מבוא טכניקת ממוקד אולטראסאונד הרס microbubble

UTMD הוא קיצור של ultrasound targeted microbubble destruction (הרס מיקרובועות ממוקד באולטרסאונד). ניתן להשתמש ב-UTMD כדי להכווין הובלה ספציפית לאתר של מולקולות ביו-אקטיביות, כולל גנים טיפוליים, לאיברים מטרה הנגישים לאולטרסאונד, כגון הלב והכבד. ב-UTMD, מולקולות ביו-אקטיביות, כגון וקטורי DNA של פלסמיד בעלי מטען שלילי המקודדים לגן רצוי, מתווספות למעטפות הקטיוניות של חומרי ניגוד המבוססים על מיקרובועות ליפידיות; ניתן להחדיר את המיקרובועות הקשורות לוקטור באופן תוורידי או ישירות לחדר השמאלי של הלב.

בבעלי חיים גדולים יותר, ניתן להחדיר אותם גם באמצעות קטטר כלילי עם או ללא תקופת שהייה. ההחדרה העוקבת ממערכת הדם לאיבר המטרה מתרחשת בצורה מיטבית באמצעות קוויטציה אקוסטית בתדר תהודה של המיקרובועות. נראה כי האנרגיה המכנית הנוצרת מהרס המיקרובועות מובילה להיווצרות נקבים זמניים בתוך או בין התאים האנדותליאליים של המיקרו-וסקולטורה באזור המטרה.

כתוצאה מאפקט סאונה פריון (sauna parion) זה, יעילות הטרנספקציה אל תוך ומבעד לתאי האנדותל עולה, וניתן להפקיד וקטורים המקודדים לגן זר אל תוך הרקמה הסובבת שמעניינת את החוקר. DNA פלסמי שנותר במחזור הדם מתפרק במהירות על ידי נוקלאזות בתוך תמיסת מיקרו-בועות הדם. אליקווט של תמיסת מלאי מוכנה של מיקרו-בועות המכילה glucose phosphate buffered saline, diol glycerol three phosphatidylcholine ו-diol glycerol three.

ראשית מדגרינים פוספטידיל אתנולאמין ב-40 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן מעבירים את תמיסת המיקרו-בועות המחוממת למיקרו-טובוס של 1.5 ml המכיל גליצרול ובין 1 ל-2 mg של DNA מטוהר מפלזמה המקודד לקונסטרוקט ביטוי עבור הגן המבוקש. מוסיפים Phosphate buffered saline עד לנפח סופי של 500 µL.

לאחר מכן, האוויר במיקרו-מבחנה מוחלף בגז Octa fluoro propane. מיนั้น, מנערים את המיקרו-מבחנה בעוצמה בתוך dental amalgamator למשך 20 שניות. כיול הציוד לפני השימוש הראשון: יש לכייל את מתמר הקוויטציה UTMD בעל התדר של 1 megahertz כדי להבטיח אינדקס מכני וחזרתיות פולסים תקינים.

מתמר תת-מימי בתדר של 1 MHz מחובר למחולל גלי נסוע באמצעות מגבר הספק. המתמר ממוקם במיכל פלסטיק מלא במים ומכוון ישירות לעבר הידרופון, המחובר לאוסצילוסקופ באמצעות מגבר מטען. ניתן לשנות את תדר גל הנוסוע, את האמפליטודה, את מחזור הפולס (burst cycle) ואת הגברת ההספק כדי להשיג את מחזור העבודה (duty cycle) והאינדקס המכני המתאימים לאופטימיזציה של קוויטציה של המיקרובועות. בהגדרות אלו, כיולנו את המערכת לאינדקס מכני השווה לכ-1.3 בהגשה של מיקרובועות בתדר 1 MHz ו-UTMD לפני הגשת המיקרובועות ו-U-T-M-D-C 57 BL. שש עכברים הורדמו באמצעות הזרקה תוך-בטנית (IP) של 100 mg/kg קטמין ו-5 mg/kg קסילזין.

מתן מיקרובועות מבוצע באופן תוורידי באמצעות הזרקה ישירה לחדר השמאלי של הלב או באמצעות קטטריזציה של וריד הזנב, כאשר ההזרקה הלבבית הישירה תוצג בהמשך. נפח של עד 100 microliters של תמיסת מיקרובועות הטעונה ב-plasma DNA מוזרק באמצעות מחט בכילון 30 המוחדרת במרווח הבין-צלעי הרביעי הקדמי תחת הדמיה אולטרסונית אל תוך החדר השמאלי של הלב. בולוס תמיסת המיקרובועות הנובע מההזרקה הבין-חדרית השמאלית מוצג באמצעות מתמר אולטרסאונד בתדר גבוה של visual sonic, המוצב בעמדה נייחת על חזה העכבר במבט ציר ארוך.

מיד לאחר ההזרקה, מבוצע הרס של מיקרו-בועות למשך כחמש דקות, באמצעות מתמר שני בעל תדר נמוך וגודל קטן יותר, של 1.0 megahertz, המוחזק ישירות מעל האיבר הרצוי כדי למקד את ההרס באזור זה. האולטרסאונד מופעל על הכבד בתדר חזרת פולסים של 1.0 megahertz עם אינדקס מכני השווה לכ-1.3 עד 1.5, ומחזור חזרת פולסים של 100 milliseconds עבור כל 20 מחזורים, או שניתן לסנכרן את הפולס ל-ECG של העכבר כך שייווצר פרץ של שלושה פריימים של אולטרסאונד בכל ארבעה עד שישה מחזורי לב. עבור שיטת הזרקת המיקרו-בועות לווריד הזנב, העכבר מורדם באותו אופן שבו מורדם עבור הזרקת הפלסמיד במזרק.

מיקרו-בועות קשורות ל-DNA מחוברות לקטטר של וריד הזנב עם מחט בכילייבג (gauge) 27. קטטר וריד הזנב מוחדר לשליש המרוחק של הוורידים הצדיים הימניים או השמאליים העוברים לאורך זנבו של העכבר. המזרק המכיל את המיקרו-בועות מונח במשאבת עירוי שתיתן באופן אוטומטי נפח קבוע מראש של תמיסה לאורך פרק זמן שנקבע מראש.

בניתוח ביולומינצנציה של UTMD, ניתן להעריך את יעילות הולכת ה-DNA של הפלסמה באמצעות UTMD במגוון שיטות, בהתאם לגנים המקודדים בקונסטרוקט. בפרט, דימוי ביולומינצנציה in vivo הוא שיטה אחת המאפשרת לנטר את נוכחותו ומשכו של הביטוי הגני. בעכברים שעברו טרנספקציה עם הפלסמיד המקודד לגן דשיין (reporter gene) של ביולומינצנציה, כגון לוציפראז.

מערכת הדימוי in vivo מסוג Enogen משמשת לבליומניסנציה. תמומי דימוי נלקחות בדרך כלל מכל העכברים ביום הראשון לאחר טרנספקציה בתיווך UTMD, והתהליך חוזר על עצמו מדי שלושה עד ארבעה ימים עד שביטוי הגן לבליומניסנציה אינו ניתן לזיהוי חזותי יותר באמצעות המערכת. כדי להכין את העכברים לדימוי בליומניסנציה, העכברים מקבלים תחילה הזרקה IP של גשש הדיווח לוציפראז Lucifer.

לאחר מכן העכברים הורדמו. כமூשלש דקות לאחר מכן, מאפשרים להתפשטות הביולוגית של מצע ה-Lucifer להתרחש למשך כ-10 דקות לפני שהחיה או החיות ממוקמות בתא ההדמיה של Xeno Gen ונערכת סריקת הדמיה של הגוף כולו. במהלך הרכישה, המערכת קובעת את הפוטונים שנפלטו מהתגובה הפוטוכימית של Luciferase de Lucifer לאחר רכישת כל תמונה.

באמצעות מערכת הדימוי Xeno in vivo, נעשה שימוש בתוכנת המערכת כדי למדוד ולכמת את אזור העניין הלומנסנטי הנראה.