מערכת תרבית פרוקסימלית: טכניקת תרבית חוץ גופית לחקר איתות פרקריני בין תאים

באיתות פרקריני, תאים מייצרים ומפרישים מולקולות איתות הגורמות לתגובות בתאים שכנים. כדי לחקות איתות פרקריני, התחל בהכנת תרחיפים חד-תאיים של תאי סרטן השחלות ותאי מזותל במדיום המתאים להם.

לאחר מכן, קח תוספת קרומית נקבובית הפוכה בצלחת תרבית סטרילית. השליכו את תרחיף התאים הסרטניים על המשטח התחתון של קרום ההכנסה ליצירת כיפה נוזלית. דגירה כדי לאפשר לתאים להתיישב ולהיצמד לממברנה.

הפוך את התוספת כדי לנקז את המדיה. העבירו את התוספת לתבנית תרבית טרייה המכילה אמצעי גידול כדי להזין את תאי הסרטן המודבקים למשטח התחתון של הממברנה. כעת, הוסף את תרחיף תאי המזותל לבאר התוספת. דגירה כדי לאפשר לתאים להיצמד לצד הנגדי של הממברנה, ולהכחיש כל מגע ישיר בין שני סוגי התאים.

במהלך התרבית, שני סוגי התאים מפרישים גורמי איתות. מולקולות אלה מתפזרות דרך הממברנה הנקבובית לעבר התאים השכנים. הם נקשרים לקולטני תאים ספציפיים וגורמים למפלי איתות מורכבים בשני סוגי התאים.

התחל בניתוק תאי סרטן השחלות מתערובת משולבת של 80% עם 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין למשך 40 עד 60 שניות, ולאחר מכן נטרול התגובה עם 6 מיליליטר של מצע גידול מלא. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ומשרים את הגלולה ב -5 מיליליטר של מצע גידול שלם טרי.

לאחר הספירה, יש לדלל את התאים ל-100,000 תאי סרטן שחלות למיליליטר של ריכוז מדיום גידול מלא, ולהניח שלוש תוספות תרבית תאי ממברנה פוליקרבונט הפוכות בגודל 0.4 מיקרומטר שטופלו בתרבית רקמה לכל מצב ניסוי בצלחת תרבית רקמה סטרילית בגודל מתאים. סמנו את התוספות בהתאם לתנאי הניסוי, והעבירו בזהירות את התאים הסרטניים לתחתית כל תוספת במעגלים קונצנטריים, החל מאמצע הממברנה ונעים החוצה, ליצירת כיפה של 800 מיקרוליטר.

היזהר מאוד בעת זריעת התאים על המשטח התחתון של התוסף כך שכיפתם של התאים המכילים מדיום לא תברח מקצוות התוסף במהלך הדגירה.

לאחר שכל התוספות נזרעו, מכסים את הכלי ומניחים בזהירות את התוספות לתוך חממת תרבית התאים. לאחר כ -4 שעות, נתק את ה- HPMC עם 2 מיליליטר של 0.25% טריפסין למשך דקה עד שתיים, ולאחר מכן נטרול התגובה עם 12 מיליליטר של מדיום גידול מלא.

אסוף את ה-HPMC על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מצע גידול שלם לספירה. לדלל את התאים ל-300,000 HPMC למיליליטר של מצע גידול מלא ולהוסיף 2.5 מיליליטר של מצע גידול שלם טרי לכל באר של צלחת תרבית בת 6 בארות.

בעזרת מלקחיים סטריליים, הנח כל תוספת בצד ימין כלפי מעלה לכל באר של צלחת 6 הבארות כך שהמשטחים המחוברים לתאי סרטן השחלות התחתונים יהיו שקועים במדיה. לאחר מכן, זרעו 1.5 מיליליטר של HPMC לבאר של כל תוספת והניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך 72 שעות.

• Paracrine Signaling - Cellular communication through secreted molecules affecting neighboring cells.
• Mesothelial Surface - The membrane where the mesothelial cells adhere and function.
• Culture System - Set-up where cells are grown under controlled conditions, often in vitro.
• Corning 10-013-CV - Specific type of culture dish used for cell adhesion and growth experiments.
• In Vitro Cell Culture Techniques - Methods used to cultivate cells in controlled environments outside of the living organism.

• Introduce Paracrine Signaling – Paracrine signaling is the process by which cells communicate and influence the behavior of neighboring cells via secreted molecules (e.g., paracrine).
• Key Concepts - We can simulate this biological process in an in vitro cell culture system using human mesothelial cells and cancer cells (e.g., culture system).
• Underlying Mechanisms - Both cell types secret signaling factors which bind to receptors and trigger complex responses (e.g., mesothelial surface).
• Connect to Experiment - To study this, cells are cultivated on either side of a porous membrane in a culture dish (e.g., corning 10-013-CV).

• What is paracrine signaling and how does it work in an in vitro culture system?
• How are mesothelial and cancer cells cultured for this study?
• What are the key concepts and mechanisms underlying paracrine signaling?

• Practical Applications - Understanding paracrine signaling could improve diagnosis and treatment of diseases like cancer (e.g., in vitro cell culture techniques).
• Industry Impact - The knowledge acquired is beneficial for the medical and pharmaceutical sectors (e.g., culture system).
• Societal Importance - The broader implications extend to improving patient outcomes and quality of care (e.g., mesothelial surface).
• Link to Scientific Advancements - The use of in vitro cultivation techniques continues to advance our understanding of cell communication (e.g., corning 10-013-CV).