך לראות את העין ולכן יכול לחזות את מטוס העתיד של חתך. הימנע חיתוך האצבעות! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את עודפי פלסטיק משני צידי הראש בחזית (כלומר, מה היה אמור להיות החלק העליון של התבנית כאשר ליישר את העיניים) עד שרוב הפלסטיק סביב ראשו נכרת. עדיף להתקרב לאט לאט הראש על ידי חיתוך שכבות דקות רבות של פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח נקי, להסיר בזהירות שכבות דקיקות מהחלק העליון של העין במישור המדויק שאתה רוצה בהמשך (בדרך כלל בנקודת השקה העין, בזווית קלה אל פני השטח את התבנית המקורית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עד שאתה פשוט להתחיל לחתוך את המשטח החיצוני של העין. הקפד להשתמש באזורים נקי של הלהב כדי לקבל משטח מבריק, שקוף, מה שהופך את היישור קל יותר microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על סכיני גילוח, סכיני להשתמש יותר עבור גס זמירה סביב הצדדים של הבלוק ולהשתמש להב טרי עבור זמירה קנס (חתך ראשון 4.6). בסופו של דבר יהיה לך פירמידה צדדית שלושה עם צמרת מוטה מעט חתוכים, שמתאים מטוס סעיף העתיד שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר לחסום microtome. חתך בפועל ישתנו בהתאם לסוג של microtome ולא יהיה מתואר בפירוט כאן. אנו משתמשים Sorvall MT5000 עם סכין יהלום באיכות histo לקצץ 0.5 ל 1μm חלקים. ניתוח מיקרוסקופי אור, שינויים קלים עובי סעיף לא משנה. אם שיבוטים חתך מסומן על ידי חלק לבן + transgene, 1μm סעיפים כדי להבטיח שיהיה מספיק גרגרי פיגמנט סמוך rhabdomeres לכל סעיף (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים יצוף על פני המים. הרם first סעיפים 20-30 עם סיום שטוח של קצה-Q עץ מתחת פני המים בתנועה וסיבוב ולהעביר אותם לתוך טיפת מים בשקופית זכוכית מצופה ג'לטין (שמר על צלחת חימום בסביבות 100 ° C ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם עוד 20-30 חלקים. חכו עד שהמים התאדו וחתכים מקל לשקופית. בדרך כלל, קטעים של 3 עיניים מסודרות בשלושה טורים (שלוש עיניים) על ידי שורות twp (למעלה / למטה חלקים) משתלבים היטב בשקופית אחת. </li></ol> 5. מכתים ניתוח מיקרוסקופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלא אם כן שיבוטים חתך, קטעי הכתם. המקום שקופיות עם קטעים על בלוק חימום נקבע על 90 ° C. לוותר Toluidine כחול פתרון מכתים מתוך מזרק 30 מ"ל מצורף מסנן 0.22μm לשקופית ואת הכתם למשך 10 שניות. מיד לשטוף נרחב עם מים מזוקקים. האוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה העברת פלסטיק, להפיץ 3 טיפות DPX הרכבה בינונית לשקופית ומכסים coverslip. למעלה עם 3 מטבעות ולתת בינוני להקשיח הרכבה (לילה למשל בטמפרטורת חדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה עם מיקרוסקופ אור. השתמש בעדשה או 5x 10x למצוא קטע טוב ולאחר מכן לעבור עדשה שמן 63x טבילה עבור ניתוח מפורט וצילום. אנחנו בדרך כלל להשתמש בהגדרות בניגוד שלב, אבל darkfield אופטיקה לעבוד גם כן. </li></ol> 6. נציג התוצאות: רוב לעיתים קרובות, עיניים המוטבעים פלסטיק ניתוח מפורט של חיצוני פנוטיפים עין גס זוהה כחלק מסך גנטי או בתהליך של בדיקה גנטית אינטראקציות עם גנים ידוע להשפיע גם מבנה העין הקוטביות כללית או. תוצאות אופייניות של חלקים עין מוצגים באיור 3. Wild-type האומטידיה (איור 3A) להראות משלימים photoreceptor מלא מוקף סריג של תאים פיגמנט. לעומת זאת, פזילה (stbm, aka ואן גוך-7) מוטציה, את הקוטביות ommatidial אבד, למרות משלימים photoreceptor מלא קיים, סיבוב כירליות הם אקראיים (איור 3B). יתר על כן, מאז אלל stbm מחולק היה aw - הרקע, גרגרי פיגמנט חסרים באיור. 3B. איור 3C מציג דוגמה של ניתוח משובט. תסיסנית Rho קינאז (drok) נדרש סיבוב ommatidial כמו גם על שלמות מבנית של העין 8. הומוזיגוטים drok 2 שיבוטים ניתן לזהות על ידי העדר פיגמנט בתאי הפיגמנט ואת rhabdomeres (בדרך כלל, שיבוטים הם חסרי עיניים הנגרמת באמצעות-FLP ו-P-אלמנט עם גן הביע בתוקף סמן לבן המשלימה w רקע - מוטציה בטבע סוג ורקמות הטרוזיגוטיים). זה ובכך ניתן לזהות אזורים מוטציה על ידי חוסר פיגמנט. בשל האוטונומיה תאים של פיגמנטציה של ה-R-CElls שהוזכר קודם לכן, גנוטיפ של הפרט R-תאים ניתן לקבוע (ראה ראשי חץ באיור. 3C). <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. העין תסיסנית היא מערכת מודל מצוינת עבור הביולוגים מאז, בניגוד המשטח החלק של העין wild-type (א), את פני השטח של העין מוטציה היא חיצונית גסה לעתים קרובות (ב), מעיד על פנוטיפים עין הבסיסית . ב כל הדמויות, הקדמי הוא שמאלה הגבי הוא למעלה. תמונות באדיבות ד"ר ג'ניפר קרטיס, NMSU, Las Cruces, NM, ארה"ב. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. תמונות מיקרוסקופיות של אור האומטידיה אחד מחולק באמצעות השיטה המתוארת. רק שבעה R-תאים גלויים בכל פעם לכל אומטידיום, מאז R7 שקרים על גבי R8. (א ', א') ברמה R7, גוף התא של R7 מזוהה בין R1 ו-R6 (חץ צהוב "). לעומת זאת, ברמה R8 (ב), גוף התא של R8 מזוהה בין R1 ו R2 (חץ צהוב ב '). ראשי חץ כחול מסמנים את גרגרי פיגמנט שיכול לשמש כסמן תאים אוטונומיים פיגמנט. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. סעיפים משיק דרך wild-type (A), stbm (B) drok (C) מוטציה העיניים מבוגר תסיסנית. שרטוטים להלן הסעיפים לציין את הקוטביות של האומטידיה (ראה (א) על החצים). המעגלים מייצגים האומטידיה עם פגמים להשלים את photoreceptor. קווי זהב מייצגים את קו הגב / הגחון של סימטריה (קו המשווה). בניגוד האומטידיה גם אוריינטציה של wild-type (A), הארגון מישוריים הולך לאיבוד מוטציה stbm (B). ראוי לציין, כי סעיף של מוטציה stbm הראו חסר פיגמנט בשל w שלה - רקע מוטנטים. (ג) כי מוטציות drok הם קטלניים, הם צריכים להיות מנותח שיבוטים. לכן, תאים פיגמנט הם wild-type או הטרוזיגוטיים (ראשי חץ כחול מלא), בעוד R-תאים חסר פיגמנט (ראשי חץ כחול פתוח) הם מוטנטים הומוזיגוטים. בנוסף לפגמים סיבוב, מוטנטים drok גם להראות פגמים מבניים לרבות מספרי חסר או עודף של R-תאים. שימו לב לניתוח המשובטים, קטעי אינם מוכתמים כדי למנוע טשטוש גרגרי פיגמנט.

<ol><li>Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Mst+ortholog%2C+hippo%2C+restricts+growth+and+cell+proliferation+and+promotes+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis.</a> Cell. 114, 457-457 (2003).</li>
<li>Secombe, J., Li, L., Carlos, L., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Trithorax+group+protein+Lid+is+a+trimethyl+histone+H3K4+demethylase+required+for+dMyc-induced+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Trithorax group protein Lid is a trimethyl histone H3K4 demethylase required for dMyc-induced cell growth.</a> Genes Dev. 21, 537-537 (2007).</li>
<li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Drosophila+eye+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of Drosophila eye differentiation.</a> Curr Top Dev Biol. 89, 115-115 (2009).</li>
<li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 189-189 (2010).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+in+the+Drosophila+Ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fate in the Drosophila Ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-264 (1987).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-366 (1987).</li>
<li>Jenny, A., Darken, R. S., Wilson, P. A., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle+and+Strabismus+form+a+functional+complex+to+generate+a+correct+axis+during+planar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Prickle and Strabismus form a functional complex to generate a correct axis during planar cell polarity signaling.</a> Embo J. 22, 4409-4409 (2003).</li>
<li>Zheng, L., Zhang, J., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((frizzled+regulates+mirror-symmetric+pattern+formation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">frizzled regulates mirror-symmetric pattern formation in the Drosophila eye.</a> Development. 121, 3045-3045 (1995).</li>
<li>Reinke, R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interaction+in+the+Drosophila+Retina%3A+The+bride+of+sevenless+Gene+is+required+in+photoreceptor+cell+R8+for+R7+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interaction in the Drosophila Retina: The bride of sevenless Gene is required in photoreceptor cell R8 for R7 cell development.</a> Cell. 55, 321-321 (1988).</li>
<li>Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((strabismus%2C+a+novel+gene+that+regulates+tissue+polarity+and+cell+fate+decisions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">strabismus, a novel gene that regulates tissue polarity and cell fate decisions in Drosophila.</a> Development. 125, 1149-1149 (1998).</li>
<li>Winter, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rho-associated+kinase+%28Drok%29+links+Frizzled-mediated+planar+cell+polarity+signaling+to+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rho-associated kinase (Drok) links Frizzled-mediated planar cell polarity signaling to the actin cytoskeleton.</a> Cell. 105, 81-81 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1223 (1993).</li>
<li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStocker%2C+H+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Dahmann, C. 420, Springer. 27-27 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שימוש תסיסנית כאורגניזם מודל, מסכי הגנטי הוביל לזיהוי של רבים מן החברים המייסדים של משפחות גנים חיוניים ביותר של מסלולי איתות שמור ביותר אאוקריוטים גבוה כולל בני אדם. מאז, בתנאי מעבדה, עין פונקציונלי הוא לוותר להישרדות, העין היא רקמה במיוחד גם מתאים הגילוי של פונקציות גן הרומן ההערכה של רשתות גנטיות. ניתוח Ultrastructural העין לטוס באמצעות השיטה המתוארת ובכך הובילו תגליות בסיסיות הרלוונטיות לפיתוח המחלה. בתחילה, ניתוח תא בודד המשובטים בוצעה באמצעות רנטגן שיבוטים המושרה בשילוב עם ידוע תאים אוטונומיים סמנים קשר הדוק רצסיבי. לאחרונה, את הזמינות של מערכת FLP / FRT כדי ליצור שיבוטים יש להקל במידה רבה את הניתוח פנוטיפי של מוטציות קטלניות בסעיפים 6,9 העין. ניתוח סעיפים העין אינה מוגבלת סעיפים משיק המתואר כאן. אם תרצה, בראש ניתן ליישר בכיוון כלשהו בתוך תבניות וחתכים רוחביים ניתן להשיג ללמוד רבדים עמוקים יותר בראש כגון lamina ואת לשד. פרוטוקול המתואר כאן הוא אפוא בשיטה תכליתי עבור ניתוח עיניים וראש מבוגרים מבני תסיסנית.

ציוד כללי: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בעלי לטוס בכלל לראות 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקציה מיקרוסקופ רגיל (למשל ניקון SMZ-645 זום מיקרוסקופ סטריאו), רצוי עם מקור אור הטבעת כדי למנוע הטלת צל של הידיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CO 2 כרית טוס, מכוסה בנייר Whatman 3mm כדי לספק הגנה מפני לכלוך במהלך לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מצופה לטין: להמיס הג&#39;לטין 10g ו 1g CrKSO 4 x 12 H 2 O במים 1L על צלחת חימום (ומביאים לסף רתיחה, לוקח כ 2 שעות). טובלים שטף מחליק היטב (סבון) ושטף (DH 2 O) ב מחזיקי בפתרון ג&#39;לטין אוויר יבש, מכוסה בנייר לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנור חימום (70 מעלות צלזיוס, תנורי ואקום הישנים ששימשו לייבוש nitrocellulose לסנן מתאימים היטב למטרה זו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microtome מסוגל חתך Ultrathin (0.5-1 חלקים עבים מיקרומטר), כגון אלה המשמשים מתקני במיקרוסקופ אלקטרונים. אנו משתמשים Ultramicrotome MT5000 Sorvall עם סכין יהלום באיכות histo. סכינים זכוכית גם לעבוד. </li></ul> קיבוע פתרונות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מלאי של 0.2 חיץ סודיום פוספט M, pH 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן glutaraldehyde 2% חיץ 0.1M נתרן פוספט, pH 7.2 (ניתן לאחסן 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות). בצע לפחות מספיק כדי 200μl לכל גנוטיפ ברצונך להטביע. שמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון אוסמיום: 2% OSO 4 במאגר 0.1M נתרן פוספט, pH 7.2. בצע רק מספיק כדי 200μl לכל גנוטיפ ברצונך להטביע, שכן הפתרון לא יכול להיות מאוחסן. שמור על הקרח. </li></ul> Glutaraldehyde OSO ו 4 הם רעילים מאוד ויש לטפל בזהירות רבה בשכונה מאוורר היטב. שימוש במסנן טיפים בעת טיפול OSO 4 למנוע השחרה של פיפטה שלך. התייבשות: הפוך 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, אתנול פתרונות 100%. מגניב רצוי 30%, 50%, אתנול 70% על הקרח לפני השימוש. מכתים פתרון: 1 Toluidine כחול ב בורקס% 1%. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th></th><th> רך </th><th> קשה </th></tr><tr><td> שרף </td><td> 54g </td><td> 50 גרם </td></tr><tr><td> Hardener B </td><td> 44.5g </td><td> 50 גרם </td></tr><tr><td> Accelerator C </td><td> 2.5G </td><td> 1.75g </td></tr><tr><td> Plasticizer D </td><td> 10g </td><td> 0.75g </td></tr></tbody></table> טבלה 1. שרף הכנה כדי להכין את שרף, בזהירות, אך ביסודיות לערבב את כל החומרים בכוס פלסטיק באמצעות stirrer מגנטי עם בר גדול ומערבבים. הימנע בועות. לאחר aliquot, ערבוב צלוחיות scintillation סטנדרטי או מיכלים דומים להקפיא ב -20 ° C. השתמש שרף רך עבור כל היישומים אלא אם המתקן EM שלך מבקש ניסוח יותר. השתמש בכפפות לטפל שרף (מסרטנים בצורה unpolymerized שלה). כדי לפלמר שרף על ציוד ופסולת, ואופים בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך הלילה. פסולת עשוי אז להיות מושלך בבטחה וציוד לנקות ולעשות בהם שימוש חוזר. שרף unpolymerized שנשפך ניתן לנקות עם isopropanol. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> ספק </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> טוס כרית </td><td> למשל Genesee </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyde </td><td> סיגמא </td><td> G7526-10 X 10 ML </td></tr><tr><td> OSO 4 </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 0972A-20 </td></tr><tr><td> Propyleneoxide </td><td> דיג </td><td> 04332-1 </td></tr><tr><td> איזמל ידיות, על # 3 </td><td> דיג </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> להבי אזמל # 11 </td><td> דיג </td><td> 08-916-5B </td></tr><tr><td> העברת pipettes </td><td> דיג </td><td> 13-711-7m </td></tr><tr><td> Durcupan (R) ACM שרף </td><td> סיגמא (Fluka) </td><td> 44610-1EA </td></tr><tr><td> פלדה לנתח מחט </td><td> דיג </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> BEEM עובש הטבעה שטוח </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים מדע. </td><td> 70904-12 </td></tr><tr><td> סכיני גילוח מצופה טפלון </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים מדע. </td><td> 71970 </td></tr><tr><td> Q-קצה (דגימות סטריליות) </td><td> דיג </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> שקופיות הזכוכית </td><td> דיג </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> כיסוי מחליק לא 1, 22X60 מ&quot;מ </td><td> דיג </td><td> 12-531K </td></tr><tr><td> לטין </td><td> דיג </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> Cr (III) K SO 4 dodecahydrate </td><td> סיגמא </td><td> 243361 </td></tr><tr><td> היהלומים histo סכין, 6mm </td><td> Diatome בארה&quot;ב </td><td> 60 שלו </td></tr><tr><td> Toluidine כחול O </td><td> דיג </td><td> BP107-10 </td></tr><tr><td> בורקס (Na-Tetraborate) </td><td> דיג </td><td> AC20629-1000 </td></tr><tr><td> DPX הרכבה בינונית </td><td> סיגמא </td><td> 44581-100 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 2. חומרים

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

תסיסנית כבר זמן רב המשמש כמערכת מודל מחקר ופיתוח, בעיקר בשל הקלות שבה הוא ממושמע מבחינה גנטית. במהלך השנים, שפע של זנים מוטנטים וטריקים טכני פותחו כדי לאפשר שאלות מתוחכמות להישאל וענה בסכום זמן סביר. התובנה הבסיסית לתוך הגומלין של המרכיבים של כל המסלולים העיקריים ידוע איתות התקבל ב קדימה הפוכה מחקרים גנטיים תסיסנית. העין לטוס הוכיחה להיות מתאים במיוחד גם עבור ניתוח מוטציוני, שכן, בתנאי מעבדה, זבובים יכולים לשרוד בלי עיניים תפקודית. יתר על כן, פני השטח של העין חרק מורכב כ -800 עיניים יחידת הפרט (היבטים או האומטידיה) היוצרים משטח רגיל, כאשר חלקה הסתכל תחת מיקרוסקופ לנתח. לכן, קל לראות אם מוטציה עשויה להשפיע על התפתחות העין או על ידי צמיחה חיצונית מחפש אובדן השטח החלקים (פנוטיפ &quot;עין גס&quot;; איור 1.) או גודל העין הכללית, בהתאמה (עבור דוגמאות של המסכים המבוססים על מורפולוגיה עין חיצונית לראות למשל 1). לאחר ניתוחים מפורטים של פנוטיפים עין דורשים, קיבעון הטבעה פלסטיק דק חתך של העיניים הבוגרת. העין תסיסנית מפתחת מדיסק שנקרא עין דמותי, שקית לתאי האפיתל כי להתרבות להבדיל בשלבי הזחל ו גלמי (לסקירה ראה 2 למשל). כל אומטידיום מורכב 20 תאים, כולל שמונה photoreceptors (PR או R-תאים;. איור 2), ארבע עדשות מפריש תאים חרוט, תאים פיגמנט (&quot;משושה&quot; סביב מקבץ תאים R) וכן זיפים. Photoreceptors של אומטידיום כל, הכי מזוהה בקלות על ידי אברונים רגישים לאור שלהם, rhabdomeres, מאורגנים טרפז מורכב ששת &quot;החיצוני&quot; (R1-6) ושני &quot;פנימי&quot; photoreceptors (R7 / 8; R8 [איור . 2] מתחת R7 ולכן ראיתי רק בחלקים מאזורים עמוקים יותר של העין). טרפז של פן כל מיושרים במדויק עם אלה של שכנותיה הצירים anteroposterior ו dorsoventral הכוללת של העין (איור 3A). בפרט, האומטידיה של (חיצים שחורים ואדומים, בהתאמה) הגבי ו הגחון חצאים של העין הם תמונות ראי של אחד את השני מתאימות שתי צורות כיראלי הוקמה במהלך איתות הקוטביות מישוריים תא (לסקירה ראו למשל 3). השיטה לייצר חצי דקה סעיפים העין (כמו אלה שהוצגו באיור. 3) המתואר כאן הוא שונה במקצת מזו המתוארת במקור על ידי טומלינסון ו Ready 4. זה מאפשר ניתוח מורפולוגי של כל התאים פרט לתאי חרוט שקוף. בנוסף, פיגמנט של R-תאים (ראשי חץ כחול באיור. 2 ו -3) יכול לשמש כסמן התא אוטונומי עבור גנוטיפ של תא-R, דרישות הגנטי ובכך הגנים משנה של R-תאים יכולים בנקל ייקבע 5,6.

הגישה הסטנדרטית כדי להכין את הבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עיניים חתך חצי דקה ניתוח מיקרוסקופי אור מוצג כאן. הפרוטוקול ניתן להשתמש לצורך ניתוח מורפולוגי ברוטו של פגמים העין, או עם התאמות ציינו שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע דרישות הגנטי של הגנים סוגי תאים מסוימים של העין (ניתוח למשל המשובטים של קולטני האור) או לצורך ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים.

*Drosophila* משמשת מזה זמן רב כמערכת מודל לחקר ההתפתחות, בעיקר בשל הקלות שבה ניתן להפקידה לטיפול גנטי. במהלך השנים פותחו שפע של זני מוטנטים וטריקים טכניים המאפשרים להציב ולענות על שאלות מורכבות בפרק זמן סביר. תובנות בסיסיות לגבי יחסי הגומלין בין רכיבים בכל נתיבי האיתות המרכזיים הידועים התקבלו במחקרי גנטיקה קדימה (forward genetics) ואחורה (reverse genetics) ב-*Drosophila*. עין הזבוב התגלתה כמתאימה באופן יוצא דופן לאנליזה מוטציונית, מכיוון שתחת תנאי מעבדה, זבובים יכולים לשרוד ללא עיניים תפקודיות. יתרה מכך, פני השטח של עין החרק מורכבים מכ-800 עיניים יחידניות (פסיטות או אומטידיום - ommatidia) היוצרות משטח חלק וסדיר כאשר בוחנים אותם תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting microscope). לפיכך, קל לראות אם מוטציה עשויה להשפיע על התפתחות העין או על גדילה שלה על ידי חיפוש חיצוני אחר אובדן המשטח החלק (פנוטיפ של "עין מחוספסת" - rough eye; איור 1) או אחר גודל העין הכללי, בהתאמה (לדוגמאות לסריקות המבוססות על מורפולוגיית עין חיצונית, ראו למשל 1). אנליזות מפורטות לאחר מכן של פנוטיפים של העין דורשות קיבוע, שיכון בפלסטיק וחיתוך לדקיקה של עיניים בוגרות. עין ה-*Drosophila* מתפתחת ממה שנקרא הדיסק האימגינלי של העין (eye imaginal disc), שקיק של תאי אפיתל השורים ומתמיינים במהלך שלבי הזחליל והבובה (לסקירה, ראו למשל 2). כל אומטידיום מורכב מ-20 תאים, כולל שמונה פטורצפטורים (PR או תאי R; איור 2), ארבעה תאי קונוס המפרישים עדשה, תאי פיגמנט ("משושה" סביב צבר תאי ה-R) וסיכה (bristle). הפטורצפטורים של כל אומטידיום, שניתן לזהותם בקלות רבה ביותר באמצעות האורגנלות הרגישות לאור שלהם, הרבדומרים (rhabdomeres), מאורגנים בצורת טרפז המורכב מששת הפטורצפטורים ה"חיצוניים" (R1-6) ושני הפטורצפטורים ה"פנימיים" (R7/8; R8 [איור 2] נמצא מתחת ל-R7 ולכן נראה רק בחתכים מאזורים עמוקים יותר של העין). הטרפז של כל פסיטה מיושר בדיוק עם אלו של שכנותיו ועם הצירים האנטרו-פוסטריוריים והדורסו-ונטרליים הכלליים של העין (איור 3A). בפרט, האומטידיום של החצאיםB הדורסלי והונטרלי של העין (חצים שחורים ואדומים, בהתאמה) הם תמונת מראה זה של זה ומתאימים לשתי צורות כיראליות הנקבעות במהלך איתות של קוטביות תא מישורית (planar cell polarity) (לסקירה, ראו למשל 3). השיטה להפקת חתכי עין חצי-דקיקים (כגון אלו המוצגים באיור 3) המתוארת כאן היא שונה מעט מזו שתוארה במקור על ידי Tomlinson ו-Ready4. היא מאפשרת אנליזה מורפולוגית של כל התאים למעט תאי הקונוס השקופים. בנוסף, ניתן להשתמש בפיגמנט של תאי R (ראשי חצים כחולים באיורים 2 ו-3) כסמן אוטונומי-תאי לגנוטיפ של תא R, ובכך ניתן לקבוע בקלות את הדרישות הגנטיות של גנים בתת-קבוצה של תאי R5,6.

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין עיני דרוסופילה בוגרות לחיתוך לדקיקים, כדי לאפשר הערכה מפורטת של פנוטיפים של עיניים מוטנטיות, כגון פגמים בקוטביות תאית מישורית (planar cell polarity). הדבר מושג תחילה על ידי חיתוך ראศึกיהם של זבובים שהורדמו. לאחר מכן, רקמת העין מקובעת ומוטמעת בשרף אפוקסי.לאחר שהשרף התמצק, מקצצים את העיניים הטמונות. לצורך החיתוך, השלב הסופי הוא ביצוע חיתוכים דקים של העיניים באמצעות מיקרוטום המצויד בסכין יהלום. בסופו של דבר, ניתוח חיתוך העין יאפשר את אפיון הפנוטיפים של העין של מוטנטים חדשים או את הכימות של אינטראקציות גנטיות בין גנים במסלול איתות, כגון מסלול ה-PCP.שניהם יסייעו באפיון התפקיד הפיזיולוגי של גנים שזוהו לאחרונה. שיטה זו יכולה לעזור במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ה-drosophila, כגון כיצד מוטציות חדשות משפיעות על התפתחות העין, או כיצד גנים מקיימים אינטראקציה בבדיקות של אינטראקציה גנטית. מספר שלבים בהליך הטמעת העיניים, כגון יישור העיניים בתבניות החיתוך, קלים הרבה יותר להבנה בצורה ויזואלית מאשר בצורה טקסטואלית. כדי להתחיל, לבשו זוג כפפות כהכנה לקיבוע ראשי הזבובים ולעבודה עם גלוטראלדהיד ואוסמיום, שניהם כימיקלים רעילים.לאחר מכן, הרדימו את הזבובים באמצעות CO2 והעבירו אותם למשטח זבובים המוגן בנייר Watman תחת מיקרוסקופ סטריאו; בדרך כלל יש למיין שישה זבובים בתוספת זבוב נוסף כדי להבטיח שישנם שישה ראשי זבובים מוטמעים לכל גנוטיפ. לחצו בעדינות על חזה הזבוב בעזרת פינצטה והסיר את ראש הזבוב באמצעות סכין מנתחים. ייצבו את ראש הזבוב על ידי נגיעה בצוואר עם הפינצטה וחתכו בזהירות חלק קטן מאחת העיניים כדי לשפר את חדירות המקבע. געו בראש עם הפינצטה או עם סכין המנתחים על פני השטח של העין החתוכה כדי להעביר את הראש למקבע גלוטראלדהיד פוספט על קרח. הקפידו להשתמש בכפפות לאורך כל תהליך הקיבוע.ראשית, סמנו את כל התבניות כדי לעקוב אחר הגנוטיפים השונים. לאחר מכן, מלאו כל תבנית ב-100% resin, תוך הקפדה לא למלא אותן מעבר לקיבולתן. החלק העליון צריך להיות שטוח לכל אורך הפני השטח.באמצעות פיפטה להעברה, הסירו את ה-50% resin מהראשים. החליפו ב-100% resin והדגירו למשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר. ככל שהראשים יגיעו לשיווי משקל בשרף במהלך ההדגרה, הם ישקעו לתחתית המבחנה.הכו את קצה קיסם שיניים על משטח קשיח כדי ליצור מעין וו קטן. בעזרת כלי זה, העבירו ראש של זבוב בודד לתוך כל תבנית. הניחו נייר אלומיניום על אזור העבודה של מיקרוסקופ הדיסקציה כדי להגן עליו מפני שפיכת שרף.בעזרת מיקרוסקופ הסטריאו, השתמש במחט הדיסקציה כדי לסובב את הראש בעדינות ובזהירות. הזז אותו לתחתית התבנית, קרוב לקצה המחודד. יישר בזהירות את פני העין השלמה עם הדופן הקדמית של התבנית, כאשר הצוואר פונה כלפי מטה.יש לוודא שהמשטח הטנגנציאלי של העין נמצא במרחק של בערך חצי מקוטר ראש מדופן התבנית. אם העיניים זזות בעת הסרת מחט הדיסקציה, יש למקם מחדש את העיניים כנדרש, להסיג במהירות את המחט מעט מהראש, ולאחר מכן להסיר את המחט באיטיות ובשלמות. לאחר שכל הראשים ייושרו, יש לבדוק שוב את כל העיניים כדי לוודא שהן לא זזו.לאחר הוצאת המחט מהשרף, במידה והיא הוטה, יישרו מחדש את הראש, העבירו את התבניות לתנור ואפו אותן ב-70 degrees למשך הלילה. לאחר אפייה של לילה שלם, הוציאו את הבלוקים שהתקשו מהתבניות על ידי כיפוף שלהן. עקבו אחר ההתאמה בין כל בלוק לגנוטיפ המתאים לו באמצעות שמירתם במכלים מסומנים.כדי לקצץ את הבלוקים, רכבו בלוק על תפס של מיקרוטום, כך שהעין פונה כלפי מעלה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. באמצעות להב תער מצופה בטפלון, חתכו בזהירות רק את השכבה העליונה של הבלוק. פעולה זו משאירה משטח שקוף שדרכו ניתן לראות את העין, ומאפשרת לקבוע את מישור החיתוך.בשלב הבא, חתכו את עודפי הפלסטיק משני צדי הראש ומהחלק הקדמי, עד שרוב הפלסטיק מסביב לראש יוסר. מומלץ להתקרב לאט אל הראש על ידי הסרה של מספר שכבות דקות של פלסטיק באמצעות להב תער נקי. הסירו בזהירות שכבות דקות מחלקו העליון של העין במישור החיתוך המדויק הרצוי.יש להקפיד להשתמש באזורים נקיים של להב התער עבור כל חיתוך, ולהמשיך רק עד הגעה למשטח החיצוני של העין. הבלוק המשולב שיתקבל יהיה פירמידה תלת-פסיית עם חלק עליון חתוך ומוטה מעט, התואם למישור החיתוך. התקינו את הבלוק במיקרוטום והתחילו בחיתוך.עד שיוצרו 20 עד 30 חתכים, החתכים שנוצרו יצופו על פני המים במאגר. הניחו סלייד על פלטת חימום המכוונת ל-100 °C. לאחר מכן, הרימו את קבוצת החתכים הראשונה מתחת לפני המים באמצעות קצה שטוח של מקל צמר גפן מעץ בתנועה סיבובית, והעבירו אותם לתוך טיפת מים.על גבי הזכוכית, המתינו עד שהמים יתאדו והחתכים יידבקו לזכוכית, ולאחר מכן חזרו על הפעולה עם 20 עד 30 חתכים נוספים. בדרך כלל, חתכים של שלוש עיניים הממוקמים בשישה טיפות מים נכנסים היטב על זכוכית אחת. לאחר שכל החתכים נאספו על הזכוכית, ניתן לצבוע אותם ולהכינם להרכבה לצורך מיקרוסקופיה בחתך טנגנציאלי דרך עינה של זבוב מסוג wild eye.ה-TIA מציגים פולריות תקינה והם מכוונים היטב ביחס לקו הסימטריה הדורסו-ונטרלי, המומחש בקו צהוב בסכימה למטה. בניגוד ל-tia המכוונים היטב בעין מסוג בר (wild type), בעין של מוטנט strabismus הפולריות של ה-tia אובדת, ואף על אף שכל מערך הפוטורספטורים נוכח, הסיבוב והפולריות הן אקראיות. כמו כן, שימו לב להיעדרו של הפיגמנט של סריג תאי הפיגמנט ושל תאי הפוטורספטורים הבודדים.מכיוון שהמוטנט strabismus היה על רקע גנטי של white minus, המוטציה drosophila ro kinase או drop היא מוטציה קטלנית בהומוזיגוטים, ולכן היא דורשת ניתוח קלונאלי. כאן, קלונים של מוטנטים הומוזיגוטים מסומנים על ידי היעדר פיגמנט ומראים פגמי סיבוב, כמו גם פגמים מבניים, הכוללים חסר או עודף של תאי פוטורספטור ברמה של תא בודד. דוגמאות לפוטורספטורים מוטנטים ובסוג בר (wild type) מסומנות על ידי חצי חצים כחולים פתוחים או מלאים, בהתאמה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להטמיע ולבצע חיתוך של עיני זבובים. תוך כ שלושה ימים, תוכלו לנתח באופן שגרתי פנוטיפים של העין בפירוט, דבר שיאפשר לכם לבחון את תפקודם של גנים חדשים במהלך התפתחות העין.

preparation-adult-drosophila-eyes-for-thin-sectioning-microscopic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים תהליך להטבעת קיבעון, חתך, הדמיה של שלב...

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

תסיסנית שניידר (S2) הם תאים מערכת פופולרי יותר ויותר על גילוי וניתוח פונקציונלי של גנים. המטרה שלנו היא לתאר כמה טכניקות להפוך תאים מיקרוסקופיים S2 כגון מערכת ניסיונית חשוב יותר ויותר.

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

סרטון זה מתאר שיטה להרכבת מוחות שלמים מזבובים בוגרים מתחת למגלשת גשר ומציג את הפרוטוקול המבוצע על מוחות מוכתמים חיסונית עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הרכבת מוחות דרוזופילה בוגרים: שיטה להכנת שקופיות לדימות קונפוקלי

סרטון זה מתאר כיצד להטמיע ראשי דרוזופילה בפרפין בשיטת הצווארון, טכניקה המכינה ראשי זבובים לחתך סדרתי. קטעי פרפין משמשים לבדיקות היסטולוגיות של האנטומיה של המוח ולהערכת ניוון עצבי. הפרוטוקול המוצג מדגים כיצד ניתן לעבד מספר זבובים בהכנה אחת, ובכך להגדיל את יעילות הזמן ולמזער ממצאים ניסיוניים.

שיבוץ ראשי דרוזופילה בוגרים בפרפין: הכנת רקמות להיסטולוגיה

המוח תסיסנית הבוגרת הוא מערכת יקרה ללימוד מעגלים עצביים, תפקוד מוח גבוה, והפרעות מורכבות. שיטה יעילה כדי לנתח רקמות מוח כולו מראש הזבוב הקטן תקל מחקרים מבוססי מוח. כאן אנו מתארים פשוט, פרוטוקול לנתיחת צעד אחד של מוחות בוגרים עם מורפולוגיה השתמרה היטב.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

ניתוח SEM הוא שיטה יעילה כדי לסייע לזן או פנוטיפי אפליה. פרוטוקול זה מתאר את השיטות לבחינת המסוימות מורפולוגי של שלושה סוגי האורגניזמים נציג ויהיה בהרחבה החלים על בחינת תכונות של רבים organismal סוגי רקמות.

הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

מאמר זה מציג שיטה כירורגית ניקוד דרוזופילה הרשתיות הגולמי יחד עם פרוטוקולים עיבוד רקמה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA-חילוץ.

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

פרוטוקול זה מתאר שלושה שלבים להכנת אונות אופטיות דרוזופילה בוגרות של זחלים ובוגרים להדמיה: 1) דיסקציות מוחיות, 2) אימונוהיסטוכימיה ו-3) הרכבה. דגש מושם על שלב 3, שכן נדרשים כיווני הרכבה ברורים כדי לדמיין מבנים ספציפיים של האונה האופטית.

דיסקציה, אימונוהיסטוכימיה והרכבה של מוחות זחלים ודרוזופילה בוגרים להדמיית האונה האופטית

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה מהירה, בעלות נמוכה, עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של עיני דרוזופילה בוגרות כדי לכמת דפוסי דפוס ופגמי גדילה. אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו להכנת דגימות על ידי הרכבה נקודתית, רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח תמונה.

תהליך עבודה מהיר ופשוט לכימות מבני דרוזופילה חיצוניים למבוגרים

למד הכנת עיני Drosophila בוגרות לחיתוך דק וניתוח מיקרוסקופי. שיטה זו מאפשרת הערכת פגמים בעין וחקירת דרישות גנטיות בסוגי תאים ספציפיים במודל זה.

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

גלה סרטונים נוספים