בדיקת פינוי מזותל: טכניקה במבחנה לכימות יכולת הפלישה של ספרואידים של סרטן השחלות לחד-שכבות של תאי מזותל

במהלך גרורות של סרטן השחלות, תאים ממאירים מתנתקים מאתר הגידול הראשוני ומתחילים להסתובב בתוך חלל הצפק. תאים אלה יכולים ליצור אשכולות או ספרואידים הנצמדים לתא המזותליאלי חד-שכבתי המצפה את חלל הצפק. ככל שהגידול גדל, הוא מנקה את תאי המזותל הבסיסיים כדי להקל על הפלישה.

כדי לדגמן פינוי מזותל, התחל בזריעת תאים מזותליים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP לצלחת תרבית עם תחתית זכוכית מצופה פיברונקטין. ציפוי הפיברונקטין מספק מטריצה המקדמת הצמדת תאים. דגרו את המנה כדי לאפשר לתאי מזותל להתפשט וליצור שכבה חד-שכבתית.

לאחר מכן, העבירו תרחיף של ספרואידים של תאי סרטן השחלות המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום אל החד-שכבה המזותלית. דמיין את התרבית למשך זמן ממושך באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי דולג זמן. הספרואידים האדומים-פלואורסצנטיים ישקעו וייצמדו לחד-שכבת המזותל הירוקה-פלואורסצנטית.

תאי הסרטן מפעילים כוח על תאי המזותל, משבשים את צמתי התאים ומשנים את שלמות שכבת המזותל. הכוח גם עוקר את תאי המזותל הבסיסיים, ויוצר חור. בחרו קביעת מסנן GFP מתאימה כדי להציג את החור שנוצר כשטח שחור בתמונה. מדוד את החלל כדי לכמת את מידת המרווח המזותלי.

כדי להתחיל בהליך זה, יש לצפות מראש את הבארות של צלחת MatTek עם תחתית זכוכית עם 6 בארות עם פיברונקטין. מוסיפים 2 מיליליטר תמיסת פיברונקטין / PBS לכל באר של המנה ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. תאי המזותל הירוקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי, ליצירת חד-שכבת תא מזותל, מתורבתים במדיום בסיס של 10%. נסה צלחת של תאים מזותליים וסובב כלפי מטה בצנטריפוגה שולחנית ב-900 סל"ד למשך שלוש דקות.

שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש תאים במדיום בסיס של 10%. התאימו לריכוז הרצוי עם 10% מדיום בסיס. לאחר השלמת הדגירה של פיברונקטין של 30 דקות של צלחת MatTek, יש לשטוף את הבארות עם 2 מיליליטר PBS. שאפו את ה- PBS והצלחת 6 פעמים 10 לתאי המזותל החמישיים לבאר בכל באר של צלחת MatTek בת 6 בארות. דגרו את צלחת ה-MatTek בחממת תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר לתאי המזותל להיצמד לצלחת וליצור שכבה אחת.

השתמש בפיפטה כדי לאסוף את הספרואידים של סרטן השחלות מהצלחת המצופה פולי-HEMA בעלת 96 בארות. שאפו את המדיום מבאר אחת של צלחת MatTek בת 6 בארות המכילה חד-שכבת תאים מזותלית. יש לשטוף פעם אחת עם 2 מיליליטר PBS. הוסף את כל הכדורים מצלחת 96 הבארות לבאר אחת של צלחת MatTek. זה בערך פי שלושה ממספר הספרואידים שיצולמו כדי להסביר את הכדורים הנוחתים על החלק של המנה שלא ניתן לצלם.

מכיוון שאנו רוצים לצלם רק כדור אחד לכל שדה ראייה, יש להימנע מצבירה של הספרואידים. נדנדו את המנה בעדינות מצד לצד כדי לפזר את הכדורים באופן שווה על פני החד-שכבתי לפני שהם מתחברים.

הנח את צלחת MatTek על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל שדה רחב הפוך המסוגל לבצע הדמיית זמן-lapse למשך שמונה שעות לפחות. השתמש בבמה ממונעת כדי לדמות מיקומים מרובים בצלחת, עם אירועי אינטרקלציה ספרואידים מרובים, בניסוי אחד. הספרואידים של תאי סרטן השחלות ישקעו בתחתית הצלחת וייצמדו לחד-שכבת התא המזותלית. אסוף תמונות GFP, RFP ופאזה של 20 פלוס אינטראקציות ספרואיד/חד-שכבתיות כל עשר דקות למשך שמונה שעות.