הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

אספקת 2 איים סוכרת סוג למחקר אינה מספיקה. כאן אנו חולקים פרוטוקול שלנו לבידוד איים של חולים שעברו pancreatectomy חלקית. גישה זו מהווה מקום מפגש ייחודי לקבלת איים של סוכרת מסוג 2 שאינם מתאימים קלינית סוכרת הנושאים במספרים נאותה מחקרים בסיסיים וקליניים.

שלום, אני פלוריאן אל מהמחלקה לכירורגיה באוניברסיטה הטכנית בטריטון. היי, אני גרגור שר, גם הוא מהמחלקה לכירורגיה בבית החולים האוניברסיטאי. בגרייסטון.

מחקר על ביולוגיה ותפקוד של עפעפיים נחוץ נואשות כדי לקדם את ההבנה שלנו לגבי פיזיולוגיה של עפעפיים ופתוגנזה של סוכרת. למרבה הצער, קשה מאוד להשיג עפעפיים אנושיים של חולי סוכרת שאינם סוכרתיים וסוכרתיים מסוג 2. רצף הווידאו הבא יראה לך פרוטוקול כיצד לבודד עפעפיים אנושיים מחולי אופטימיזציה חלקית של הלבלב.

הלולאות שנרכשו כך יכולות לעבוד כמערכת חוץ גופית לניתוח פונקציונלי. כריתה כירורגית של רקמת לבלב אנושית היא התנאי המוקדם לבידוד לולאות אנושיות. אנו מסתמכים על חולים שעוברים כריתה חלקית של הלבלב עבור פתולוגיות ספציפיות של הלבלב.

כמקור לרקמת לבלב אנושית, המנתח חותך את הלבלב ומבצע את הכריתה החלקית. לאחר מכן, דייגי הלבלב מונחים על קרח ומובלים למחלקה לפתולוגיה. הפתולוג קובע את כמות רקמת הלבלב הבריאה והרכה שיש לרכוש.

לצורך בידוד העפעפיים נדרשים לפחות שני גרם רקמת לבלב לבידוד. הרקמה מונחת בתמיסת ucon ונישאת על קרח למעבדה. השלב הראשון במתקן בידוד העפעפיים הוא מדידת משקל רקמת הלבלב.

לאחר מכן מניחים את הדגימה בצלחת של 10 סנטימטרים. כבר הכנו בקבוק אחד של 500 מיליליטר עם 150 מיליליטר של מדיה RPMI ובקבוק של 1 250 מיליליטר עם 130 מיליליטר של מדיה RPMI. לאחר מכן אנו מוסיפים את תמיסת אנזימי העיכול המכילה מיליליטר אחד של DNA ו-20 מיליליטר קולגנאז לבקבוק של 250 מיליליטר ומושכים אותו למזרק של 10 מיליליטר.

רקמת הלבלב הנקייה מתרחבת לאחר מכן על ידי הזרקת האנזים המכיל מדיה וטוחנת לחתיכות קטנות כדי להגדיל את שטח הפנים ולהקל על תהליך העיכול. שלב טחינה זה הוא קריטי מכיוון שהנפחה בהזרקה בלבד אינה מאפשרת פיזור תקין של האנזים בתוך הרקמה. במקביל, הרכבנו את מעגל העיכול.

כפי שמוצג באיור זה, כיוון הזרימה בתא המוקלט הוא פנימה בתחתית והחוצה בחלק העליון של החדר. לאחר מכן, אנו נמצאים בחומר המכיל את האנזים הנותר לבקבוק של 500 מיליליטר עד לנפח של 300 מיליליטר, ולאחר מכן מכניסים את המדחום. החדר המוקלט מכיל רשת מתכת בקוטר גרוע של 600 מיקרומטר וגולות סיליקון ניטריד חופשיות בקוטר 15 מילימטר כל אחת.

אנו מעבירים את רקמת הלבלב לתא, מכניסים את הרשת, סוגרים את החדר ומפעילים את המשאבה במהירות של 140 מיליליטר לדקה. ברגע שטמפרטורת המעגל מגיעה ל -37 מעלות צלזיוס, אנו מתחילים למדוד את זמן העיכול. החדר המוקלט מטלטל ביד בהתאם להרכב הרקמות.

כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלית לעצירת העיכול, אנו לוקחים דגימות תקופתיות, כתמי טיסון, הלולאות המופרדות אדומות מתחת למיקרוסקופ. ברגע שנראה שהלולאות מופרדות מרקמת האיינו, עצרנו במהירות את העיכול על ידי הנחת סליל החימום על קרח והוספנו 200 מיליליטר של אמצעי שטיפה קרה למעגל. לאחר מכן, אנו אוספים את תמיסת העפעפיים על ידי החדרת צינור הדגימה לבזים של 250 מיליליטר עד שהמעגל ריק.

הליך הכביסה הבא מתחיל בשלב הצנטריפוגה של 1000 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בשלב הבא אנו משליכים את תמיסת העפעפיים בחומר כביסה ומפיצים אותה בשברים שווים לבזים של 50 מיליליטר. הכביסה ממשיכה בצעד צנטריפוגה נוסף של 1000 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

כשלב אופציונלי, אנו מחלקים את הפלטה לבזים נוספים מעבר לארבעת הבזים המקוריים, בהתאם לגודל הפלטה. על מנת לשפר את הכביסה, שוב, אנו משליכים את ה-sup natant ומשחררים בעדינות את החך להפרדת העפעפיים מרקמת ה-aine. צפיפויות הרקמות השונות של שני החלקים מאפשרות יישום שיפוע צואה.

ראשית, אנו משעים את הגלולה בצפיפות בינונית צואתית 1.1 25 גרם למיליליטר. הגלולה חייבת להיות קטנה מספיק כדי לאפשר השעיה הומוגנית. לאחר מכן, אנו מכסים זאת לאט לאט עם צפיפות המדיה הצואתית 1.0 81.0 60 ו-1.0 37 בנפח של 10 מיליליטר כל אחד.

לאחר מכן, אנו צנטריפוגות דה שיפועים ב -2, 400 סל"ד למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כעת ניתן להבחין בין הרכיבים השונים המופרדים על ידי הצפיפות שלהם בשברים. ראשית, אנו משליכים את השכבה העליונה המורכבת משומן ורקמת חיבור.

השבר שאנו אוספים כעת הוא השכבה הראשונה של אגרגט העפעפיים ב-1.037 ו-1.06, המכילה בעיקר את הלולאות המבודדות. לבידוד יעיל, חשוב לאסוף את השברים בנפרד. לאחר מכן אנו אוספים את החלק של אגרגט העפעף השני בממשק של 1.0 60 ו-1.0 80, המכיל פחות לולאות טהורות מהשכבה הראשונה.

לאחר מכן, אנו מוסיפים את מדיית הכביסה לנפח כולל של 50 מיליליטר על מנת לדלל את שיפוע הצואה ולשלוח ל-FUT ב-1000 סל"ד למשך חמש דקות. בארבע מעלות צלזיוס, אנו משליכים את חומר ה-SUP על ידי יניקה מכיוון שהחך עלול להיות רופף מאוד בגלל הכתם הקר. לפיכך, עלינו לחזור על שלב הכביסה עם מדיית תרבית עפעפיים ב -1000 סל"ד למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בשלב האחרון, אנו משעים מחדש את התרבות האנושית, המדיה והתרבות. הלולאות שנאספו בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות. לאחר שלב תרבות זה, העפעפיים מוכנים להמשך עיבוד.

פרוטוקול זה אמור לאפשר לך לבודד עפעפיים אנושיים מרקמת הלבלב לאחר כריתה חלקית של הלבלב. ההובלה המהירה והקרירה של דייגי הלבלב למתקן בידוד העפעפיים חשובה לשמירה על כדאיות התאים הטובה יותר. צוות הבידוד צריך לזכור שתהליך העיכול הוא הליך דינמי ביותר.

משך תהליך העיכול תלוי מאוד בהרכב הרקמות. לדוגמא, דרגת הפיברוזיס והיכולת של הזרקת אנזים מספקת לרקמת הלבלב. ההתאמה האישית של הכוח המכני בתוך התא המוקלט ואורך תהליך העיכול חיוניים לתפוקת עפעפיים טובה.