מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

שיטה זו מדגימה כיצד שילוב של אלקטרופורציה in vivo בדיסקרטיות זמנית ומרחבית עם קווי דגי נשוא (transgenic lines) של דגי זבב יכול לאפשר פגיעה סלקטיבית באזורים של העובר המתפתח לצורך ביטוי של גן זר (transgene). התחל עם דגי נשוא מסוג cal TA ארבע, שהופקו בשיטת enhancer trap כדי להגביל את ביטוי הגן לסוגי תאים ולמעגלים בעלי עניין. במקרה זה, הפחית הנחית (olfactory bulb) המתפתח בזמן ספציפי במהלך ההתפתחות; הזרק את פלסמיד הדו"ח GFP לקצה הקדמי של המוח הקדמי in vivo ובצע אלקטרופורציה כדי להקל על העברת ה-DNA. תוצאות שהתקבלו באמצעות דימוי פלואורסצנציה in vivo מעידות על לוקליזציה מדויקת של הגן הזר בזמן ובשלב ספציפיים של ההתפתחות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הזרקת פלסמיד בשלב התא הבודד, הוא שהביטוי מופנה לסוגי תאים ספציפיים בתוך אזור מסוים של המוח המתפתח. השתמשו בקו טרנסגני של דגי זברה שנוצר באמצעות שיטת enhancer trap מתווכת, כדי להניע ביטוי הן של גורם השעתוק calt A four והן של חלבון הדגל M cherry באזורים ספציפיים של המוח המתפתח. בצעו הכלאה של דגים בוגרים ההם הטרוזיגוטים להסבסה הטרנסגנית עם דגים מסוג פרא (wild type) כדי להפיק כ-50% צאצאים טרנסגניים.

כעת טפלו עוברים טרנסגניים ב-100 micromolar של phenyl threa, החל משש עד שמונה שעות לאחר ההפריה, כדי לחסום את היווצרות הפיגמנט ולהקל על הדמיה פלואורסצנטית. ב-24 עד 28 שעות לאחר ההפריה, העבירו את העוברים למי ביצים ללא PTU, ותחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, זהו את העוברים הטרנסגניים על ידי ביטוי של M cherry במיקרוגל. הכינו תמיסה של 0.5% של low melting point aros בבuffer אלקטרופורציה בתוספת trica, ולאחר מכן השילו את התמיסה.

באינקובטור בטמפרטורה של 34 עד 37 מעלות צלזיוס, הניחו טיפה גדולה, כ-500 מיקרוליטר של תמיסת ה-agro, במרכזו של צלח פטרי בן 60 מילימטר. באמצעות פינצטה עדינה, הסירו את קרומי הכוריון מעוברים טרנסגניים. העבירו את העוברים ששוחררו לצלח פטרי המכיל תמיסר electroporation עם 0.02% תרופה מאבשת trica למשך שתי דקות.

כעת העבירו שישה עד שמונה עוברים מורדמים לטיפה המוכנה של aros באמצעות קצות פיפטת מיכאל לודר חתוכים. מקמו את העוברים כך שכולם יפנו לאותו כיוון ויהיו מיושרים בשורה אנכית. קבעו את העוברים במקומם על ידי הקשאה של ה-aros באמצעות צלחת פטרי גדולה המכילה שני עד שלושה מילימטרים של קרח.

הצפו את הצלחת בבופר אלקטרופורציה בתוספת trica, וודאו שהתמיסה מכסה לחלוטין את טיפת ה-aros שהתגבשה. הכינו את פלסמיד הביטוי המזוהה של GFP המpurified עם צבע פנול אדום להזרקה. כעת הכינו פיפטות למיקרו-הזרקה באמצעות טיפ של מיקרו-לוודר.

הוסיפו מיקרוליטר אחד עד שניים של תמיסת פלסמיד DNA לפבטת ההזרקה, ולאחר מכן התקינו והדקו את פבטת הטעינה במחזיק הפבטות של מערכת ההזרקה בלחץ. שחררו בועות מהפבטה הטעונה על ידי הכנסה מהירה דרך נייר ניגוב (Kimwipe) טבול, עד שדחפי הלחץ יגרמו לשחרור ראשון (POF) של תמיסת ה-DNA האדומה, כאשר הפבטה מופנית לעבר הקצה הקדמי של המוח המפתח. ההריצו את תמיסת ה-DNA לפלסמיד אל תוך הפקעוlets (ventricles) של המוח המפתח באמצעות הזרקה בלחץ.

דוחף את ה-DNA לסמוך למיקום הצפוי של הפחית הריחית (olfactory bulb). מזריקים DNA עד שצבע אדום נראה בבירור בקצה הקדמי של פרוזמורן המוח (forebrain ventricle). עוברים מיד לשלב האלקטרופורציה כדי למנוע דיפוזיה ודילול של ה-DNA.

הגדירו את המעבּר SD nine להפקת פולסי אלקטרופורציה בודדים באורך five millisecond. במתח של 70 volts. מקמו את האלקטרודות כך שהאלקטרודה החיובית תהיה סמוכה לקצה הפנימי של העובר, בעוד שהאלקטרודה השלילית תהיה מאחורי ראש העובר.

הפעילו ידנית שמונה פולסים של אלקטרופורציה באמצעות לחיצה בודדת על מתג המכשיר SD nine stimulator, כאשר כל פולס מופרד ברווח של שנייה אחת. אפשרו לעוברים להתאושש למשך 10 דקות לפחות.

כעת, בעזרת פינצטה עדינה, עקבו בעדינות אחר מתאר העובריים תוך הימנעות ממגע ממשי עם העוברים עצמם. לאחר מכן, שחררו את העוברים מהאגרס (agros). החזירו את העוברים למי ביצים, ואחסנו אותם בטמפרטורה של 28 degrees Celsius עד לניתוח של ביטוי GFP.

העבירו את העוברים למי ביצים בתוספת 0.02% תמיסת חומר הרדמה trica למשך מספר דקות כפי שנעשה קודם לכן, אך במרכזו של צלחת פטרי קטנה יותר בקוטר 35 מילימטר. הוסיפו טיפה גדולה של תמיסה בריכוז 0.5% של agarose בנקודת התכה נמוכה ומי ביצים בתוספת trica. כעת העבירו עובר אחד שהורדם לתוך טיפת ה-agarose באמצעות קצוות של פ핍טות micro loader חתוכות.

מקם את העוברי במצב זקוף כדי לאפשר תצפית גבית על המוח המתפתח תחת מיקרוסקופ זקוף. הקשה את ה-aros על קרח והשתמש בקצות טיפים של micro loader חתוכים כדי לשמור על אוריינטציית העובר. לבסוף, מלא את הצלחת במי ביצים בתוספת trica, תוך וידוי שהתמיסה מכסה לחלוטין את טיפת ה-aro המוצקה.

דוגמה זו משלבת את הרזולוציה הזמנית של אלקטרופורציה in vivo עם ביטוי ספציפי לסוג תאים המתווך על ידי קווי טרנסגניים של enhancer trap כדי להתמקד בבצלול הריח המתפתח. קו ה-enhancer trap הטרנסגני מראה ביטוי קונסטיטוטיבי של m cherry ו-calt A ארבע במוח האחורי, בדגיאליום, ארבע במוח ובבצלול הריח בעוברים חמישה ימים לאחר ההפריה. באופן משמעותי, ארבעה ימים לאחר האלקטרופורציה, התאים המבטאים GFP מראים שלוחות אקסוניות טיפוסיות של תאי מיטראל בבצלול הריח.

השוואה זו של אותים מ-M Cherry והחשיפה הנמוכה יותר של GFP מוכיחה כי גופי תאים המבטאים GFP אכן ממוקמים בבצילוולחית (olfactory bulb) באמצעות מבני RNA בעלי לולאה קצרה (short hairpin RNA). ניתן להשתמש בהליך זה גם כדי להשריות אובדן תפקוד בסוגי תאים ספציפיים של המוח המתפתח.