חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להציג שיטה מהימנה לחקירת תגובות תנועתיות של תאי שיער חיצוניים (OHC), כולל אלקטרו-מוטיליות, מוטיליות איטית וכיפוף בתדרים אקוסטים. הדבר משיג תחילה על ידי קצירת עצמות הרקה מחזירי חול, עכברים או בעלי יונקים אחרים, ופתיחת ה-bulla כדי לחשוף את השבלול (cochlea). השלב השני הוא טבילת השבלול ב-Lebovits L 15, הסרת האזור האפיקלי של הקליפה העצמית, הרצועה הספירלית ו-straw of vais, והסרת איבר קורטי (organ of Corti).

לאחר דגירה של חמש דקות של איבר קורטי (organ of Corti) במיליגרם אחד למילליליטר collagenase, הוא מועבר לתא ההקלטה באמצעות מזרק Hamilton של 50 µL, והתאים מופרדים על ידי הזרמה חוזרת (refluxing) דרך המחט. לאחר מכן, תא ההקלטה מועבר למיקרוסקופ לצורך גירוי של התאים באמצעות שדה חשמלי חילופי חיצוני והקלטת וידאו של התגובות התנועתיות של תאי שערה חיצוניים מבודדים באמצעות מצלמה במהירות גבוהה. לבסוף, ניתן להעריך תאי שערה חיצוניים, תא, אלקטרו-מוטיליות, מוטיליות איטית וכיפוף בתדרים אקוסטיים באמצעות ניתוח תמונות מ komputer.

התחילו את הפרוצדורה על ידי קצירת עצמות הרקה מחזירי חול, עכברים או מודלים ממאיים אחרים. לאחר מכן, פתחו את עצמות הרקה באמצעות קוצץ (nipper). כדי לחשוף את השבלול, הסירו בעדינות את עודפי העצם תוך שמירה על שלד העצם של השבלול שלם, ושקעו אותו ב-L 15.

תחת המיקרוסקופ, פתח את האזור האפיקלי של השבלול. הסר את ה-dryer, ה-VASIs והרצועה הספירלית באמצעות קצה של להב סקלפל, פינצטה דקיקה (micro point pick) או פינצטה עדינה. הסר את איבר קורטי מה-cochlear modis באמצעות הפינצטה.

בשלב הבא, הניחו את השבלול ב-1 mg/mL collagenase בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. אם נדרשים תאי שיער מהסיבובים הבסיסליים של השבלול, הסירו באמצעות פיקוד (pick) את המעטפת הגרמית המכסה את בסיס השבלול והפרידו את הספירלה מעצם הרקה באמצעות להב סקלפל. לפני הסרת איבר קורטי, העבירו את איבר קורטי לתא ההקלטה באמצעות מזרק Hamilton של 50 µL. לאחר מכן, בצעו דיסוציאציה לתאים על ידי הזרקה חוזרת (refluxing) דרך המחט.

להלן תרשים של מחולל השדה החשמלי החילופין החיצוני והקישורים למערכת לכידת התמונות, למעגלי הבקרה ולתוכנה שיושמה במיוחד בליבת ההנדסה של House Ear Institute. המערך הניסיוני ששימש בניסוי זה מורכב ממיקרוסקופ הפוך מסוג Axia vert 1 3 5 TV עם מערכת תאורה חלופית מבוססת LED ושני מיקרו-מניפולטורים אלקטרוניים. על המיקרוסקופ מותקנות שלוש מצלמות, בהן מצלמת Photron מהירה במיוחד הנשלטת על ידי מחשב, מדגם FastCam X 10 24 PCI, בעלת רזולוציה גבוהה הלוכדת תמונות בתדרים גבוהים של עד 100,000 FPS.

התמונות המסופקות על ידי המצלמה המהירה נצפות ישירות במסך המחשב. מצלמת CCD רגילה נוספת בפתח העינית מחוברת למסך ברזולוציה גבוהה. מצלמה דיגיטלית קונבנציונלית בפתח הקדמי מאפשרת לכידה של פריימים סטטיים; התוכנה המבית המופעלת באותו מחשב שולטת על ההדק של המצלמה המהירה, על מערכת התאורה ועל מתקן השדה החשמלי החילופי החיצוני.

שתי האלקטרודות, המורכבות משני חוטי כסף בעובי 0.25 millimeter עם מרחק קצות של 0.8 millimeters על מיקרו-מניפולטור חשמלי. לאחר מכן, יש לכייל את השדה החשמלי באמצעות אלקטרודה חיצונית. אלקטרודה זו מודדת את הפוטנציאל החשמלי בנקודות שונות ויוצרת מפה של השדה החשמלי.

אם תא שיער חיצוני בודד ומבודד ממוקם בין קצוות האלקטרודות כאשר הציר האורכי שלו מקביל לשדה החשמלי המשתנה המופעל, הוא נע תוך התארכות והתקצרות באותה תדירות של השדה החשמלי. לדוגמה, מוצג כאן תא המעורר בתדירות של 50 hertz ומוקלט ב-1000 פריימים לשנייה. התמונה הבאה מראה תא המעורר בתדירות של ארבעה kilohertz ומוקלט ב-18,000 פריימים לשנייה.

אם התא ממוקם בניצב לשדה, ניתן להבחין ולחקור סוג שונה של תגובת כיפוף של תא שיער חיצוני. תא זה, למשל, מתכופף כאשר הוא מעורר בתדר של 50 hertz באמצעות שדה חשמלי בניצב לציר האורכי שלו. תאי שיער חיצוניים עשויים להראות שינויים במבנה כמענה לגירוי שאינו חשמלי.

תגובה זו מכונה מוטיליות איטית וניתן לחקור אותה גם באמצעות טכניקה זו. בחרו גירויים שונים מבין ארבעת הפרוטוקולים השונים. הראשון הוא תדר בודד רציף.

שימו לב שניתן לבחור את מצב הגירוי, התדירות, האמפליטודה וסוג הגל, אשר מסומנים בעיגולים אדומים בתוכנת הבקרה המתוכננת באופן עצמאי. פרוטוקול הגירוי השני הוא תדירות בודדת בפרצי פעימות (bursted single frequency), שבה אורך הפרצים והמרווחים ביניהם ניתנים לכיוונון. הפרוטוקול השלישי הוא סריקה ליניארית (linear sweep), שבה התדירויות ההתחלתית והסופית ניתנות לכיוונון.

פרוטוקול הגירוי הרביעי הוא גירוי מרובה (multi stimulation), המאפשר שילוב של מצבי גירוי שונים. לאחר בחירת הפרמטרים המתאימים, תוכנת הבקרה מגדירה את המערכת ומאפשרת למפעיל להתחיל הקלטת וידאו מסונכרנת עם האור וגירוי תאים בלחיצה על כפתור בודד במסך המחשב. בסרטון זה, תאי שיער חיצוניים מבודדים מראים שינויים באורך או בקימור כאשר הם מגורים באמצעות שדה חשמלי חיצוני חילופי, אשר הוא מקבילי או רוחבי, בהתאמה, לציר האורכי שלהם.

תגובות של תאי שיער חיצוניים מנותחות באופן לא מקוון (offline) באמצעות פונקציית מעקב התכונות של תוכנת pro analysts; מוצג כאן תא שיער חיצוני שעבר גרייה בתדר של 50 hertz והוקלט ב-1000 פריימים לשנייה. התוכנה מספקת את המרחק בין שתי נקודות פריים אחר פריים, כפי שמוצג כאן במהלך התקצרויות התא. המרחק בין הנקודות שנבחרו בשיא, המסומן באדום כ-cuticular plate, ובבסיס התא, המסומן בירוק כ-basal pole, הוא קטן יותר והוא גדל עם התארכות התא; התוכנה מבצעת ניתוח פריים אחר פריים של השינויים באורכו של התא השיער החיצוני.

הפאנל בתחתית התמונה מציג את עקב התנועה. בדוגמה זו, אורך השינוי הכולל הוא כ-6.5 פיקסלים. להלן דוגמה המראה שניתן לזהות את קצה התא, וכי ניתן למדוד באופן אוטומטי את שטח החתך האופטי באמצעות פונקציית מעקב הקו (contour tracking) של תוכנת pro analys.

בניסוי זה, מיקרוספירות פוליסטירן מתווספות לתמיסת האמבט באופן אקראי ונצמדות בחוזקה לממברנת הפלזמה. ניתן לבחור מספר מיקרוספירות שונות בו-זמנית, והתוכנה יכולה לעקוב אחרי כולן באופן אוטומטי פריים אחר פריים. בדרך זו, ניתן לחלק את התאים למקטעים, ולהעריך את הניידות של כל מקטע באופן עצמאי.

על ידי בחירת המיקרוספירות הממוקמות בקצוות הלטרליים של התא, ניתן להעריך באופן עצמאי שינויים בתמונה באורך של כל סגמנט ושינויים בזווית של סגמנט אחד ביחס לשני. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע אותה תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

כמובן, נדרש זמן נוסף לצורך ניתוח לא מקוון (offline) של הסרטונים שהוקלטו. עם זאת, באמצעות תוכנה מתאימה, ניתן להשלים ניתוח זה בערך בתוך שלוש שעות נוספות לכל סרטון. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבחון תגובות תנועתיות של תאי שיער חיצוניים, כולל אלקטרו-מוטיליות (electromotility), תנועתיות איטית וכיפוף בתדרים אקוסטיים.