Name: מבוא טכניקת ממוקד אולטראסאונד הרס microbubble (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: למד את טכניקת UTMD להעברת גנים טיפוליים לאיברים כמו הלב והכבד באמצעות קוויטציה אקוסטית. שיטה זו משפרת את יעילות הטרנספקציה של DNA פלסמידי בחולייתנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה גרנט כוללת NHLBI HL080532, NHLBI HL073449, NCRR RR16453, ו לאומי AHA גרנט, פרס סיוע (עד RVs). תודה מיוחדת מורחב עיצוב מרחק הקורס (DCDC) Consulting Group, dcdcgroup.org, על עזרתם עם ייצור וידאו של משרד החינוך האמריקני גרנט מספר כי הקים את P336C050047 DCDC.

1. Microbubble הכנה מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת 10 MLS של PBS לערבב 200 מ"ג 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphatidylcholine ו 50 מ"ג 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphatidylethanolamine עם 1 גרם גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את התערובת על אמבט מים רותחים 20-30 דקות, פיפטה ערבוב כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. </li></ol> 2. Microbubble הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 250 μl של פתרון מניות הכינו את microbubble ו לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון מראש חימם microbubble הוא הועבר לאחר מכן microtube 1.5 מ"ל המכיל 50 μl של גליצרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-2 מ"ג מטוהרים DNA פלסמיד קידוד ביטוי לבנות עבור הגן של עניין (מטוהרים בדוגמה זו על ידי רעלן פנימי Qiagen חינם MegaPrep הערכה, Qiagen, ג'רמנטאון, MD, עם ריכוז אופטימלי של 4mg/ml). 2.4) פוספט שנאגרו מלוחים מתווסף נפח סופי של μl 500. רעלן פנימי חינם maxipreps Qiagen משמשים, כמו גם PBS סטרילי כדי להבטיח סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר ב microtube הוא החליף אז עם גז Octafluoropropane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microtube הוא מזועזע ואז במרץ amalgamator שיניים למשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדנ"א subnatant שיורית המכיל חיץ שלא מאוגדים microbubbles לאחר מכן הסיר בזהירות את השכבה microbubble נשטף שלוש פעמים עם PBS סטרילי כדי להסיר את ה-DNA פנויות, והניח על הקרח בין כל מחזור כביסה. אנחנו בדרך כלל להשיג יעילות המחייב של 30-40%. ריאגנטים כל סטרילית וטיפול עשוי למזער את הזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד דנ"א מחויב microbubbles ממוקמות אז על הקרח עד שעתיים עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subnatant להסיר microtube לאחר ערבוב PBS שוטף, ניתן להשתמש כדי לקבוע את הריכוז של ה-DNA מאוגד, וכן את כמות מחויב מבוסס על ריכוז ההתחלתי ידוע, על ידי מדידת צפיפות אופטית של פתרון זה באורך גל של 260nm באמצעות ספקטרופוטומטר. </li></ol> 3. ציוד כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש הראשון, 1 cavitation מתמר MHz צריך להיות מכויל על מנת להבטיח מדד מכני תקין החזרה הדופק. Submergible 1, MHz מתמר 13mm, ממוקד מחובר פונקציה של 20 MHz / Waveform Generator שרירותי באמצעות מגבר כוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתמר ממוקם במיכל פלסטיק מלא מים, שכוונה ישירות אל hydrophone, אשר חובר אוסצילוסקופ 500 MHz דרך מגבר תשלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צורת גל, תדירות, משרעת, מחזור פרץ, והגברה כוח כל יכול להיות שונה כדי להשיג את מחזור תקין מדד מכני אופטימלי למער microbubbles. לצורך ניסוי זה בפרט, יש לנו לכייל את המערכת מדד מכני שווה ~ 1.3 מגה ב 1. </li></ol> 4. משלוח microbubble &amp; UTMD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הלידה microbubble ו UTMD, עכברים C57BL / 6 היו מורדמים עם 100mg/kg xylazine קטמין ו 5mg/kg באמצעות הזרקת ה-IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משלוח microbubble היה בהזרקה לווריד לתוך החדר השמאלי של הלב או באמצעות צנתור וריד הזנב באמצעות הזרקה ישירה. עבור זריקה הלב ישירה, בנפח של עד 100 μl של פתרון ה-DNA טעון פלסמיד microbubble מוזרק דרך מחט 30 מד מוכנס אל המקום ה 4 הקדמי צלעי תחת הדמיית אולטרא לתוך החדר השמאלי של הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בולוס פתרון microbubble הנובע הזריקה interventricular שמאל דמיינו באמצעות Visual Sonics '38 MHz בתדר גבוה מתמר אולטראסאונד להציב בעמדה נייח על החזה של העכבר בתצוגת ציר זמן באמצעות VisualSonics "Vevo 2100 מערכת הדמיה. כל מזרקים ומחטים הם עקרים, מבטחת את הסביבה הסטרילית ביותר האפשרי עבור זריקות אלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר ההזרקה, הרס microbubble מתבצעת עבור ~ 5 דקות באמצעות שנייה, קטנה יותר בתדירות נמוכה בגודל 1.0 מתמר MHz שנערך ישירות על האיבר הרצוי, מיקוד חורבן לאזור זה. בדוגמה זו, אולטרסאונד היה מנוהל לכבד בתדירות הדופק החזרה של 1.0 מגה הרץ, עם המקבילה מדד מכני כ 1.3-1.5, וחזרה הדופק תקופה של 100 ms לכל 20 מחזורים. לחלופין, הדופק יכול להיות מגודרת על א.ק.ג. של העכבר (לא מוצג בניסוי הזה) כדי בפרץ של 3 מסגרות של אולטרסאונד, כל 4-6 מחזורים לב. אנו להשיג יעילות רבה יותר של transfection עם פרוטוקולים המאפשרים את המיטה נימי למלא עם בועות בין פרצי אולטרסאונד. </li></ol> 5. משלוח שיטה אלטרנטיבית בחרנו להדגיש את הזריקה interventricular בשל המורכבות של ההליך, אך במקרים רבים, כגון עירוי ממושך של microbubbles, וריד הזנבjection היא השיטה המועדפת. עבור שיטה זנב הווריד המסירה microbubble, העכבר הוא הרדים באותה דרך. מזרק המכיל את פלסמיד דנ"א מחויב microbubbles מחובר קטטר 27 מחט / זנב מד וריד. קטטר וריד הזנב מוכנס לתוך השלישי דיסטלי של הוורידים או לרוחב ימינה או שמאלה, כי לאורך הזנב של העכבר. מזרק המכיל את microbubbles ממוקמת משאבת אינפוזיה באופן אוטומטי מנהלת נפח מראש אחיד של הפתרון על פני תקופה מוגדרת מראש של זמן. אנחנו בדרך כלל להשרות 200-300μl בשיעור של 3ml/hour. השימוש בבעלי חיים כל החיות טופלו בהתאם לנוהגים חיה טוב כפי שהוגדר על ידי הלאומית רלוונטי ו / או הרווחה המקומיות וגופים בעלי חיים, וכל העבודה חיה אושרה על ידי הוועדה המתאימה (אוניברסיטת הוואי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש, מספר אישור 07-100 -3). הרדמה המתאים (קטמין / zylazine) שימש כאבים (Bupivicaine ואת עצירות) היו זמינים, אך לא חובה. 6. נציג תוצאות: היעילות של משלוח UTMD בתיווך ה-DNA פלסמיד ניתן להעריך באמצעות מגוון רחב של שיטות בהתאם את הגנים המקודדים לבנות, כגון, אך לא מוגבל; בלוציפראז in vivo הדמיה, B-gal מכתים לשעבר vivo, ו / או immunohistology. בפרט, בתחום ההדמיה פליטת אור vivo מאפשר לפקח על נוכחות ומשך ביטוי גנים סדרתי בעכברים transfected בקידוד פלסמיד גן הכתב bioluminescent (בלוציפראז). Xenogen in vivo Imaging System (IVIS) (Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA) משמש הדמיה bioluminescent. תמונות נלקחים בדרך כלל של כל העכברים היום הראשון לאחר transfection בתיווך UTMD והוא חזר כל שלושה עד ארבעה ימים עד ביטוי גנים bioluminescent כבר לא להבחין ויזואלית באמצעות המערכת (איור 1). כדי להכין עכברים הדמיה bioluminescent, עכברים first לקבל זריקה IP של הכתב בלוציפראז בדיקה D-luciferin (Caliper מדעי החיים) והם אז הרדים ~ 3 דקות מאוחר יותר. Biodistribution המצע D-luciferin מותר להמשיך עבור ~ 10 דקות לפני החיה ממוקם הדמיה IVIS קאמרית סריקה מלאה דימוי גוף הוא נלקח. במהלך הרכישה, הפוטונים הנפלטים מן בלוציפראז גחלילית / D-luciferin תגובה פוטו נמדדים. איור 1 מדגים גם דומה הדמיה IVIS bioluminescent של הכבד הבאים UTMD, ואיור 2 הוא דימוי epifluorescence (100x) של הכבד transfected באמצעות נוגדן אנטי בלוציפראז הראשי (סיגמא אולדריץ) ו AlexFluor-568 נוגדנים משני מצומדות (Invitrogen) . ברור לראות כי transfection UTMD הכבד בתיווך השפיע לא רק בתאי האנדותל, אבל hepatocyes גם כן. <img src="/files/ftp_upload/2963/2963fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 Xenogen / IVIS הדמיה של הלב UTMD העכברים שטופלו (א) עכבר בקרה שליליות:.. פלסמיד + PBS ואחריו הלב מופנה UTMD, (ב) עכבר טיפול: פלסמיד + microbubbles ואחריו הלב מופנה UTMD, ו (ג) עכבר טיפול : microbubbles + פלסמיד ואחריו הכבד ביים UTMD. <img src="/files/ftp_upload/2963/2963fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. אימונוהיסטוכימיה של הכבד UTMD (אנטי בלוציפראז באדום). (א) פלסמיד עם UTMD לא, (ב) פלסמיד עם UTMD. תמונה Confocal (100x); גרעינים כחולות DAPI מוכתם.

<ol><li>Bekeredjian, R., Chen, S., Frenkel, P. A., Grayburn, P. A., Shohet, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-targeted+microbubble+destruction+can+repeatedly+direct+highly+specific+plasmid+expression+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart.</a> Circulation. 108, 1022-1026 (2003).</li>
<li>Bekeredjian, R., Katus, H. A., Kuecherer, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+ultrasound+targeted+microbubble+destruction%3A+a+review+of+non-cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ultraschall+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction: a review of non-cardiac applications.</a> Ultraschall Med. 27, 134-140 (2006).</li>
<li>Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+pancreatic+islets+in+vivo+by+ultrasound-targeted+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Regeneration of pancreatic islets in vivo by ultrasound-targeted gene therapy.</a> Gene Ther. 17, 1411-1420 (2010).</li>
<li>Miao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+enhances+gene+delivery+of+human+factor+IX+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid.</a> Hum Gene Ther. 16, 893-905 (2005).</li>
<li>Shimoda, M., Chen, S., Noguchi, H., Matsumoto, S., Grayburn, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+non-viral+gene+delivery+of+human+vascular+endothelial+growth+factor+improves+revascularisation+and+restoration+of+euglycaemia+after+human+islet+transplantation+into+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vivo non-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor improves revascularisation and restoration of euglycaemia after human islet transplantation into mouse liver.</a> Diabetologia. 53, 1669-1679 (2010).</li>
<li>Shohet, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echocardiographic+destruction+of+albumin+microbubbles+directs+gene+delivery+to+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Echocardiographic destruction of albumin microbubbles directs gene delivery to the myocardium.</a> Circulation. 101, 2554-2556 (2000).</li>
<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+Compositions%2C+Properties+and+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bubble+Sci+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications.</a> Bubble Sci Eng Technol. 1, 3-17 (2009).</li>
<li>Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-targeted+microbubble+destruction+enhances+AAV-mediated+gene+transfection+in+human+RPE+cells+in+vitro+and+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances AAV-mediated gene transfection in human RPE cells in vitro and rat retina in vivo.</a> Gene Ther. 16, 1146-1153 (2009).</li>
<li>Lindner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubbles+in+medical+imaging%3A+current+applications+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).</li>
<li>Newman, C. M., Bettinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+ultrasound+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer.</a> Gene Ther. 14, 465-475 (2007).</li>
<li>Vancraeynest, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+injury+induced+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction%3A+evidence+for+the+contribution+of+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Myocardial injury induced by ultrasound-targeted microbubble destruction: evidence for the contribution of myocardial ischemia.</a> Ultrasound Med Biol. 35, 672-679 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

UTMD מייצג גישה חדשנית המסירה הגן. ככל שהטכנולוגיה פלטפורמה זה יכול להיות משולב עם כל אחד אסטרטגיות רבות בטיפול פוטנציאל גנטי, כדי לספק מספר עצום של מולקולות ביו כאשר רמה גבוהה של ייחוד הרקמה הרצויה. המגבלה העיקרית הביולוגי של הטכניקה היא יעילות נמוכה של transfection. שיקול חשוב נוסף הוא הנגישות של איבר היעד אולטרסאונד, אשר ניתן פחתה במידה ניכרת על ידי התערבות עצם או אוויר. הטכניקה דורשת אופטימיזציה של טכניקה המבוססת על רקמות מטרה 11 כמו גם הבנה בסיסית של אקוסטיקה, כדי ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphatidylcholine </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P-5911 </td><td> מרכיב של הקליפה השומנים microbubble </td></tr><tr><td> 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphatidylethanolamine </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P-3275 </td><td> מרכיב של הקליפה השומנים microbubble </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G5400 </td><td> חשבתי לייצב את microbubbles </td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P5368 </td><td></td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G5516 </td><td> האמינו למנוע microbubbles מ התגבשו </td></tr><tr><td> Octafluoropropane גז </td><td> Airgas </td><td> N / A </td><td> גז אינרטי המשמש יישומים קליניים </td></tr><tr><td> VialMix שיניים amalgamator </td><td> Bristol-Myers Squibb </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 1 MHz, 13 מ&quot;מ, ממוקד מתמר </td><td> אולימפוס </td><td> A303S-SU </td><td></td></tr><tr><td> 20 MHz Function / Waveform Generator שרירותי </td><td> Agilent </td><td> 33220A </td><td></td></tr><tr><td> כוח מגבר </td><td> קרון-הייט ושות </td><td> דגם 7500 </td><td></td></tr><tr><td> Hydrophone </td><td> Bruel ו Kjaer </td><td> סוג 1803 </td><td></td></tr><tr><td> טעינת מגבר </td><td> Bruel ו Kjaer </td><td> סוג 2634 </td><td></td></tr><tr><td> 500 MHz אוסצילוסקופ </td><td> LeCroy </td><td> 9354L </td><td></td></tr><tr><td> VisualSonics &quot;Vevo 2100 Imaging System עם מתמר 34 MHz </td><td> VisualSonics </td><td> 2100 </td><td></td></tr><tr><td> 27G אינץ&#39; אחד וריד הזנב צנתרים </td><td> VisualSonics </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Genie פלוס משאבת עירוי </td><td> קנט מדעי </td><td> GENIE </td><td></td></tr></tbody></table>

מבוא טכניקת ממוקד אולטראסאונד הרס microbubble

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

ב, מולקולות ביו UTMD, כגון מטען שלילי וקטורים DNA פלסמיד קידוד גן של עניין, מוסיפים את הקליפות קטיוני של השומנים סוכנים בניגוד microbubble 7-9. וקטור בעכברים נושאי אלה microbubbles ניתן בהזרקה לווריד או ישירות אל החדר השמאלי של הלב. אצל בעלי חיים גדולים יותר הם יכולים גם להיות חדורים דרך קטטר intracoronary. משלוח הבאים מהמחזור כדי איבר מטרה מתרחשת על ידי cavitation אקוסטי בתדר התהודה של microbubbles. סביר להניח כי אנרגיה מכנית שנוצר על ידי תוצאות ההרס microbubble במבנה הנקבוביות חולף או בין לתאי אנדותל של microvasculature האזור ממוקד 10. כתוצאה של השפעה זו sonoporation, יעילות transfection לתוך מעבר לתאי אנדותל היא משופרת transgene קידוד וקטורים מופקדים אל הרקמות המקיפות אותם. פלסמיד דנ&quot;א שנותרו במחזור במהירות מושפל על ידי nucleases בדם, אשר מקטין עוד יותר את הסבירות של משלוח אי - sonicated רקמות מוביל transfection היעד איברים ספציפיים מאוד.

הרס ממוקד אולטראסאונד microbubble (UTMD) יכול לשמש ישירה באתר ספציפי משלוח של מולקולות ביו, כולל גנים טיפוליים, כדי למקד את האיברים נגישים אולטרסאונד, כגון הלב והכבד<sup&gt; 1-6</sup&gt;.

בשיטת UTMD, מולקולות ביו-אקטיביות, כגון וקטורי DNA פלסמיד טעונים בנטנה שלילית המקודדים לגן רצוי, מתווספות למעטפות הקטיוניות של ליפידים...

UTMD הוא קיצור של ultrasound targeted microbubble destruction (הרס מיקרובועות ממוקד באולטרסאונד). ניתן להשתמש ב-UTMD כדי להכווין הובלה ספציפית לאתר של מולקולות ביו-אקטיביות, כולל גנים טיפוליים, לאיברים מטרה הנגישים לאולטרסאונד, כגון הלב והכבד. ב-UTMD, מולקולות ביו-אקטיביות, כגון וקטורי DNA של פלסמיד בעלי מטען שלילי המקודדים לגן רצוי, מתווספות למעטפות הקטיוניות של חומרי ניגוד המבוססים על מיקרובועות ליפידיות; ניתן להחדיר את המיקרובועות הקשורות לוקטור באופן תוורידי או ישירות לחדר השמאלי של הלב.בבעלי חיים גדולים יותר, ניתן להחדיר אותם גם באמצעות קטטר כלילי עם או ללא תקופת שהייה. ההחדרה העוקבת ממערכת הדם לאיבר המטרה מתרחשת בצורה מיטבית באמצעות קוויטציה אקוסטית בתדר תהודה של המיקרובועות. נראה כי האנרגיה המכנית הנוצרת מהרס המיקרובועות מובילה להיווצרות נקבים זמניים בתוך או בין התאים האנדותליאליים של המיקרו-וסקולטורה באזור המטרה.כתוצאה מאפקט סאונה פריון (sauna parion) זה, יעילות הטרנספקציה אל תוך ומבעד לתאי האנדותל עולה, וניתן להפקיד וקטורים המקודדים לגן זר אל תוך הרקמה הסובבת שמעניינת את החוקר. DNA פלסמי שנותר במחזור הדם מתפרק במהירות על ידי נוקלאזות בתוך תמיסת מיקרו-בועות הדם. אליקווט של תמיסת מלאי מוכנה של מיקרו-בועות המכילה glucose phosphate buffered saline, diol glycerol three phosphatidylcholine ו-diol glycerol three.ראשית מדגרינים פוספטידיל אתנולאמין ב-40 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן מעבירים את תמיסת המיקרו-בועות המחוממת למיקרו-טובוס של 1.5 ml המכיל גליצרול ובין 1 ל-2 mg של DNA מטוהר מפלזמה המקודד לקונסטרוקט ביטוי עבור הגן המבוקש. מוסיפים Phosphate buffered saline עד לנפח סופי של 500 µL.לאחר מכן, האוויר במיקרו-מבחנה מוחלף בגז Octa fluoro propane. מיนั้น, מנערים את המיקרו-מבחנה בעוצמה בתוך dental amalgamator למשך 20 שניות. כיול הציוד לפני השימוש הראשון: יש לכייל את מתמר הקוויטציה UTMD בעל התדר של 1 megahertz כדי להבטיח אינדקס מכני וחזרתיות פולסים תקינים.מתמר תת-מימי בתדר של 1 MHz מחובר למחולל גלי נסוע באמצעות מגבר הספק. המתמר ממוקם במיכל פלסטיק מלא במים ומכוון ישירות לעבר הידרופון, המחובר לאוסצילוסקופ באמצעות מגבר מטען. ניתן לשנות את תדר גל הנוסוע, את האמפליטודה, את מחזור הפולס (burst cycle) ואת הגברת ההספק כדי להשיג את מחזור העבודה (duty cycle) והאינדקס המכני המתאימים לאופטימיזציה של קוויטציה של המיקרובועות. בהגדרות אלו, כיולנו את המערכת לאינדקס מכני השווה לכ-1.3 בהגשה של מיקרובועות בתדר 1 MHz ו-UTMD לפני הגשת המיקרובועות ו-U-T-M-D-C 57 BL. שש עכברים הורדמו באמצעות הזרקה תוך-בטנית (IP) של 100 mg/kg קטמין ו-5 mg/kg קסילזין.מתן מיקרובועות מבוצע באופן תוורידי באמצעות הזרקה ישירה לחדר השמאלי של הלב או באמצעות קטטריזציה של וריד הזנב, כאשר ההזרקה הלבבית הישירה תוצג בהמשך. נפח של עד 100 microliters של תמיסת מיקרובועות הטעונה ב-plasma DNA מוזרק באמצעות מחט בכילון 30 המוחדרת במרווח הבין-צלעי הרביעי הקדמי תחת הדמיה אולטרסונית אל תוך החדר השמאלי של הלב. בולוס תמיסת המיקרובועות הנובע מההזרקה הבין-חדרית השמאלית מוצג באמצעות מתמר אולטרסאונד בתדר גבוה של visual sonic, המוצב בעמדה נייחת על חזה העכבר במבט ציר ארוך.מיד לאחר ההזרקה, מבוצע הרס של מיקרו-בועות למשך כחמש דקות, באמצעות מתמר שני בעל תדר נמוך וגודל קטן יותר, של 1.0 megahertz, המוחזק ישירות מעל האיבר הרצוי כדי למקד את ההרס באזור זה. האולטרסאונד מופעל על הכבד בתדר חזרת פולסים של 1.0 megahertz עם אינדקס מכני השווה לכ-1.3 עד 1.5, ומחזור חזרת פולסים של 100 milliseconds עבור כל 20 מחזורים, או שניתן לסנכרן את הפולס ל-ECG של העכבר כך שייווצר פרץ של שלושה פריימים של אולטרסאונד בכל ארבעה עד שישה מחזורי לב. עבור שיטת הזרקת המיקרו-בועות לווריד הזנב, העכבר מורדם באותו אופן שבו מורדם עבור הזרקת הפלסמיד במזרק.מיקרו-בועות קשורות ל-DNA מחוברות לקטטר של וריד הזנב עם מחט בכילייבג (gauge) 27. קטטר וריד הזנב מוחדר לשליש המרוחק של הוורידים הצדיים הימניים או השמאליים העוברים לאורך זנבו של העכבר. המזרק המכיל את המיקרו-בועות מונח במשאבת עירוי שתיתן באופן אוטומטי נפח קבוע מראש של תמיסה לאורך פרק זמן שנקבע מראש.בניתוח ביולומינצנציה של UTMD, ניתן להעריך את יעילות הולכת ה-DNA של הפלסמה באמצעות UTMD במגוון שיטות, בהתאם לגנים המקודדים בקונסטרוקט. בפרט, דימוי ביולומינצנציה in vivo הוא שיטה אחת המאפשרת לנטר את נוכחותו ומשכו של הביטוי הגני. בעכברים שעברו טרנספקציה עם הפלסמיד המקודד לגן דשיין (reporter gene) של ביולומינצנציה, כגון לוציפראז.מערכת הדימוי in vivo מסוג Enogen משמשת לבליומניסנציה. תמומי דימוי נלקחות בדרך כלל מכל העכברים ביום הראשון לאחר טרנספקציה בתיווך UTMD, והתהליך חוזר על עצמו מדי שלושה עד ארבעה ימים עד שביטוי הגן לבליומניסנציה אינו ניתן לזיהוי חזותי יותר באמצעות המערכת. כדי להכין את העכברים לדימוי בליומניסנציה, העכברים מקבלים תחילה הזרקה IP של גשש הדיווח לוציפראז Lucifer.לאחר מכן העכברים הורדמו. כமூשלש דקות לאחר מכן, מאפשרים להתפשטות הביולוגית של מצע ה-Lucifer להתרחש למשך כ-10 דקות לפני שהחיה או החיות ממוקמות בתא ההדמיה של Xeno Gen ונערכת סריקת הדמיה של הגוף כולו. במהלך הרכישה, המערכת קובעת את הפוטונים שנפלטו מהתגובה הפוטוכימית של Luciferase de Lucifer לאחר רכישת כל תמונה.באמצעות מערכת הדימוי Xeno in vivo, נעשה שימוש בתוכנת המערכת כדי למדוד ולכמת את אזור העניין הלומנסנטי הנראה.

introduction-to-ultrasound-targeted-microbubble-destruction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Insonation של microbubbles היא אסטרטגיה מבטיח אבלציה הגידול במועד, בממוצע סמכויות מופחת אקוסטי, כמו גם עבור משלוח ממוקד של הרפוי. מטרת המחקר הנוכחי היא לפתח נמוך מחזור אולטרסאונד אסטרטגיות פועם nanocarriers על מנת למקסם את אי - אבלציה תרמית כלי הדם ואספקת מטען אל תת עורית C6 gliomas.

אולטראסאונד ניגודיות ממוקד טיפול gliomas של עכברים באמצעות אספקת סמים נושאות Nanoparticle ו אבלציה כלי הדם

Microbubble בתיווך הפרעה אולטרסאונד ממוקד של מחסום דם מוח (BBB) ​​היא טכניקה מבטיחה למסירה פולשני התרופה ממוקדת...

MRI-מודרך שיבוש של מחסום דם מוח באמצעות אולטרסאונד ממוקד Transcranial מודל עכברים

סרטון זה מתאר שיטה לשיבוש זמני של מחסום הדם-מוח (BBB) על ידי יצירת פתחים חולפים באמצעות אולטרסאונד ממוקד בתיווך מיקרו-בועות (FUS). פתחי BBB מקומיים ארעיים אלה יכולים בסופו של דבר לשמש להעברת מולקולות תרופה גדולות יותר ישירות לתוך פרנכימה במוח.

מיקוד מבוסס אולטרסאונד מיקרו-בועות בתיווך מחסום דם-מוח: טכניקה ליצירת פתחים ארעיים מקומיים במחסום דם-מוח של עכבר על ידי סונופורציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להזריק סוכני אולטרסאונד ניגוד microbubble לחיים, עוברים עכברי שלב מאוחר-הריון מבודד. שיטה זו מאפשרת הלימוד של פרמטרים זלוף ושל סמנים מולקולריים של כלי דם בתוך העובר באמצעות הדמיה אולטרסאונד בתדר גבוה חומר ניגוד.

הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד

ניתן להשתמש בפרוטוקול הניסיוני המוצג לביצוע מדידות בזמן אמת של פעילות cavitation במכשיר תרבות תאים במטרה לאפשר חקירה של התנאים הנדרשים לאספקת תרופות מוצלחת ו/או ביו-אפקטים אחרים.

לימוד טיפול משופר Cavitation

טכניקה מהירה ואמינה מוצעת לשליטה בתנודות הצורה של בועה אקוסטית אחת לכודה המבוססת על טכניקת התלכדות בין שתי בועות. תנודות צורת הבועה במצב יציב ומבוקרות סימטריה מאפשרות ניתוח של זרימת הנוזל הנוצרת בקרבת ממשק הבועות.

השראת מיקרו-סטרימינג על ידי תנודות בועות לא כדוריות במערכת ריחוף אקוסטית

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים הניתוחיים והטכניים המאפשרים הדמיית פלואורסצנטיות מולטי-פוטונית בזמן אמת של מוח המכרסמים במהלך טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חמיצוץ מחסום הדם - מוח.

מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית בזמן אמת להדמיית טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חדחול מחסום הדם-מוח

הפרוטוקולים המוצגים יכולים לשמש כדי לאפיין את התגובה של microbubbles תווית פלואורסצנטית המיועדים ליישומי משלוח תרופות המופעלות על ידי אולטרסאונד, כולל מנגנוני ההפעלה שלהם, כמו גם bioeffects שלהם. נייר זה מכסה מגוון של טכניקות מיקרוסקופיה במבחנה ו - in vivo המבוצעות כדי ללכוד את האורך ואת לוחות הזמנים הרלוונטיים.

שיטות מיקרוסקופיה מרובות זמן לאפיון של Microbubbles פלואורסצנטרית שכותרתו לשחרור תרופות מופעלות אולטרסאונד

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של מיקרו-בועות שומן ושיטת תיוג רדיו מיקרו-בועות תואמת בסיר אחד עם יעילות תיוג של &gt;95% ללא טיהור המשמרת תכונות פיזיקוכימיות של מיקרו-בועות. שיטה זו יעילה על פני ניסוחים מגוונים של מיקרו-בועות שומנים וניתן להתאים אותה ליצירת מיקרו-בועות רדיואקטיביות ו/או פלואורסצנטיות.

ייצור ותיוג מיקרו-בועות עם עוקבים פלואורסצנטיים ורדיואקטיביים

Bioreactor לחץ מחזורית מסוגל להעמיד שסתום רקמת לב לתנאי הלחץ פיזיולוגיים ופתולוגיים תוכנן. תוכנית LabVIEW מאפשר למשתמשים לשלוט על גודל הלחץ, משרעת ותדירות. מכשיר זה יכול לשמש כדי לחקור את mechanobiology של רקמת לב שסתום או תאים בודדים.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

למד את טכניקת UTMD להעברת גנים טיפוליים לאיברים כמו הלב והכבד באמצעות קוויטציה אקוסטית. שיטה זו משפרת את יעילות הטרנספקציה של DNA פלסמידי בחולייתנים.

מבוא טכניקת ממוקד אולטראסאונד הרס microbubble

גלה סרטונים נוספים