Name: חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-14T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: למדו שיטת חלבון ממברנה Assay Overlay לבדיקת אינטראקציות בין חלבונים מסיסים ולא מסיסים במבחנה. הפרוטוקול כולל שיבוט, ביטוי, הימצאות על ממברנה ואימונובלוטינג לאימות הקשרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדה שלנו הוא נתמך על ידי מענקים מ-NIH, המכון הלאומי של משרד החקלאות המזון והחקלאות, NSF, בארד, DOE, ו BSF ל VC

1. הביטוי החילוץ של החלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיפרנציאלי לתייג את החלבונים להיבדק לגילוי שלהם. לייבל החלבון להיות משותקת על הממברנה (ProIM) עם תג בגודל גדול יותר (למשל, GST), ואת תג unfused יכול לשמש מלאה שלילי משותקת (ProIMnc). לייבל החלבון לשמש בדיקה מסיסים (ProSOL) עם או גדול או תג קטן. נתיך אותו תג לחלבון בקרה המתאימים שלילי מסיסים (ProSOLnc) ו לכלול assay את האינטראקציה כדי לאשר את הספציפיות של הכריכה זוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ביטוי חלבון מערכת להביע את החלבונים המתויגים, כלומר, א coli, baculovirus, וכו ', בהתאם לדרישת שינויים שלאחר פוטנציאל התשואות translational של החלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ProIM ו ProIM nc מן האורגניזם של בחירה (שלב 1.2) באמצעות SDS-PAGE חיץ טעינה (גליצרול 20%, 4% SDS, 20 מ"מ טריס-HCl, pH6.8) המכילה קוקטייל מעכב proteinase. השאירו את ההשעיה תא בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, להוסיף 0.5% mercaptoethanol-2 ו להרתיח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ProSOL ו ProSOL nc מן האורגניזם של בחירה (שלב 1.2) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 16. חלבונים אלה צריכים להיות מסיסים בקלות למאגר מחייב (140 mM NaCl, 10 מ"מ, טריס-HCl pH 7.4, 2 mM EDTA, 2 מ"מ DTT, BSA 1%, 0.1% Tween 20) משמש בשלב 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז החלבונים רקומביננטי בשיטה סטנדרטית, כגון ערכת Bio-Rad assay חלבון. כגון ערכת Bio-Rad assay חלבון. אם לחלץ גולמי, ולא מטוהרים חלבון, המשמש assay, להעריך את ריכוז החלבון של עניין תמצית זו על ידי סריקת צפיפות של הלהקה המתאים מוכתם SDS-polyacrylamide ג'ל עם Coomassie מבריק כחול R-250 ושימוש ידוע ריכוזי BSA כנקודת התייחסות. </li></ol> 2. Immobilization של ProIM ו ProIMnc על הממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון שתי סדרות של תמציות, שכל אחד מהם מכיל 1 מיקרוגרם של ProIM ו ProIM nc על ג'ל SDS-polyacrylamide לפי הפרוטוקול הסטנדרטי 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אלקטרופורזה, במקום להעביר את הג'ל אל על 100 מ"ל של חיץ להעביר (60 mM גליצין, 10 mM טריס, 0.0006% SDS, MeOH 20%) דגירה עם תסיסה עדינה 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrotransfer החלבונים הכלול הג'ל על קרום nitrocellulose לפי הפרוטוקול הסטנדרטי 16. </li></ol> 3. Re-קיפול של הממברנה הנכנס חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electrotransfer, דגירה הממברנה במשך 15 דקות ב 15 מ"ל של החיץ (30 mM טריס-HCl pH7.4, 0.05% Tween 20) עם תסיסה עדינה להסיר SDS שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש בזהירות, כדי להעביר את הממברנה 25 מ"ל של חיץ denaturation (7 מ hydrochloride guanidine, 2 mM EDTA, 50 מ"מ DTT, 50 מ"מ טריס-HCl pH 8.3). ו דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. (הערה: קרום nitrocellulose הופך אטום כאשר מודגרות במאגר denaturation). ו דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הממברנה כדי 25 מ"ל של כפות (10 mM טריס-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) ו דגירה עם תסיסה עדינה 5 דקות (הערה: במהלך שלב זה, הממברנה חוזר הצבע הלבן המקורי שלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הממברנה כדי 25 מ"ל של חיץ מחייב (ראה שלב 1.2) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה הלילה. </li></ol> 4. חיטוט ProIM ידי ProSOL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקרום לשתי רצועות, הן ProIM המכיל ProIM nc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרונות הכלאה ProSOL ו ProSOLnc על ידי דילול הכנה עם 10-10 מיקרוגרם של ProSOL או ProSOLnc ב 10 מ"ל של חיץ מחייב טריים. העברת כל הממברנה לתוך הפתרון הכלאה ProSOL או ProSOLnc ו דגירה עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרומים של פתרונות הכלאה ולשטוף שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד TBS. </li></ol> 5. חזותי חלבונים אינטראקציה ידי immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה עם חלב רזה 2.5% ב TBST (10 mM טריס-HCl, 140 mM NaCl, 0.05 Tween 20%, pH 7.4) עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר. לדלל את הנוגדן הראשוני (אנטי strepII נוגדן ארנבת polyclonal) ב חלב רזה 0.5% ב TBST בריכוז המומלץ על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקרומים חסום בפתרון נוגדן, וטופחו על h 1 בטמפרטורת החדר או את הלילה בבית 4 ° C עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את ממברנות ב TBST 20 מ"ל במשך 15 דקות, ופעמיים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדן משני (אנטי נוגדנים IgG ארנבת) מצומדות עם peroxidase סוס צנון (HRP) ב חלב רזה 0.5% ב TBST בריכוז המומלץ על ידי היצרן. מניחים את הקרומים של נוגדן המשניפתרון דגירה עבור h 1 בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את ממברנות ב TBST 20 מ"ל במשך 15 דקות, ופעמיים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. לאחר השטיפה הסופית ב TBS, לחזות את האינטראקציה בין חלבונים באמצעות מצע chemiluminescence HRP (לדוגמה, Millipore Immobilon המערבי המצע chemiluminescent HRP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקה הממברנות אותו עם הנוגדן העיקרי עבור התג התמזגו ProIM, ואחריו נוגדן המשני המתאים כמתואר צעדים 5.1-5.4. דמיינו ProIM ו ProIMnc כמתואר צעד 5.5 כדי לאמת את זהותו של להקות שהושגו assay שכבת קרום חלבון (שלב 5.5). ברוב המקרים, הפשטת אין צורך, כי את האות המתקבל בשלב זה הוא הרבה יותר חזק האות המתקבל שיורית צעד 5.5. </li></ol> 6. נציג תוצאות: האינטראקציה ANK-MP נצפתה על ידי BiFC בתאי טבק אפידרמיס (איור 1A). מכיוון MP הוא חלבון מסיס ביותר כאשר הביע בחיידקים או בצמחים, קרום חלבון assay כיסוי אומצה כדי לאמת את זה האינטראקציה במבחנה (איור 1B). תמציות חלבון המכיל 1 מיקרוגרם של GST-MP (ProIM) או unfused GST (ProIM nc) נפתרו על ידי אלקטרופורזה בג'ל SDS-polyacrylamide, ואחריו electrotransfer אל קרום nitrocellulose. כאשר אלה ProIMs נבדקו עם מסיסים ANK-strepII (ProSOL), GST-MP, אבל GST לא unfused, הציג מחייב (איור 1B, מסלולים 1, 2, להשוות 5 נתיבים, 6). יתר על כן, כאשר את אותו סט של ProIMs נבדקו עם ProSOLnc שאינו קשור, כלומר NADH ארבידופסיס קינאז cytoplasmic מתויג strepII (NADH3-strepII), לא מחייב לא נצפתה, נוסף הממחיש את הספציפיות של אינטראקציה ANK-MP (איור 1B, נתיבים 3, 4). <img src="/files/ftp_upload/2961/2961fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. מחייב ספציפיות של טבק ANK כדי TMV MP in vivo ו in vitro. (א) ANK-MP האינטראקציה בתאים חיים טבק אפידרמיס זוהה על ידי BiFC. סטרונג אות YFP שוחזר כאשר הפרלמנט ANK, התמזגו בטרמינל C-N-מסוף חצאי YFP, בהתאמה, היו coexpressed באפידרמיס טבק הבאים microbombardment של הגנים המקודדים שלהם. זה אות BiFC שנצבר puncta בשולי התא, אשר אבחון של plasmodesmata 15. (ב) ANK-MP אינטראקציה במבחנה מזוהה על ידי חלבון הממברנה assay כיסוי. תמציות חלבון המכיל 1 מיקרוגרם של GST-MP (ProIM) או unfused GST (ProIMnc) נפתרו על ג'ל SDS-polyacrylamide 15%, ואחריו electrotransfer על קרום nitrocellulose. GST-MPProIM ו GSTProIMnc הודגרו עם 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ANK-strepII (ProSOL), ו ANK מחייב זוהה על ידי חיטוט הממברנה עם נוגדן אנטי strepII ארנב polyclonal, ואחריו נגד ארנב נוגדנים IgG M + משני מצומדות כדי HRP (מסלולים 1 ו -2). לא GST-MPProIM GSTProIMnc ולא תיקשר עם חלבון שאינו קשור, kinase ארבידופסיס cytoplasmic NADH, התמזגו תג strepII (ProSOLnc, נתיבים 3 ו 4). זהותו של הלהקה נצפתה assay זו אושרה על ידי חיטוט הממברנה עם נוגדן אנטי GST (נתיבי 5 ו - 6). כאשר קרום טופלה חיץ denaturation מבלי לשטוף עם חיץ, מחייב של GST-MP כדי ANK הולך לאיבוד, בעוד חלבונים מזוהה הכלול GST-MP ותמציות GST חלבון contining הגיבו ANK-strepII, הממחיש את חשיבות השלב 3.1 לפני תהליך denaturation (נתיבי 7 ו - 8).

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li>
<li>Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> Methods. 45, 196-206 (2008).</li>
<li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li>
<li>Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li>
<li>Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P30+movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+is+a+single-strand+nucleic+acid+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein.</a> Cell. 60, 637-647 (1990).</li>
<li>Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+tobamovirus+movement+proteins+with+the+plant+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton.</a> Science. 270, 1983-1985 (1995).</li>
<li>Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+by+immunogold+cytochemistry+of+the+virus+coded+30+K+protein+in+plasmodesmata+of+leaves+infected+with+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus.</a> Virology. 160, 363-371 (1987).</li>
<li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li>
<li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus%3A+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li>
<li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li>
<li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li>
<li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANK%2C+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein%2C+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li>
<li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP1%2C+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2%2C+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li>
<li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

גישה זו מתאימה בדיקות חלבונים אינטראקציות בין שילובים של חלבונים, כאשר לפחות אחד מהם החלבונים הוא מסיס בקלות למאגר מחייב, והוא מיושם בהצלחה שילוב של חלבונים אחרים 17,18. IInteractions בין חלבונים כי הן מסיס בתנאים אלה לא ניתן לבדוק על ידי פרוטוקול זה. כמו כן, refolding מוצלח של ProIM הוא קריטי עבור assay. שטיפת הממברנה ב TBS לאחר electrotransfer הוא צעד מפתח, משום SDS שיורית יכולה לפגוע בתהליך denatura...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Assay חלבון ערכת </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Proteinase קוקטייל מעכב </td><td> SIGMA </td><td> S8820 </td></tr><tr><td> ה-Mini-פושט צורה ולובש צורה מערכת </td><td> ביו רד </td><td> 165-8000 </td></tr><tr><td> חצי יבש המערבי סופג SD מערכת electrotransfer </td><td> ביו רד </td><td> 170-3940 </td></tr><tr><td> נגד ארנב IgG מצומדות עם peroxidase צנון סוס נוגדן </td><td> GenScript </td><td> A00098 </td></tr><tr><td> Anti-GST ארנב polyclonal נוגדן </td><td> GenScript </td><td> A00097 </td></tr><tr><td> Anti-strepII </td><td> GenScript </td><td> A00626 </td></tr><tr><td> BioTrace, העברת NT קרום nitrocellulose </td><td> מל מדעי </td><td> 27377-000 </td></tr><tr><td> Immobilon המערבי chemiluminescent המצע HRP </td><td> Millipore </td><td> WBKL S0 050 </td></tr></tbody></table>

חלבון ממברנה assay overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

אינטראקציות בין חלבונים שונים לאישור חיוני לחקירה של פונקציות הביולוגיים ברמה המולקולרית. ישנן מספר שיטות, הן במבחנה in vivo, כדי להעריך מחייב חלבון, לפחות שתי שיטות המשלימות את החסרונות של כל אחד אחר צריך להתנהל כדי להשיג תובנות אמין. עבור assay ב vivo, השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) assay מייצג את הגישה הפופולרית ביותר פולשנית לפחות המאפשרת לזהות חלבונים אינטראקציה בתוך תאים חיים, כמו גם לזהות את לוקליזציה תאיים של 1,2 החלבונים אינטראקציה. ב assay זה, אי - ניאון N-ו-C-מסוף חצאים של ה-GFP או גירסאותיה הם התמזגו חלבונים נבדק, וכאשר שני חלבונים היתוך הם הביאו יחד בשל אינטראקציות החלבונים &quot;נבדק, האות ניאון הוא מחדש 3-6 . בגלל האות שלו ניתן לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופיה epifluorescence או confocal, BiFC התפתחה ככלי רב עוצמה של בחירה בין ביולוגים התא ללימוד על חלבונים אינטראקציות בתאים חיים 3. Assay עם זאת, לפעמים יכול להניב תוצאות חיוביות כוזבות. לדוגמה, האות ניאון ניתן מחדש על ידי שני שברים GFP מסודרים ככל 7 ננומטר אחד מהשני בגלל קרוב אריזה בתא subcellular קטן, אלא כי בשל אינטראקציות ספציפיות 7. בשל מגבלות אלה, התוצאות שהתקבלו טכנולוגיות הדמיה תא חי חייבת להיות מאושרת על ידי גישה עצמאית מבוססת על עיקרון שונה לאיתור אינטראקציות חלבון. Co-immunoprecipitation (Co-IP) או גלוטתיון transferase (GST) הנפתח מבחני מייצגים שיטות חלופיות כאלה משמשים בדרך כלל כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים במבחנה. עם זאת, אלה מבחני iIn, לעומת זאת, חלבונים נבדק חייב להיות מסיס בקלות למאגר כי supportsused עבור התגובה מחייב. לכן, אינטראקציות ספציפיות הקשורות חלבון מסיס לא ניתן להעריך על ידי טכניקות אלה. כאן, אנו ממחישים את פרוטוקול עבור assay שכבת קרום חלבון מחייב, אשר עוקף את הקושי הזה. בטכניקה זו, האינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים ניתן לבדוק באופן מהימן כי אחד החלבונים היא משותקת על מטריצה ​​הממברנה. שיטה זו, בשילוב עם בניסויים vivo, כגון BiFC, מספק גישה אמינה לחקור ולאפיין בנאמנות אינטראקציות בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים. במאמר זה, מחייב בין נגיף פסיפס הטבק (TMV) חלבון תנועה (MP), אשר מפעילה פונקציות מרובות במהלך ההובלה התא אל התא ויראלי 8-14, וכן interactor צמח זיהו לאחרונה הסלולר, טבק ankyrin לחזור המכילים חלבון (ANK ) 15, מודגמת באמצעות טכניקה זו.

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו מציגים<em&gt; במבחנה</em&gt; חלבונים assay מחייב בדיקה קרום משותקת חלבון עם חלבון מסיס. Assay זה מספק שיטה אמינה לבדיקת האינטראקציה בין חלבון מסיס לבין חלבון בתמיסה.

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

תיקוף של אינטראקציות בין חלבונים שונים הוא חיוני לחקירת תפקודיהם הביולוגיים ברמה המולקולרית. קיימות מספר...

בדיקת חלבון. אינטראקציה בין חלבונים היא חיונית להבנת התפקוד של חלבונים. סרטון זה מציג בדיקת קישור בין חלבונים in vitro לבחינת האינטראקציה בין חלבון קשור לממברנה או חלבון מקובע לבין חלבון מסיס.ראשית, מבצעים שיבוט, ביטוי ומיצוי של חלבוני היתוך. החלבון הבל מסיס המסומן מקובע על ממברנת ניטרוצלולוז ועובר תהליך קיפול מחדש למבנהו הטבעי. לאחר מכן, סורקים את הממברנה באמצעות חלבונים מסיסים מסומנים ומבצעים אימונו-בלוטינג (immuno blotting) לזיהוי החלבונים.אם החלבונים המסומנים מקיימים אינטראקציה, הם נלכדים על ידי החלבון המקובע לממברנה, ואיתו ייראה אות מה-immuno blotting. לפיכך, בדיקה זו מספקת שיטה מהימנה לבחינת אינטראקציה בין חלבון בלתי מסיס לחלבון בתמיסה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון GST pull down, הוא היכולת להעריך באופן מהימן את הקישור בין חלבון בלתי מסיס לחלבון מסיס in vitro.השלב הראשון של פרוצדורה זו הוא יצירת חלבונים מתויגים גנטית לצורך זיהוי. התחל בשיבוט של החלבון שיוצמד לממברנה. התייחס אליו כאן כ-pro Im עבור החלבון המוצמד (immobilized protein) אל תוך וקטור ביטוי, המקודד לתג גדול כגון GST; וקטור הביטוי הריק, המקודד לתג בלבד, ישמש כביקורת שלילית לחלבון המוצמד, והוא מכונה pro IM nc.בשלב הבא, שבטו את החלבון שישמש כגשש מסיס לתוך וקטור ביטוי, המקודד לתג שונה כגון strep two. חלבון זה ייקרא prosol עבור soluble protein. כביקורת שלילית, שבטו חלבון מסיס המשמש כביקורת שלילית לתוך אותו וקטור ביטוי. זה ייקרא Prosol NC עבור soluble protein negative control.בשלב הבא, השתמש במערכת ביטוי חלבונים כגון coli או נגיף balo כדי לבטא את החלבונים המסומנים. יש לבחור את מערכת הביטוי בזהירות בהתאם לדרישות למודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות. הוצא את החלבונים המבוטאים מהאורגניזם הנבחר. עבור pro IM ו-pro I mnc Resus.שעו את התאים בבופר טעינה ל-SDS page המכיל תערובת מעכבי פרוטאז. לאחר מכן, הרתיחו את התאים למשך חמש דקות, וצנטריפוגו אותם כדי להסיר את המשקע לצורך מיצוי Prosol ו-prosol NC. השתמשו בפרוטוקולים סטנדרטיים. ניתן למצות את pro IMS בתנאי דנטורציה, כיוון שהחלבונים יעברו קיפול מחדש לאחר קיבועם בממברנת הניטרוצלולוז.עם זאת, יש להפיק את ה-prosol כדי לספק אישור טבעי (native confirmation), כיוון שהם יתווספו לתמיסת הקישור (binding buffer) לאחר הפקת החלבונים המסומנים. קבע את ריכוז החלבונים הרקומביננטיים באמצעות שיטה סטנדרטית כגון ערכת בדיקת חלבונים של BioRad. זאת במקרה שבו ייעשה שימוש בתמצית גולמית (crude extract) במקום בחלבון מטוהר לצורך הבדיקה.העריכו את ריכוז החלבון הנחקר באמצעות דנסיטומטריה סורקת של הפס המתאים בג'ל SDS-polyacrylamide שנצבע ב-kumasi, תוך שימוש בריכוזים ידועים של BSA כרפרנס. לאחר מכן, שרטטו את עקומת הסטנדרט בהתבסס על עוצמות האות שנמדדו בדנסיטומטריה הסורקת של ה-BSA, וחשבו את כמות החלבון הנמצאת בתמצית הגולמית.השלב הבא של הפרוצדורה הוא קיבוע של pro Iam ו-pro IAM NC על הממברנה. התחילו בהעמסה של מיקרוגרם אחד מכל אחד מתמציות ה-pro Iam וה-pro IAM NC, בשכפולים, על ג'ל SDS poly acrylamide. לאחר האלקטרופורזה, הוציאו את הג'ל מלוחות הזכוכית והניחו אותו ב-100 milliliters של תמיסת מעבר (transfer buffer), ולאחר מכן הדגירו עם ערבוב עדין למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.בעקבות הדגירה, בצע western blot להעברת החלבונים לממברנת ניטרוסלולוז, ולאחר ההעברה אפשר לחלבונים הקשורים לממברנה להתקפל מחדש. הנח את הממברנה ב-15 milliliters של בופר A ודגור אותה תחת ערבוב עדין. כדי להסיר SDS ששאר, דגור למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר תחת ערבוב עדין.לאחר הדגירה, הוצא בזהירות את הממברנה מהבופר. לאחר מכן, הנח את הממברנה ב-25 milliliters של בופר דנטורציה. הדגר למשך שעתיים בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב עדין.במהלך האינקובציה, ממברנת הניטרוצלולוז תהפוך לאטומה. לאחר מכן, העבירו את הממברנה באמצעות פינצטה ל-25 milliliters של TBS והדגירו עם ניעור עדין למשך חמש דקות. בשלב זה, הממברנה חוזרת לצבעה הלבן המקורי.בשלב הבא, העבירו את הממברנה ל-25 milliliters של חוצץ קישור (binding buffer). דגרו בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עם ניעור עדין למשך לילה. לאחר מכן, נעשה שימוש בחלבון המומס כדי לבדוק את הממברנה עבור החלבון המקובע.ראשית, הכינו את בופרי ההיברידיזציה: דללו 1 עד 10 מיקרוגרם של prosol ו-prosol NC במבחנות נפרדות המכילות 10 מיליליטר של בופר קישור (binding buffer) טרי. לאחר מכן, העבירו את הבופר לשקית היברידיזציה. בשלב הבא, גזרו את הממברנה לשני פסים, שניהם מכילים pro IM ו-pro IAM nc.ממברנות אלו יוכנסו לתמיסות ההיברידיזציה. העבירו כל ממברנה לתמיסות ההיברידיזציה prosol או prosol NC והדגירו למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב עדין. הוציאו את הממברנות מתמיסות ההיברידיזציה ושטפו אותן שלוש פעמים למשך 15 דקות ב-TBS.כדי להדמיאן אינטראקציות בין חלבונים, חסמו את הממברנה באמצעות 2.5% skim milk ב-TBST למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, הניחו את הממברנות החסומות בתמיסת הנוגדן הראשוני. במקרה זה נעשה שימוש ב-anti strep two polyclonal rabbit antibody.דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין לאחר הדגירה. שטפו את הממברנות ב-20 milliliters של TBST למשך 15 דקות, ופעמיים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין. לאחר מכן, הניחו את הממברנות בתמיסת הנוגדן השני המצומד ל-HRP; כאן נעשה שימוש בנוגדן anti rabbit IgG המצומד ל-HRP.דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב עדין. שטפו את הממברנות ב-20 milliliters של TBST למשך 15 דקות, ופעמיים נוספות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין כפי שבוצע קודם לכן; לאחר השטיפה הסופית ב-TBS, הדמינו את האינטראקציה בין החלבונים באמצעות סובסטרט כימילומינסנטי HRP (מבית Millipore, Molan Western Chemiluminescent).משתמשים בתשתית HRP לאחר ביצוע אימונו-בלוטינג של ה-prosol. יש לשטוף את הממברנה ב-TBST למשך 15 דקות, ולאחר מכן פעמיים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לבצע דגימה חוזרת של הממברנות באמצעות הנוגדן הראשוני עבור ה-tag ל-pro.לאחר מכן מוסיפים את הנוגדן המשני המתאים. יש להדמיא את PRO I ו-pro Im NNC באמצעות גילוי כימילומינסנציה כדי לאמת את זהות הפסים שהתקבלו במבחן חפיפת ממברנת החלבון (protein membrane overlay assay). האינטראקציה בין החלבונים A ו-K לבין YFP ו-MP CYFP נבחנה בתאי אפידרמיס של טבק באמצעות השיטה המתוארת בסרטון זה, כפי שמוצג כאן.כאשר נבדלה השלמה פלואורסצנטית של במולקולות (biomolecular fluorescence complementation), שוחזר אות YFP חזק. אות BFC זה הצטבר ב-Punta להיקף התא, המהווה סימן מאפיין לממברנת הפלזמה מכיוון ש-MP הוא חלבון שאינו מסיס במידה רבה. כאשר החלבון בוטה בחיידקים או בצמחים, אומץ מבחן כיסוי ממברנת חלבון (protein membrane overlay assay) כדי לתקף אינטראקציה זו.תמציות חלבונים in vitro המכילות מיקרוגרם אחד של GST MP או GST לא מאוחה הופרדו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד-SDS, ולאחריה העברה חשמלית לממברנת ניטרוסלולוז. כאשר דגימות אלו נבדקו עם soluble a nnk strep two, ה-GST mp הפגין קישור, אך לא ה-GST הלא מאוחה. יתרה מכך, כאשר אותה קבוצת דגימות נבדקה עם חלבון לא קשור, Arabidopsis Cytoplasmic, NADH kinase tagged strep two, לא נצפה קישור, מה שמעיד עוד יותר על הספציפיות של האינטראקציה של A NK MP. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למלא מחדש את החלבונים המקובעים כראוי בהתאם לפרוטוקול המוצג.

protein-membrane-overlay-assay-protocol-to-test-interaction-between

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים וריאציה של (immunoprecipitation כמותיים בשילוב עם מציאה) הגישה המהירה שהוצגה בעבר להבחין בין אמת ושקר אינטראקציות בין חלבונים. הגישה שלנו מבוססת...

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

סרטון זה מדגים קומפלקסים של חלבונים בעלי זירוז חיסוני משותף על קרום PVDF לצורך ניתוח אינטראקציה בין חלבון לחלבון. החלבונים המופחתים מקומפלקסים טופלו בטריפסין כדי לבקע את החלבונים הבודדים בפפטידים הקטנים יותר, ולאחר מכן, שאר הפפטידים הופקו מקרום PVDF. הפפטיד הנמשך שמקורו בשני החלבונים בקומפלקס יובש והושעה מחדש בריכוז נמוך של חומצה פורמית לניתוח נוסף.

עיכול חלבונים על הממברנה להכנת חלבונים בעלי קו-אימונוזיקציה למחקרי אינטראקציה

בסרטון זה, הדגמנו טיהור זיקה דו-מולקולרית, BiCAP, כדי לזהות ולבודד דימרים חלבוניים ספציפיים באמצעות נוגדנים ספציפיים ספציפיים לתחום יחיד.

טיהור זיקה דו-מולקולרית לבידוד שני חלבונים המקיימים אינטראקציה

גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה בVivo

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

כאן, אנו מציגים עבור co-immunoprecipitation ואת וזמינותו של פעילות אנזימטי על חרוזי ללמוד בו זמנית את התרומה של חלבון ספציפי דומיינים של קולטני ממברנה פלזמה אנזים הגיוס והן פעילות אנזים פרוטוקול.

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור ביוכימית מחוץ למבחנה המשתמשת בתוויות ביוטין שעשוי להיות מתאים באופן נרחב עבור לימוד אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה.

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של חלבונים התאגד כדי אינוזיטול פוספטים או פוספופנוסיידים. היא משתמשת בכרומטוזיקה באמצעות מלחי הביוטיטול או פוספופנוסידים הנמצאים בדרך streptavidin לחרוזים או חרוזי מגנטים. אינוזיטול פוספט או פוספוליזיסיטייז מחייב חלבונים מזוהים על ידי בלוק מערבי או ספקטרומטריה מאסיבית.

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה כדי למדוד במהירות ובאופן חצי שוויוני אינטראקציות קולטן ליגנד בטרנס במערכת תאים הטרולוגית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

למדו שיטת חלבון ממברנה Assay Overlay לבדיקת אינטראקציות בין חלבונים מסיסים ולא מסיסים במבחנה. הפרוטוקול כולל שיבוט, ביטוי, הימצאות על ממברנה ואימונובלוטינג לאימות הקשרים.

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה

גלה סרטונים נוספים