Name: חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: חקור תנועתיות תאי שיער חיצוניים באוזן התיכונה באמצעות גירוי שדה חשמלי מתחלף וצילום במהירות גבוהה. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של אלקטרומוטיליות וכיפוף בתדרים אקוסטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 Core המחקר, HEI. התוכן שלה הוא אך ורק באחריות הכותבים ואינם מייצגים בהכרח את הדעות הרשמיות של NIH או HEI. המחברים מצהירים שום סכסוך קיימים או פוטנציאליים של עניין.

1. בידוד של OHCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הליך זה על ידי קצירת עצמות הזמני של שרקנים, עכברים או מודל בבעלי חיים יונקים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לפתוח את עצמות הזמני באמצעות ניפר המכשפות על מנת לחשוף את השבלול, וכן לטבול אותם ליבוביץ L-15. הסרת עודף עצם בזהירות, תוך שמירה על מעטפת גרמית ללא פגע. בעוד שמדובר בהליך הכללי החלים על עצמות הזמני של כל מיני יונקים, שינויים קלים הטכניקה ייתכן שיהיה צורך בהתמודדות עם עצמות הזמני מבעלי חיים קטנים מאוד. אצל בעלי חיים בן בולה הוא מסויד בדרך כלל, מציגה סיבוך נוסף להליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תצפית Microscopical, לפתוח את האזור apical של שבלול ולהסיר vascularis stria והרצועות ספירלה באמצעות קצה של להב # 11 אזמל, נקודת מיקרו לקטוף פינצטה בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את איבר קורטי מן כישור שבלול באמצעות פינצטה, ושמתי אותו collagenase 1mg/ml ב-L-15 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם OHCs מתוך הופך הבסיס של שבלול יש צורך, להסיר את הקליפה גרמית המכסה את הבסיס של שבלול עם לבחור את, ולהפריד את הספירלה של העצם הטמפורלית באמצעות להב סכין המנתחים לפני הסרת איברים של קורטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת איברים של קורטי לתא הקלטה באמצעות מזרק 50 μL המילטון. לאחר מכן לנתק את התאים על ידי ריפלוקס דרך המחט. </li></ol> 2. ניסיוני ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרשים של גנרטור חשמלי חיצוני לסירוגין שדה (EAEF) ואת הקישורים שלהם עם מערכת ללכוד תמונה (איור 1). מעגלי הבקרה בוצעה במיוחד בבסיס הנדסה של האוזן בית המכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הניסוי נעשה שימוש בניסויים שלנו מורכב מיקרוסקופ Axiovert הפוכה 135TV (Zeiss, Thornwood, ניו יורק) עם מערכת מבוססי LED חלופה תאורה (הספק גבוה LED System-36AD3500, לייטספיד טכנולוגיות, קמפבל, CA), שני micromanipulators אלקטרוניים (Eppendorf "Patchman", גרמניה), מחשב שבשליטת גבוהה במיוחד מהירות Photron Fastcam X 1024 PCI המצלמה (Photron ארה"ב Inc) בנמל קלר מצלמת CCD נוסף קבוע בנמל trinocular. המצלמה Fastcam מסוגל ללכוד תמונות בתדרים גבוהים (עד 100.000 fps) ברזולוציה גבוהה (למשל, 1024 x 1024 פיקסלים על 1000 fps, 512 x 128 ב 10,000 fps, 384 x 96 ב 18,000 fps, וכן הלאה). התמונות שמספקת המצלמה במהירות גבוהה הם נצפו ישירות לצג המחשב, בעוד מצלמה CCD מחובר צג שונים. מערכת תאורה מבוססי LED עובד בשני מצבים שונים: צריכת חשמל נמוכה אנלוגי הספק גבוה דיגיטלית. כל הנהלים ראשוני (מיקום האלקטרודות, מיקום התא, פוקוס, וכו ') מבוצעים באמצעות מצב צריכת חשמל נמוכה אנלוגי. תאורה כוח גבוהה מופעל על ידי הצמצם של תריס המצלמה ואז כיבה ידי סגירת תריס, בהנחיית פיזור חום. תוכנה תוצרת בית, שפותחה גם על האוזן Core בית הנדסה המכון, פועל על אותו המחשב שולט על ההדק של המצלמה במהירות גבוהה, מערכת תאורה מבוססי LED, ואת EAEF. מצלמה קונבנציונאלי תמונה דיגיטלית בנמל מול מאפשר עדיין מסגרות לפי הצורך. (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות (שני 0.25 מ"מ בקוטר החוטים Ag עם המרחק קצה 0.8 מ"מ) מונעים לתפקיד באחת micromanipulators אלקטרוניים. עמדת אלקטרודות מנוטר ויזואלית באמצעות תמונה מיקרוסקופית, שינוי במישור המוקד של התמונה עולה כי האלקטרודות נגע בתחתית תא הניסוי. בתחילה, השדה החשמלי הוא מכויל באמצעות אלקטרודה חיצונית. אלקטרודה זו מודדת את הפוטנציאל החשמלי בנקודות שונות, יצירת "מפה" של שדה חשמלי. אם תא בודד ומבודד השיער החיצוני ממוקם בין קצות האלקטרודות עם מקביל לציר האורך שלה EAEF מיושם, זה יהיה מהלך מתארך וקיצור באותה התדירות של השדה החשמלי. אם התא ממוקם בניצב לשדה מסוג אחר OHC תגובה (כיפוף) ניתן להבחין וחקר. (איור 2 ב ') </li></ol> 3. EAEF גירויים לכידת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבעה פרוטוקולים גירוי שונים לבחירה (איור 3): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תדר אחד רציף (איור 3). שימו לב לסוג מצב גירוי, תדירות, משרעת הגל ניתן לבחור באמצעות תוצרת בית תוכנה מלאה (עיגולים אדומים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תדר בודד bursted (איור 3 ב). אורכו של התפרצויות הפערים בין פרץ גם הם לבחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטאטא ליניארי (איור 3 ג). תדרים התחלתי וסופי הם לבחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רב גירוי (איור 3 ד '). תדר יחיד וסוחף ליניארי ניתן לשלב בניסוי יחיד. לאחר בחירת הפרמטרים המתאימים, תוכנת בקרת התצורה של המערכת מאפשרת למפעיל ליזום אור מסונכרן הקלטת וידאו גירוי התא ידי לחיצה על לחצן יחידאת מסך המחשב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות נלכדים בפורמט AVI לניתוח נוסף בתדרים גבוהים. </li></ol> 4. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסרט זה, שני תאים מבודדים השיער החיצונית להראות שינויים באורך או עקמומיות כאשר הם מקבלים גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין כי הוא מקביל או משוכל, בהתאמה, על ציר האורך שלהם. (סרט # 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התגובות OHCs ניעתי מנותחים off-line באמצעות תוכנת ProAnalyst (Xcitex Inc, Cambridge, MA). "מעקב תכונה" לתפקד תוכנה זו מספקת את המרחק בין שתי נקודות מסגרת לפי מסגרת (איור 4). במהלך תא לקצר את המרחק בין נקודות שנבחרו (צלחת Cuticular; צבע אדום) שיא ובסיס של התא (מוט בסל; צבע ירוק) הוא קטן יותר, עולה עם התארכות התא. הסרט מראה את תוכנת ניתוח מסגרת לפי מסגרת השינויים באורך. הפאנל בתחתית התמונה מראה את עקבות של התנועה. בדוגמה זו, הכוללת את השינוי באורך כ 6.5 פיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> "קונטור מעקב" פונקציה בתוכנה ProAnalyst יכול לזהות קצה סלולריים באופן אוטומטי למדוד את השטח של החלק האופטי (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוליסטירן microspheres הוסיף לפתרון אמבטיה באקראי בתוקף לצרף הממברנה פלזמה (איור 6). Microspheres שונים ניתן לבחור בו זמנית, התוכנה יכולה לעקוב באופן אוטומטי אחר כל אחד מהם תמונה אחר תמונה. בדרך זו, התאים מתחלקים בחלקים ועל תנועתיות של כל מקטע הוערכו באופן עצמאי. (איור 6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי בחירה microspheres ממוקמת בשולי התמונה לרוחב של התא, שינויים באורך של כל פלח ושינוי זווית של כבוד קטע אחד על השני (כיפוף) יכול גם להעריך באופן עצמאי. (איור 6 ב) </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1. דיאגרמה של הגנרטור EAEF ואת הקישורים שלהם עם מערכת לכידת תמונה. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור תמונה) של הגדרת הניסוי. ב) פירוט של השלב מיקרוסקופ, עם הקריקטורות האלקטרודות לבין OHC יחיד להציב ביניהם עם ציר האורך שלו מקביל לשדה החשמלי. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. ממשק המשתמש) של התוכנה לשלוט תוצרת בית מוגדר גירוי יחיד בתדר. הפרמטרים שנבחרו בעיגול אדום. ב) ממשק המשתמש של התוכנה תוצרת בית שליטה מוגדר גירוי פרץ יחיד בתדר. ג) ממשק משתמש של תוכנה תוצרת בית שליטה מוגדרת לגירוי לטאטא לינארי. ד) ממשק משתמש של התוכנה לשלוט תוצרת בית מוגדר גירוי רב. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. בודד של OHC עם שתי נקודות שנבחר בבסיס (ירוק) לבין איפקס (אדום) של התא, בהתאמה, באמצעות "מעקב תכונה" פונקציה של התוכנה ProAnalyst. עקומת מתחת לתא מראה את השינויים התקופתיים של המרחק בין נקודות נבחרים הקשורים גירוי חשמלי. הזזת פס אנכי מסגרות שונות ניתן לבחור לניתוח בודדים. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. "מעקב קונטור" לתפקד ProAnalyst מזהה את קצה סלולריים באופן אוטומטי למדוד את השטח של החלק האופטי. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. Image) של שבויים OHC מבודדים מעוטרים פוליסטירן microspheres (למעלה), ואת אותה התמונה עם חמישה microspheres נבחרים בנפרד (התחתון). צבע שונה הוצב microsphere כל אחד, התקות שלהם יכול להיות בנפרד באופן אוטומטי על ידי מעקב אחר מסגרת מסגרת, ניתחו והשוו. ב) קטעים באורך שרירותי ניתן להגדיר על ידי בחירת פוליסטירן microspheres ממוקם בשולי התא, שינויים באורך של מגזרים אלה, כמו גם שינויים בכיוון של כבוד קטע אחד לאחרים (תא כיפוף) ניתן להעריך באופן אוטומטי על ידי מסגרת מסגרת עם תוכנת עיבוד תמונה. סרט 1. בידוד OHCs קביה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">לחץ כאן כדי לצפות וידאו</a> סרט 2. OHCs מקבילים בניצב EAEF מראה אופייני electromotility ותגובות כיפוף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">לחץ כאן כדי לצפות וידאו</a>

<ol><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li>
<li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li>
<li>Dallos, P., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin%2C+a+new+type+of+motor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prestin, a new type of motor protein.</a> Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).</li>
<li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cell+bending+in+an+external+electrical+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field.</a> Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).</li>
<li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+Prestin-Dependent+and+Prestin-Independent+Components+from+Complex+Motile+Responses+in+Guinea+Pig+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells.</a> Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).</li>
<li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin-dependent+and+prestin-independent+motility+of+guinea+pig+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells.</a> Hear Res. 208, 1-12 (2005).</li>
<li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable+cochlear+amplifier%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">The remarkable cochlear amplifier.</a> Hear Res. 266, 1-17 (2010).</li>
<li>Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+responses+of+cochlear+outer+hair+cells+stimulated+with+an+alternating+electrical+field%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field.</a> Hearing Research. , (2011).</li>
<li>Dallos, P., Evans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+outer+hair+cell+motility%3A+corrections+and+addendum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum.</a> Science. 268, 1420-1421 (1995).</li>
<li>Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dynamics+of+high-frequency+electromechanical+transduction+in+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility%3A+effects+of+the+membrane+filter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li>
<li>Inoué, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInou%C3%A9%2C+S+%22Video+Microscopy%22">Video Microscopy</a>. , Plenum Press. New York. (1986).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטת הניסוי המוצג כאן מאפשר לאמוד תגובות OHC ניעתי בטווח kHz ללא הגבלה כלשהי לתנועה של התא. פרוטוקולים שונים של גירוי, סמנים נוספים (microspheres), כמו גם שינויים בכיוון של התא ביחס השדה החשמלי, מאפשרים לחקור היבטים חדשים של תנועתיות OHC עם רמת הפירוט נגישים קודם לכן. שיטות אחרות, כגון אלו באמצעות photodiodes 9 או לייזר דופלר vibrometry 10, דורשים פיקוח הדוק של העמדה של התא. כאן, לעומת זאת, כל המדידות מתבצעות בין נקודות השייכות באותו תא, וכל תזוזה קשור רק שינ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> ליבוביץ L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase (סוג 4) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C5138 </td><td> 1mg/mL ב-L-15 </td></tr></tbody></table>

חקירות תנועתיות החיצונית cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs הם גלילי תאים הסנסורית ממוקם האיבר של קורטי, איבר השמיעה בתוך האוזן הפנימית יונקים. השם &quot;תאים שיער&quot; נובעת צרור apical האופיינית שלהם stereocilia, אלמנט קריטי עבור איתור התמרה של אנרגיה צליל 1. OHCs מסוגלים לשנות צורה, להאריך, לקצר, לכופף בתגובה גירוי חשמלי, מכני כימי, תגובת המנוע נחשב חיוני שבלול הגברה של אותות אקוסטיים 2. הגירוי גורם OHC ניעתי שתי תגובות שונות: i) electromotility, תנועתיות מהירה aka, שינויים באורך בטווח המיקרו נגזר חשמלית המונעת שינויים קונפורמציה בחלבונים מנוע בצפיפות בקרום פלזמה OHC, ו ב) תנועתיות איטית, משנה את צורתו ב אלפית שנייה כדי שניות טווח מעורבים מחדש cytoskeletal 2, 3. OHC כיפוף קשורה electromotility, והתוצאה גם מהפצת אסימטרית של חלבונים מנוע בקרום פלזמה לרוחב, או גירוי חשמלי אסימטרית של חלבונים אלה המנוע (למשל, עם שדה חשמלי הניצב לציר הארוך של התאים) 4. גירויים מכניים וכימיים לעורר תגובות ניעתי איטי בעיקרו, למרות שינויים בתנאי יוניים של תאים ו / או בסביבה שלהם יכול גם לעורר את הפלזמה קרום מוטבע מנוע חלבונים 5, 6. מאז התגובות OHC ניעתי הם מרכיב חיוני של המגבר שבלול, ניתוח איכותי וכמותי של התגובות הללו ניעתי בתדרים אקוסטי (בערך מ - הרץ 20-20 קילוהרץ בבני אדם) היא עניין חשוב מאוד בתחום של שמיעה המחקר 7. הפיתוח של טכנולוגיית הדמיה חדש המשלב מהירות גבוהה במצלמות וידאו, מערכות מבוססות LED תאורה, תוכנה מתוחכמת ניתוח התמונה עכשיו מספק את היכולת לבצע איכותי ואמין מחקרים כמותיים התגובה ניעתי של OHCs מבודד לשדה חשמלי חיצוני לסירוגין (EAEF) 8. זוהי טכניקה פשוטה ולא פולשנית אשר עוקף את רוב המגבלות של הגישות הקודמות 9-11. יתר על כן, מערכת תאורה מבוססי LED מספק בהירות קיצוני עם אפקטים תרמיים מבוטל על דגימות, ובשל השימוש במיקרוסקופ וידאו, רזולוציה אופטית הוא לפחות פי 10 יותר מאשר עם טכניקות קונבנציונאלי מיקרוסקופ אור 12. למשל, עם הגדרת הניסוי המתואר כאן, שינוי אורך התא של כ -20 ננומטר יכול להיות שגרתי זוהה באופן מהימן בתדירויות של 10 קילוהרץ, ועל החלטה זו ניתן לשפר עוד יותר בתדרים נמוכים. אנו בטוחים כי זו גישה ניסויית יסייע להרחיב את הבנתנו את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הסלולר תנועתיות OHC.

שיטה אמינה לחקור תא השיער החיצוניים (OHC) תגובות ניעתי, כולל electromotility, תנועתיות איטית כיפוף, הוא תיאר. תנועתיות OHC הוא שהושרו על ידי גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין, ואת השיטה מנצלת את הקלטת במהירות גבוהה התמונה, מבוססי LED תאורה, הדור האחרון התמונה תוכנת ניתוח.

חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה

תאי שיער חיצוניים (OHCs) הם תאי חישה-תנועה גליליים הממוקמים באיבר קורטי (Organ of Corti), איבר השמיעה בתוך האוזן הפנימית של יונקים. השם "תאי שיער" נגזר...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להציג שיטה מהימנה לחקירת תגובות תנועתיות של תאי שיער חיצוניים (OHC), כולל אלקטרו-מוטיליות, מוטיליות איטית וכיפוף בתדרים אקוסטים. הדבר משיג תחילה על ידי קצירת עצמות הרקה מחזירי חול, עכברים או בעלי יונקים אחרים, ופתיחת ה-bulla כדי לחשוף את השבלול (cochlea). השלב השני הוא טבילת השבלול ב-Lebovits L 15, הסרת האזור האפיקלי של הקליפה העצמית, הרצועה הספירלית ו-straw of vais, והסרת איבר קורטי (organ of Corti).לאחר דגירה של חמש דקות של איבר קורטי (organ of Corti) במיליגרם אחד למילליליטר collagenase, הוא מועבר לתא ההקלטה באמצעות מזרק Hamilton של 50 µL, והתאים מופרדים על ידי הזרמה חוזרת (refluxing) דרך המחט. לאחר מכן, תא ההקלטה מועבר למיקרוסקופ לצורך גירוי של התאים באמצעות שדה חשמלי חילופי חיצוני והקלטת וידאו של התגובות התנועתיות של תאי שערה חיצוניים מבודדים באמצעות מצלמה במהירות גבוהה. לבסוף, ניתן להעריך תאי שערה חיצוניים, תא, אלקטרו-מוטיליות, מוטיליות איטית וכיפוף בתדרים אקוסטיים באמצעות ניתוח תמונות מ komputer.התחילו את הפרוצדורה על ידי קצירת עצמות הרקה מחזירי חול, עכברים או מודלים ממאיים אחרים. לאחר מכן, פתחו את עצמות הרקה באמצעות קוצץ (nipper). כדי לחשוף את השבלול, הסירו בעדינות את עודפי העצם תוך שמירה על שלד העצם של השבלול שלם, ושקעו אותו ב-L 15.תחת המיקרוסקופ, פתח את האזור האפיקלי של השבלול. הסר את ה-dryer, ה-VASIs והרצועה הספירלית באמצעות קצה של להב סקלפל, פינצטה דקיקה (micro point pick) או פינצטה עדינה. הסר את איבר קורטי מה-cochlear modis באמצעות הפינצטה.בשלב הבא, הניחו את השבלול ב-1 mg/mL collagenase בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. אם נדרשים תאי שיער מהסיבובים הבסיסליים של השבלול, הסירו באמצעות פיקוד (pick) את המעטפת הגרמית המכסה את בסיס השבלול והפרידו את הספירלה מעצם הרקה באמצעות להב סקלפל. לפני הסרת איבר קורטי, העבירו את איבר קורטי לתא ההקלטה באמצעות מזרק Hamilton של 50 µL. לאחר מכן, בצעו דיסוציאציה לתאים על ידי הזרקה חוזרת (refluxing) דרך המחט.להלן תרשים של מחולל השדה החשמלי החילופין החיצוני והקישורים למערכת לכידת התמונות, למעגלי הבקרה ולתוכנה שיושמה במיוחד בליבת ההנדסה של House Ear Institute. המערך הניסיוני ששימש בניסוי זה מורכב ממיקרוסקופ הפוך מסוג Axia vert 1 3 5 TV עם מערכת תאורה חלופית מבוססת LED ושני מיקרו-מניפולטורים אלקטרוניים. על המיקרוסקופ מותקנות שלוש מצלמות, בהן מצלמת Photron מהירה במיוחד הנשלטת על ידי מחשב, מדגם FastCam X 10 24 PCI, בעלת רזולוציה גבוהה הלוכדת תמונות בתדרים גבוהים של עד 100,000 FPS.התמונות המסופקות על ידי המצלמה המהירה נצפות ישירות במסך המחשב. מצלמת CCD רגילה נוספת בפתח העינית מחוברת למסך ברזולוציה גבוהה. מצלמה דיגיטלית קונבנציונלית בפתח הקדמי מאפשרת לכידה של פריימים סטטיים; התוכנה המבית המופעלת באותו מחשב שולטת על ההדק של המצלמה המהירה, על מערכת התאורה ועל מתקן השדה החשמלי החילופי החיצוני.שתי האלקטרודות, המורכבות משני חוטי כסף בעובי 0.25 millimeter עם מרחק קצות של 0.8 millimeters על מיקרו-מניפולטור חשמלי. לאחר מכן, יש לכייל את השדה החשמלי באמצעות אלקטרודה חיצונית. אלקטרודה זו מודדת את הפוטנציאל החשמלי בנקודות שונות ויוצרת מפה של השדה החשמלי.אם תא שיער חיצוני בודד ומבודד ממוקם בין קצוות האלקטרודות כאשר הציר האורכי שלו מקביל לשדה החשמלי המשתנה המופעל, הוא נע תוך התארכות והתקצרות באותה תדירות של השדה החשמלי. לדוגמה, מוצג כאן תא המעורר בתדירות של 50 hertz ומוקלט ב-1000 פריימים לשנייה. התמונה הבאה מראה תא המעורר בתדירות של ארבעה kilohertz ומוקלט ב-18,000 פריימים לשנייה.אם התא ממוקם בניצב לשדה, ניתן להבחין ולחקור סוג שונה של תגובת כיפוף של תא שיער חיצוני. תא זה, למשל, מתכופף כאשר הוא מעורר בתדר של 50 hertz באמצעות שדה חשמלי בניצב לציר האורכי שלו. תאי שיער חיצוניים עשויים להראות שינויים במבנה כמענה לגירוי שאינו חשמלי.תגובה זו מכונה מוטיליות איטית וניתן לחקור אותה גם באמצעות טכניקה זו. בחרו גירויים שונים מבין ארבעת הפרוטוקולים השונים. הראשון הוא תדר בודד רציף.שימו לב שניתן לבחור את מצב הגירוי, התדירות, האמפליטודה וסוג הגל, אשר מסומנים בעיגולים אדומים בתוכנת הבקרה המתוכננת באופן עצמאי. פרוטוקול הגירוי השני הוא תדירות בודדת בפרצי פעימות (bursted single frequency), שבה אורך הפרצים והמרווחים ביניהם ניתנים לכיוונון. הפרוטוקול השלישי הוא סריקה ליניארית (linear sweep), שבה התדירויות ההתחלתית והסופית ניתנות לכיוונון.פרוטוקול הגירוי הרביעי הוא גירוי מרובה (multi stimulation), המאפשר שילוב של מצבי גירוי שונים. לאחר בחירת הפרמטרים המתאימים, תוכנת הבקרה מגדירה את המערכת ומאפשרת למפעיל להתחיל הקלטת וידאו מסונכרנת עם האור וגירוי תאים בלחיצה על כפתור בודד במסך המחשב. בסרטון זה, תאי שיער חיצוניים מבודדים מראים שינויים באורך או בקימור כאשר הם מגורים באמצעות שדה חשמלי חיצוני חילופי, אשר הוא מקבילי או רוחבי, בהתאמה, לציר האורכי שלהם.תגובות של תאי שיער חיצוניים מנותחות באופן לא מקוון (offline) באמצעות פונקציית מעקב התכונות של תוכנת pro analysts; מוצג כאן תא שיער חיצוני שעבר גרייה בתדר של 50 hertz והוקלט ב-1000 פריימים לשנייה. התוכנה מספקת את המרחק בין שתי נקודות פריים אחר פריים, כפי שמוצג כאן במהלך התקצרויות התא. המרחק בין הנקודות שנבחרו בשיא, המסומן באדום כ-cuticular plate, ובבסיס התא, המסומן בירוק כ-basal pole, הוא קטן יותר והוא גדל עם התארכות התא; התוכנה מבצעת ניתוח פריים אחר פריים של השינויים באורכו של התא השיער החיצוני.הפאנל בתחתית התמונה מציג את עקב התנועה. בדוגמה זו, אורך השינוי הכולל הוא כ-6.5 פיקסלים. להלן דוגמה המראה שניתן לזהות את קצה התא, וכי ניתן למדוד באופן אוטומטי את שטח החתך האופטי באמצעות פונקציית מעקב הקו (contour tracking) של תוכנת pro analys.בניסוי זה, מיקרוספירות פוליסטירן מתווספות לתמיסת האמבט באופן אקראי ונצמדות בחוזקה לממברנת הפלזמה. ניתן לבחור מספר מיקרוספירות שונות בו-זמנית, והתוכנה יכולה לעקוב אחרי כולן באופן אוטומטי פריים אחר פריים. בדרך זו, ניתן לחלק את התאים למקטעים, ולהעריך את הניידות של כל מקטע באופן עצמאי.על ידי בחירת המיקרוספירות הממוקמות בקצוות הלטרליים של התא, ניתן להעריך באופן עצמאי שינויים בתמונה באורך של כל סגמנט ושינויים בזווית של סגמנט אחד ביחס לשני. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע אותה תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.כמובן, נדרש זמן נוסף לצורך ניתוח לא מקוון (offline) של הסרטונים שהוקלטו. עם זאת, באמצעות תוכנה מתאימה, ניתן להשלים ניתוח זה בערך בתוך שלוש שעות נוספות לכל סרטון. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבחון תגובות תנועתיות של תאי שיער חיצוניים, כולל אלקטרו-מוטיליות (electromotility), תנועתיות איטית וכיפוף בתדרים אקוסטיים.

investigating-outer-hair-cell-motility-with-combination-external

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Whole-cell-clamp תיקון הקלטות של עצב השמיעה דנדריטים סיבים בבית סינפסה סרט פנימי תא שיער שבלול יונקים.

הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

סרטון זה מדגים את ההקלטה המשולבת של פלט afferent מגורה מכנית ותיוג מסוף עצבי בזקיקי השיער של פינת עכבר. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בגירוי מכני של קצות העצבים של זקיקי השערה לפני ואחרי חשיפה לצבע פלואורסצנטי של קרום השיער, רישום אלקטרופיזיולוגי של פוטנציאלי הפעולה שנוצרו, והדמיה של תיוג מסוף העצבים בזקיקי השיער.

הקלטה משולבת של תפוקת Afferent מגורה מכנית ותיוג מסוף עצבי בזקיקי שיער עכבר

מקור: Lukasz, D., et al. הדמיית סידן in vivo של תאי שיער בקו הרוחב בדג זברה זחל. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים הדמיה חיה של זרם סידן בתאי השיער בקו הצדדי של זחל דג זברה טרנסגני משותק באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. גירוי מכני של צרורות שיער באמצעות פולסים נוזליים גורם לכניסת סידן דרך תעלות מכניות ותעלות מגודרות מתח, אשר מוצגות בזמן אמת באמצעות מחווני פלואורסצנטיות. השיטה מדגישה את הדינמיקה של סידן אפיקלי ובסיסי בתאי שיער נוירומסטים, ומבהירה את תפקידם בזיהוי תנועת מים.

הדמיית דינמיקת סידן בתאי שיער בקו הרוחב של דג זברה זחל

ניתוח של תפקוד תא שיער שיווי משקל הוא מסובך בשל מיקומם העמוק בתוך החלק הקשה ביותר של הגולגולת, העצם הטמפורלית petrous. רוב מחקרי תא שיער פונקציונליים השתמשו בחריפות תאי שיער מבודד. כאן אנו מתארים הכנה למחצה שלמה של האפיתל שיווי משקל עכבר למחקרי מיקרוסקופיה אלקטרו ושני פוטונים.

הכנה חצי שלמות מבודדת של האפיתל החושית שיווי משקל העכבר למיקרוסקופיה שני הפוטונים אלקטרופיזיולוגיה והרזולוציה גבוהה

במחקר זה, טכניקה מיקרוסקופית מפורטת של אור עברה אופטימיזציה לתצפית וניתוח בזמן אמת של התנועה של CPEC cilia ex vivo יחד עם שיטה מיקרוסקופית אלקטרונית לניתוח אולטרה-מבני.

תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת<em&gt; Ex Vivo</em

מוצגת טכניקה פשוטה וחדשנית לרישום פריקה אפרנטית עקב גירוי מכני של מסופי lanceolate של קצות ה-palisade המעצבבים את עור אוזן העכבר, זקיקי שיער.

הקלטה משולב של תוויות מסוף פלט ועצב מבחינה מכנית מאולצת מביא ב Endings עכבר זקיק השיער אזמלי

כאן אנו מתארים הכנה חדשה להדמיית מסופים חושיים חיים של קצות מעקה המעצבבים את זקיקי השיער של עור אוזן העכבר במהלך צביעה והימנעות בצבעי סטיריל פירידיניום.

ניטור אופטי של תיוג מסוף העצב חיים זקיק השיער אזמלי Endings של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עור אוזן עכבר

של הצפרדע האמריקנית (רנא catesbeiana) sacculus מתיר בדיקה ישירה של פיזיולוגית שיער תאים. כאן לנתיחה וההכנה של sacculus הצפרדע ללימודי biophysical מתוארת. אנחנו מראים ניסויי נציג מתאי שיער אלה, לרבות חישוב יחס כוח-העקירה של צרור והמדידה של התנועה המאולצת שלה.

הכנה פיזיולוגית של תאי שיער מן Sacculus של הבוקסר האמריקאי (<em&gt; רנא catesbeiana</em&gt;)

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי להקליט התגובה גזע המוח של עכברוש לאחר הלידה הגורים. לבחון התפתחות תפקודית של תאים שיער החיצוני, ההליך ניסיוני של קלאמפ תיקון שלם-תא הקלטה בתאים מבודדים שיער החיצוני מתואר צעד אחר צעד.

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

דג זברה היא מערכת מודל יש תכונות רבות ערך כולל בהירות אופטית, התפתחות חיצוני מהירה,, חשוב במיוחד בתחום השמיעה ושיווי, מבחוץ ממוקם תאי שיער חישה. מאמר זה מתאר כיצד הטרנסגניים דג זברה יכול לשמש כדי assay שיער-תא mechanosensation ותפקוד presynaptic בוססו.

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מיקרוסקופיית מוליכת היונים של בדיקה מקפיצה (HPICM), טכניקת בדיקה סריקה ללא מגע המאפשרת הדמיה ננומטרית של חבילות סטריאציליה בתאי שיער שמיעתיים חיים.

הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים

חקור תנועתיות תאי שיער חיצוניים באוזן התיכונה באמצעות גירוי שדה חשמלי מתחלף וצילום במהירות גבוהה. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של אלקטרומוטיליות וכיפוף בתדרים אקוסטיים.

חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה

גלה סרטונים נוספים