Name: הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: למדו שיטה לבידוד איי לנקראת מרקמת הלבלב בחולים שעברו כריתת לבלב חלקית. הפרוטוקול משתמש בעיכול אנזימטי וסנטיפוגה צפיפות להפרדת האייים לצורך מחקר סוכרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות עמיתים רבים שלנו שסיפק לעזרה, ייעוץ קלט קריטיים בשלבים שונים של הפרויקט. הפקה של מאמר זה וידאו נתמך בכספי משרד הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF) אל המרכז הגרמני לחקר הסוכרת (DZD, <a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a> ), IMIDIA ( <a href="http://www.imidia.org">http://www . imidia.org</a> ) ו מבית החולים האוניברסיטאי קרל גוסטב Carus באוניברסיטת טכנולוגיה דרזדן. המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מתוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013) עבור יוזמת לרפואה חדשני תחת ההסכם להעניק n ° 115005.

1. רקמת לבלב אוסף בחדר הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המנתח מבצע כריתה חלקית של הלבלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהניח את הדגימה הלבלב בקופסה על הקרח, להעביר אותו מיד אל הפתולוג. </li></ol> 2. רקמות מבחר לבידוד איון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתולוג בוחר רקמות שמופיע רך ובריא, שמירה על רקמות פגועות למטרות אבחון. דגימות רקמה Fibrotic מציע פחות מ -2 גרם של רקמה שמיש מודרים מהבידוד איון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את רקמת הלבלב פתרון קולינס אירו ולספק על הקרח למעבדה. </li></ol> 3. בידוד של איים אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את רקמת לבלב, ואז למקם אותה לתוך צלחת 10 ס"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימי 150 מ"ל RPMI התקשורת בקבוק 500 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל בקבוק 250 מ"ל, להכין את הפתרון אנזים העיכול על ידי שילוב של 130 מ"ל RPMI התקשורת עם DNase 100 מ"ג / מ"ל ​​ו - 20 מ"ל של RI Liberase 5mg/ml. צייר 10 מ"ל של פתרון זה לתוך מזרק להזריק את רקמת לבלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הפתרון אנזים העיכול לרקמת הלבלב, במטרה להתנפח זה הומוגנית. אם זה מונע על ידי פיברוזיס, עיכול צפוי להיכשל. בשלב הבא, לקצץ את הרקמה לתוך מ"מ 4 ~ 3 חתיכות על הקרח. </li></ol> 4. הלבלב האנושי העיכול מעגל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מעגל העיכול כפי שמוצג באיור 1. כיוון הזרימה בתא Ricordi נמצא בתחתית ומחוץ בחלק העליון של החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת האנזים הנותרים העיכול פתרון בקבוק 500 מ"ל עד נפח כולל של 300 מ"ל ולהוסיף מדחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את רקמת לבלב לתוך החדר, להכניס את רשת (קוטר הנקבוביות: 600 מיקרומטר) ושלושה סיליקון ניטריד גולות (קוטר: 15 מ"מ), לסגור את החדר ולהתחיל את המשאבה עם הזרם נקבע על 140 מ"ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הטמפרטורה של המעגל מגיע 37 ° C, להתחיל העיתוי מעת לעת לקחת דגימות כדי לקבוע מתי להפסיק את העיכול. מכתים עם dithizone (2 מ"ג / מ"ל) מאפשר להדמיה מיקרוסקופית של איים בתוך הרקמה מתעכל 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איים מופרדים acinar הרקמה שמסביב, במהירות להפסיק את מערכת העיכול על ידי הנחת סליל חימום על הקרח והוספת 200 מ"ל של התקשורת לשטוף קר (900 מ"ל RPMI 1640 עם גלוקוז 5.5 מ"מ ו 10% FBS) למעגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הפתרון איון ב 250 מ"ל צינורות חרוטי כפי שהיא באה מתוך הצינור המדגם. המשך עד מעגל ריק. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. המעגל האנושי עיכול הלבלב מעגל אנושי עיכול הלבלב כולל תא Ricordi המכיל רשת (קוטר הנקבוביות: 600 מיקרומטר) ושלושה סיליקון ניטריד גולות (קוטר: 15 מ"מ). יצוא מהאולם הוא מונע את הבקבוק אוסף רקמות על ידי המשאבה peristaltic (140 mL / min). החצים מצביעים על כיוון הזרימה. הטמפרטורה האופטימלית עיכול אנזימטי מתוחזק על ידי טבילה סליל חימום אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. 5. כביסה לאחר עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 250 צינורות חרוטי מ"ל המכיל את פתרון איון ב 1000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend גלולה איון בכביסה התקשורת (900 מ"ל RPMI 1640 עם גלוקוז 5.5 מ"מ ו 10% FBS) ולהפיץ אותו שברים שווה 50 מ"ל צינורות חרוטי. (אופציונאלי:. הפץ לתוך צינורות חרוטי נוספים כדי לשפר את הכביסה) צנטריפוגה ב 1000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant בעדינות לשחרר כדורי ידי ניעור ידניות. </li></ol> 6. טיהור על שיפוע Ficoll <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם Ficoll המדיה צפיפות של 1.125 גרם / מ"ל, pH 7.4 לאט כיסוי aliquots 10 מ"ל של התקשורת Ficoll עם צפיפות של 1.080, 1.060 ו - 1.037 גרם / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדרגתיים Ficoll ב 2400 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li></ol> 7. איילט אוסף ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, מרכיבים רקמות שונות ניתן להבחין על ידי מחיצות שלהם שיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השכבה העליונה המורכבת של רקמת שומן ועל החיבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות מסיק את השכבה הראשונה של אגרגטים איון בכל שלבי הביניים גרם / מ"ל ​​1.037-1.060. שכבה זו מכילה את איים מבודדים הטהורה ביותר. איסוף שברים בנפרד עבור בידוד יעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את שבריר השנייה, פחות טהור של אגרגטים איון בכל שלבי הביניים גרם / מ"ל ​​1.060-1.080. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את שיפוע Ficoll ידי הוספת אמצעי התקשורת לשטוף (900 מ"ל RPMI 1640 עם גלוקוז 5.5 מ"מ ו 10% FBS) על כל צינור חרוטי עד נפח כולל של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 1000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ידי יניקה. השתמש טיפול כמו גלולה עשוי להיות רופף בשל השיפוע Ficoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את wi כדוריה לשטוף מדיה (900ml RPMI 1640 עם גלוקוז 5.5 מ"מ FBS 10%) צנטריפוגות ב 1000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חזור על תרבות התקשורת באמצעות איון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend איים בתקשורת תרבות למקם אותם בחממה עם 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות לפני עיבוד נוסף. </li></ol>

<ol><li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes%3A+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li>
<li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li>
<li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li>
<li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., Jäger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li>
<li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pancreatic+diabetes+%28type+3c+diabetes%29+underdiagnosed+and+misdiagnosed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?</a> Diabetes Care. 31, Suppl 2. S165-S169 (2008).</li>
<li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, Suppl 1. S7-S12 (2008).</li>
<li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin%2C+GAD%2C+and+ICA512bdc%2FIA-2+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li>
<li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition%2C+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1%3A+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li>
<li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+of+Purified+%7Bbeta%7D-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

באמצעות פרוטוקול שלנו, איים אדם יכול להיות מבודד רקמת לבלב שנאספו pancreatectomy חלקי. ההצלחה של פרוטוקול זה מסתמך על הטיפול נלקח במהלך כמה נקודות קריטיות. כדי לשמר את הכדאיות תא בטא, זה חיוני כי את הדגימה להיות מועבר במהירות על הקרח למעבדה. בנוסף, משך הזמן של עיכול רקמות חייב להיות מותאם באופן אמפירי לפי כיתה של סיסטיק הרקמה ואת הפעילות האנזימטית של התקשורת. זה נכון גם לגבי מידת כוח מכני להחיל באופן ידני את תא Ricordi. לכן כדי להשיג תשואה טובה איון, הפרוטוקול מבוצע על ידי מיטב מדען ייעודי או עוזר טכני. הכישלון הראשוני הוא הנורמה, אלא אם כן צוות מנוסה כבר בבידוד איון. ישנם הבדלים מרכזיים בין פרוטוקול שלנו איון הבידוד והבידוד תקן אנושי איון השיטה: 1) למרות שאנו משתמשים רקמת לבלב נתון כמה שעות של איסכמיה במהלך ההליך הכירורגי, הוא מעובד באופן מיידי באתר. זה בניגוד pancreata explanted מ מוות מוחי תורמים עבור הלבלב / איון השתלה, אשר נשארים איסכמי במשך כמה שעות במהלך הקצאת משלוח למתקן בידוד איון. 2) אנו collagenase להזריק ישירות לתוך רקמות הלבלב, בעוד פרוטוקול הסטנדרטי הוא להחדיר אותו לתוך צינור הלבלב. 3) יש להפריד בין איים באמצעות שיפוע Ficoll רציפה במקום איסוף איים של צבע Ficoll רציפה תוך שימוש במעבד תא COBE. במקרים בהם את הדגימה כירורגית fibrotic מדי או מועט לבידוד מספר מספיק של איים, רקמה ניתן עדיין לאחזר באמצעות microdissection ללכוד לייזר (LCM) 10. זה מאפשר ביטוי נתונים גנטי כדי להיות התאושש הדגימה כמעט בכל, אפילו אם נכשל או בידוד איון התשואה היא נמוכה מאוד. למרבה הצער, LCM אינו מייצר תאים חיים ללימודי תפקודית כמות שלהם אינה מספיקה בדרך כלל לניתוח proteomic. כך, באמצעות LCM במקביל פרוטוקול collagenase העיכול שלנו כדי לאחזר את האיונים עשויה להיות הדרך היעילה ביותר דגימות תהליך כירורגי. כאשר איסוף רקמה לבידוד איון מ pancreatectomies חלקית, חשוב לבחון היטב ההיסטוריה הקלינית של המטופל ואת מצב מטבולי. המטופל pancreatectomized חלקית עשויים להיות מושפעים על ידי סוג 3c סוכרת, סוכרת כלומר משני להפרעה הלבלב מוביל לניתוח 6. בקרב 43 חולים המשתתפים שעברו את הניתוח הזה במחלקה שלנו בשנת 2010, 32 היו ללא סוכרת, 5 הושפעו סוכרת מסוג 2 ו 6 סבלו מסוכרת מסוג 3c. נתונים אלה מסכימים עם מחקרים קודמים מצביע על חילוף החומרים של הגלוקוז לקויי סוכרת חלק ניכר של חולים הסובלים מסרטן הלבלב או דלקת לבלב כרונית 6. שקלנו סוכרת להיות המוצא העיקרית, אם היא אובחנה לפחות שנה לפני הופעת התסמינים מובילים ניתוח לבלב 7. רמות של נוגדנים נגד איון autoantigens צריך להיות גם נמדד להעריך ממוצא אוטואימוניות הפוטנציאל של סוכרת 8. בגלל מטופל עובר pancreatectomy יכול סובלים מסוכרת או להיות מאובחן גלוקוז סובלנית, לא כל החולים בסוכרת יש לתת גלוקוז דרך הפה סובלנות בדיקה לפני pancreatectomy 9.

הבידוד של איי האדם מן המטופלים pancreatectomized חלקית

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

חקירות בפתוגנזה של סוכרת מסוג 2 איי לנגרהנס תקלה 1 כבר הקשו על ידי זמינות מוגבלת של איים סוכרת מסוג 2 איברים מתורמים 2. כאן אנו חולקים פרוטוקול שלנו לבידוד איים מ רקמת לבלב אנושיים המתקבל סוכרת מסוג 2 שאינם סוכרתיים המטופלים שעברו pancreatectomy חלקית עקב מחלות שונות הלבלב (גידולים שפירים או ממאירים הלבלב, דלקת לבלב כרונית, ואת צינור המרה המשותף או התריסריון גידולים) . כל החולים המעורבים נתנו הסכמתם במחקר זה, אשר גם אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. דגימות כירורגית נמסרו מיד הפתולוג שבחרו רך ובריא רקמת לבלב המופיעים לבידוד איון, שמירה על רקמות פגועות למטרות אבחון. מצאנו כי על מנת לבודד יותר מ -1,000 איים, היינו צריכים להתחיל עם לפחות 2 גרם של רקמת לבלב. חיוני גם בפרוטוקול שלנו היתה בעליל להתנפח כאשר הרקמה הזרקת האנזים המכילים התקשורת ובהמשך לקצץ בו כדי לסייע לעיכול על ידי הגדלת שטח הפנים. כדי להרחיב את הישימות של פרוטוקול שלנו לכלול את התיק מדי פעם שבה כמות גדולה (&gt; 15g) של רקמת לבלב אנושיים זמין, השתמשנו קאמרית Ricordi (50 מ&quot;ל) לעכל את הרקמה. במהלך העיכול, אנו ידני הרעיד את חדר Ricordi 3 בעוצמה כי מגוונות על ידי דגימה לפי רמתו של סיסטיק רקמות. שיפוע Ficoll discontinous שימש אז להפריד בין איים מרקמות acinar. אנו לציין כי רקמת גלולה צריך להיות קטן מספיק כדי להיות resuspended homogenously עם צפיפות של 1.125 גרם / מ&quot;ל ​​במדיום Ficoll. לאחר בידוד, אנו תרבותי איים בתנאי הלחץ בחינם (לא רועד או סיבוב) עם 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפחות על מנת לאפשר התאוששות פונקציונלי שלהם. יישום נרחב של פרוטוקול שלנו לשיפור עתידה יכול לאפשר את הקטיף בזמן של כמויות גדולות של איים האדם מן סוכרת קלינית מתאימים שאינם סוכרתיים נושאים, מאוד לקידום מחקר הסוכרת מסוג 2.

הפרוטוקול שלנו הניב ממוצע של כ-500 איים לגרם של רקמת לבלב, אם כי נתון זה השתנה מאוד בין הדגימות, בעיקר עקב הבדלים בפיברוזיס ובפעילות הקולגןאז. השגנו טוהרה של איים של &gt; 90% על ידי צביעה ראשונית ב-Dithizone במהלך עיבוד הרקמה, ולאחר מכן בחירה ידנית 24 שעות לאחר הבידוד. כדי לקבוע את איכות האיים המטוהרים, בדקנו הפרשת אינסולין מעוררת גלוקוז בריכוז 25 mM בתנאים סטטיים למשך 2 שעות. מצאנו הפרשת אינסולין הדומה לזו של איים שהתקבלו ממרכזי בידוד והשתלה של איים ב-ECIT. מאחר שאיים שבודדו מלבלבים שעברו כריתה חלקית אינם מיועדים להשתלה, הערכת ה-IEQ הכולל לא נחשבה לגורם קריטי.
באופן חשוב, השיטה שלנו אפשרה לנו לבודד איים עבור מחקרים פונקציונליים מ-25 מטופלים שעברו כריתה חלקית של הלבלב בין השנים 2005 ו-20085. איים אלה נותחו לבדיקת הפרשת אינסולין בגירוי גלוקוז וביטוי חלבון ספציפי באמצעות western blotting ואימונוהיסטוכימיה. ניתן להשתמש באיים שבודדו מלבלבים שעברו כריתה חלקית גם כדי להשוות פרופילי ביטוי של גנים וחלבונים, מראה אולטרה-מבני ותגובות פונקציונליות של איים של חולי סוכרת לעומת איים של אנשים שאינם חולי סוכרת. מכיוון שישנם יותר מטופלים העוברים כריתה חלקית של הלבלב מאשר תורמי איברים, הפרוטוקול שלנו עשוי לאפשר איסוף של מספיק דגימות ונתונים לצורך ניתוח סטטיסטי מסיבי.

אספקת 2 איים סוכרת סוג למחקר אינה מספיקה. כאן אנו חולקים פרוטוקול שלנו לבידוד איים של חולים שעברו pancreatectomy חלקית. גישה זו מהווה מקום מפגש ייחודי לקבלת איים של סוכרת מסוג 2 שאינם מתאימים קלינית סוכרת הנושאים במספרים נאותה מחקרים בסיסיים וקליניים.

הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

חקירות של הפתוגנזה של סוכרת מסוג 2 ותפקוד לקוי של איים של לנגרהנס (islets of Langerhans) 1 הופרו עקב הזמינות המוגבלת של סוכרת מסוג 2...

שלום, אני פלוריאן אל מהמחלקה לכירורגיה באוניברסיטה הטכנית בטריטון. היי, אני גרגור צ'ר, גם אני מהמחלקה לכירורגיה בבית החולים האוניברסיטאי בגרייסטון.מחקר על הביולוגיה והתפקוד של העפעפיים נחוץ ביותר כדי לקדם את הבנתנו לגבי פיזיולוגיית העפעפיים והפתוגנזה של סוכרת. למרבה הצער, קשה מאוד להשיג עפעפיים אנושיים מחולים שאינם סוכרתיים ומחולים עם סוכרת מסוג 2. רצף הסרטון הבא יציג לכם פרוטוקול לבידוד עפעפיים אנושיים ממטופלים שעברו כריתה חלקית של הלבלב.האיליטים שהושגו באופן זה יכולים לשמש כמערכת in vitro לניתוח תפקודי. כריתה כירורגית של רקמת לבלב אנושית היא התנאי המקדם לבידוד איליטים אנושיים. אנו מסתמכים על מטופלים העוברים כריתה חלקית של הלבלב עקב פתולוגיות ספציפיות של הלבלב.כמקור לרקמה לבלבית אנושית, המנתח מבצע חיתוך בלבלב ומבצע כריתה חלקית. לאחר מכן, הרקמה הלבלבית מונחת על קרח ומועברת למחלקה הפתולוגית. הפתולוג קובע את כמות הרקמה הלבלבית הרכה והנראית בריאה שיש להשיג.עבור בידוד ה-eyelid, נדרשים לפחות שני גרמים של רקמת לבלב לצורך הבידוד. הרקמה מונחת בתמיסת ucon ומועברת בקרח למעבדה. השלב הראשון במתקן לבידוד ה-eyelid הוא מדידת משקל רקמת הלבלב.לאחר מכן מניחים את הדגימה בצלחת בקוטר 10 סנטימטר. הכנו כבר בקראול אחד בנפח 500 מיליליטר עם 150 מיליליטר של מצע RPMI ובקראול אחד בנפח 250 מיליליטר עם 130 מיליליטר של מצע RPMI. לאחר מכן נוסיף לבקראול בנפח 250 מיליליטר את תמיסת אנזים העיכול המכילה מיליליטר אחד של DNAs ו-20 מיליליטר של collagenase, ונשאב אותה למזרק של 10 מיליליטר.לאחר מכן, הרקמה הלבלבית המנוקה מורחבת על ידי הזרקה של המצע המכיל את האנזים ונקצצת לחתיכות קטנות כדי להגדיל את שטח הפנים ולהקל על תהליך העיכול. שלב קיצוץ זה הוא קריטי, כיוון שההרחבה באמצעות הזרקה לבדה אינה מאפשרת פיזור תקין של האנזים בתוך הרקמה. במקביל, הרכבנו את מעגל העיכול.כפי שמוצג באיור זה, כיוון הזרימה בתא המוקלט הוא פנימה בתחתית התא והחוצה בחלקו העליון. לאחר מכן, נוסיף את שאר המצע המכיל אנזימים לבקראך של 500 מיליליטר עד לנפח של 300 מיליליטר, ולאחר מכן נכניס את מדחום. התא המוקלט מכיל רשת מתכת בעלת קוטר חור של 600 מיקרומטר וכדורי סיליקון ניטריד חופשיים שקוטר כל אחד מהם הוא 15 מילימטר.מעבירים את רקמת הלבלב לתא, מכניסים את הרשת, סוגרים את התא ומפעילים את המשאבה במהירות של 140 milliliter per minute. ברגע שטמפרטורת המעגל מגיעה ל-37 °C, מתחילים למדוד את זמן העיכול. את התא שבו נרשמו הנתונים מנענעים ידנית בהתאם להרכב הרקמה.כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלית להפסקת העיכול, אנו לוקחים דגימות תקופתיות, צובעים אותן, ובודקים תחת המיקרוסקופ אם העין-עיליות (eyelets) הופרדו. ברגע שהעינ-עיליות נראות מופרדות מרקמת ה-aino, אנו עוצרים במהירות את העיכול על ידי הנחת סליל החימום על קרח והוספת 200 milliliter של תמיסת שטיפה קרה למעגל. לאחר מכן, אנו אוספים את תמיסת העפעף על ידי הכנסת מבחנת הדגימה לתוך מבחנות פלקון של 250 milliliter עד שהמעגל מתרוקן.תהליך השטיפה הבא מתחיל בשלב צנטריפוגה של 1000 RPM בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בשלב הבא, נשליך את העילוי, נסנטר את התמיסה במערך שטיפה ונחלק אותה למנות שוות למבחנות פאלקון של 50 מיליליטר. השטיפה ממשיכה בשלב צנטריפוגה נוסף של 1000 RPM בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.כשלב אופציונלי, אנו מחלקים את הפלטה לפלקונים נוספים מעבר לארבעה המקוריים, בהתאם לגודל הפלטה. כדי לשפר את השטיפה, אנו שוב שופכים את הנוזל העיל ומנעלים בעדינות את הפלטה להפרדת העפעף מרקמת העין. צמידויות הרקמה השונות של שני החלקים מאפשרות יישום של מדרג צואתי.ראשית, נשחזר את המשקע בתוך מדיום צואתי בצפיפות של 1.1 25 גרם למילליטר. על המשקע להיות קטן מספיק כדי לאפשר שחזור הומוגני. לאחר מכן, נוסיף בעדינות מעליו שכבות של מדיום צואתי בצפיפויות של 1.0 81.0 60 ו-1.0 37, בנפח של 10 מילליטר לכל אחד.לאחר מכן, נסחרר את המדרגות בצנטריפוגה במהירות של 2,400 RPM למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כעת ניתן להבחין ברכיבים השונים שהופרדו לפי צפיפותם בתוך הפראקציות. ראשית, נשליך את השכבה העליונה המורכבת משומן ומרקמה חיבורית.הfrakציה שאנו אוספים כעת היא השכבה הראשונה של צבירי העפעפונים ב-1.037 ו-1.06, המכילה בעיקר את העפעפונים המבודדים. לצורך בידוד יעיל, חשוב לאסוף את הfrakציות בנפרד. לאחר מכן, אנו אוספים את הfrakציה של צבירי העפעפונים השנייה בממשק שבין 1.0 60 ל-1.0 80, המכילה עפעפונים פחות טהורים מהשכבה הראשונה.בשלב הבא, נוסיף את תמיסת השטיפה עד לנפח כולל של 50 milliliter כדי לדלל את מעילי הצואה, ונניח לצנטריפוגה במהירות של 1000 RPM למשך חמש דקות. בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס, נסלק את השכבה העליונה באמצעות שאיבה, מאחר שהמשקע עשוי להיות רפוי מאוד עקב הקירור. לכן, עלינו לחזור על שלב השטיפה עם תווך תרבית ב-1000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס.בשלב האחרון, אנו מרחיבים מחדש את ה-eyelets האנושיים בתוך מדיום תרבית, ומדגירים אותם. ה-eyelets שנאספו מושמרים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 עד 48 שעות. לאחר שלב תרבית זה, ה-eyelets מוכנים להמשך העיבוד.פרוטוקול זה אמור לאפשר לכם לבודד אילאיס (islets) אנושיים מרקמה לבלבית לאחר כריתה חלקית של הלבלב. הובלה מהירה וקרה של רקמת הלבלב למתקן בידוד האילאיס היא חיונית כדי לשמר חיוניות תאים מיטבית. על צוות הבידוד לזכור שתהליך העיכול הוא פרוצדורה דינמית מאוד.משך תהליך העיכול תלוי במידה רבה בהרכב הרקמה. לדוגמה, דרגת הפיברוזיס והיכולת להחדיר כמות מספקת של אנזימים לרקמת הלבלב. התאמה אינדיבידואלית של הכוח המכני בתוך התא הרשום ושל משך תהליך העיכול היא קריטית להשגת תבואה טובה של עפעפיים.

isolation-of-human-islets-from-partially-pancreatectomized-patients

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון האדם הלבלב (אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב) בשיטה אוטומטית שונה.

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון הלבלב האנושי (חלק II: טיהור והתרבות של איים אדם) באמצעות שיטה אוטומטית שונה.

הלבלב האנושי בידוד איילט: חלק ב: טיהור והתרבות של איי האדם

איי הלבלב, המכונים גם איי לנגרהנס, הם אשכול של תאים אנדוקריניים המייצר הורמונים לוויסות גלוקוז ופונקציות ביולוגיות חשובות אחרות. פרוטוקול זה מסביר שיטה לבידוד איי הלבלב על ידי החדרת קולגנאז תחילה דרך אמפולה של Vater כדי לעכל את רקמת הלבלב האקסוקרינית וצנטריפוגה הדרגתית צפיפות פשוטה כדי לטהר את האיים מעכברים.

בידוד איי הלבלב באמצעות זילוח Collagenase: שיטה אנזימטית לבידוד תאי איון הלבלב

microdissection הליזר הוא טכניקה המאפשרת התאוששות של תאים נבחרים מכמויות זעירות של parenchyma. כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת איי לבלב אנושיים מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic. הפרוטוקול שלנו משפר את autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל האוסף שלהם.

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

אנו מתארים פרוטוקול בזאת לבידוד איים שלמים מעכברים בילוד. Pancreata היו מעוכל חלקית עם collagenase, ואחריו כביסה בחירה ידנית. 20 - 80 אשכולות איון ניתן להשיג לכל לבלב מעכברים שזה עתה נולדו, אשר מתאימים מספר מחקרי איון.

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לייצר באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול של נתונים הטרנססקריפט של תאים בודדים מבודדים איונים הלבלב האנושי באמצעות droplet-מבוססי microfluidic בודד מיקרופלוג של תא RNA רצף הטכנולוגיה.

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

כאן, אנו מספקים פרטים על ביצוע הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז (GSIS) באמצעות זלוף דרך כלי הדם של העכברים עם לבלב שלם כטכניקה נוספת להערכת תפקוד הלבלב האנדוקריני עם הפחתת מבלבלים אפשריים.

הפרשת אינסולין מגורה על ידי גלוקוז באמצעות זלוף דרך כלי הדם של העכברים עם לבלב שלם

מחקר זה פיתח שיטה פשוטה לחילוץ יעיל של איים ראשוניים תפקודיים ותאי אקינר מהלבלב בעכבר, ומציע כלי חשוב לחקר תקשורת בין-תאית בפתוגנזה של סוכרת מונעת מדלקת לבלב חריפה.

שיטה פשוטה ומהירה לבידוד סימולטני של איים ראשוניים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב מעכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית לקציר כירורגי, עיכול אנזימטי וטיהור גרדיאנט צפיפות של איי הלבלב של עכברוש לואיס, המאפשר הכנות בעלות תפוקה גבוהה וטוהר לשימוש ישיר בהשתלות או במחקרים במבחנה .

בידוד וטיהור איי הלבלב מחולדות לואיס באמצעות עיכול אנזימטי והפרדה בין צפיפות לגרדיאנט

למדו שיטה לבידוד איי לנקראת מרקמת הלבלב בחולים שעברו כריתת לבלב חלקית. הפרוטוקול משתמש בעיכול אנזימטי וסנטיפוגה צפיפות להפרדת האייים לצורך מחקר סוכרת.

הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

גלה סרטונים נוספים