Agarose Spin Down Assay: טכניקה להטמעת אורגנואידים לניתוח היסטולוגי

תרביות אורגנואידים תלת מימדיות של תאים סרטניים מסכמות מאפיינים פתופיזיולוגיים רבים של סרטן אנושי. לפיכך, תרביות מבחנה אלה מהוות מודל מצוין לחקר הסרטן.

לעיבוד אורגנואידים אלה, התחל בתרבית של אורגנואידים תלת מימדיים שנוצרו מראש הגדלים במטריצת קרום מרתף מתאימה. הוסף מדיום התאוששות תאים רצוי ודגירה. המדיום מקל על הדה-פולימריזציה של ג'ל המטריקס, ומשחרר את האורגנואידים התלת-ממדיים לתמיסה.

צנטריפוגה את התערובת הזו כדי לגלול את האורגנואידים. אמצעי השחזור שמכיל את רכיבי המטריצה נשאר בסופרנטנט. השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף תמיסת פרפורמלדהיד לכדור האורגנואיד. הכימיקל נכנס לתאי האורגנואידים ונקשר לחומצות האמינו, וגורם לקישור צולב של חלבון ולקיבוע דגימה. שלב זה חיוני לכל יישום היסטולוגי במורד הזרם.

גלולה את האורגנואידים כדי להפריד ולהסיר את הסופרנטנט המכיל פרפורמלדהיד. הוסף אגרוז מומס חם לאורגנואידים. השתמש במחט כדי לנתק ולפזר את האורגנואידים הגלולים לתוך האגרוז הנוזלי. אפשר לאגרוז להתמצק ולהטמיע את האורגנואידים. השתמש בתקע האגרוז המכיל אורגנואידים לבדיקות היסטולוגיות במורד הזרם.

כדי לעבד את האורגנואידים להיסטולוגיה, הסר את המדיה הקיימת מהבאר תוך הקפדה לא לשאוב את כיפות קרום המרתף. הוסף נפח שווה של תמיסת התאוששות תאים ודגר את הצלחת למשך 60 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, עקרו את כיפת קרום המרתף בעזרת פיפטה ומעכו אותה בעזרת קצה הפיפטה. אסוף את הכיפה המנותקת ואת תמיסת התאים לשחזור לתוך צינור של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורה של 300 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז הסר את הסופרנטנט והניח אותו בצד.

שמור את כל הסופרנטנט עד לשלב הסופי בו תאושר נוכחותם של אורגנואידים. הוסף את הנפח הרצוי של PBS קר וצנר בעדינות למעלה ולמטה כדי לעקור את הכדור באופן מכני מבלי לשבש את האורגנואידים. חזור על הצנטריפוגה והסר את הסופרנטנט.

תקן את הגלולה בנפח תואם של 4% PFA למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, חזור על שלב הצנטריפוגה ושטיפת PBS. לאחר מכן, הוסיפו לאט 200 מיקרוליטר של אגרוז חם של 2% ומיד אך בעדינות נתקו את כדור התא מדופן הצינור מבלי להפריע לו באמצעות מחט בגודל 25 המחוברת למזרק של 1 מיליליטר.

עבור שיטת הספין דאון של אגרוז, זה קריטי לנתק את כדור התא מדופן הצינור מיד לאחר הוספת אגרוז באמצעות מחט בגודל 25.

לאחר שהאגרוז התמצק לחלוטין, נתק אותו מהצינור בעזרת מחט בגודל 25 המחוברת למזרק של 1 מיליליטר והעביר אותו לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. מלאו את הצינור ב-70% אתנול והמשיכו בפרוטוקול הקונבנציונלי לייבוש רקמות והטמעת פרפין.

• Spin-down - A process to separate substances of different densities by centrifugation.
• Organoid paraffin embedding - A technique to preserve biological tissues in paraffin wax.
• Cell recovery solution - A solution used to dissociate cells from a matrix for further analysis.
• Agar embedding - A method to preserve tissue samples in an agarose gel block.
• Agarose embedding protocol - A detailed procedure for encasing biological samples in agarose.

• Introduce Spin-down – A method utilized to separate different-density particles by centrifugal force (e.g., spin-down).
• Key Concepts – Overview of tissue sample preservation techniques such as paraffin and agar embedding (e.g., organoid paraffin embedding).
• Underlying Mechanisms – Description of the procedure to detach and process organoids (e.g., cell recovery solution).
• Connect to Experiment – Explanation of the importance of proper organoid and agarose handling in the experiment.

• What is the spin-down technique and how is it applied in the procedure?
• How does organoid paraffin embedding contribute to tissue preservation?
• What role does cell recovery solution play during the dissociation of organoids?

• Practical Applications – Spin-down and embedding techniques in biological and medical research (e.g., spin-down).
• Industry Impact – Areas like pathology and histology benefit from these methods (e.g., organoid paraffin embedding).
• Societal Importance – Advancement in disease diagnosis and treatment (e.g., cell recovery solution).
• Link to Scientific Advancements – Development of improved tissue preservation and analysis methods.