מיצוי חלבון ליזט: טכניקה לליז אורגנואידים לאיסוף חלבונים תאיים

ליזאט תאים, או הנוזל המכיל תכולת תאים ליזים, מוצא יישום בתהליכים במורד הזרם כמו מיצוי חלבונים וניתוחים. חקר השברים האלה חושף מידע על המאפיינים והתפקודים של התאים.

להכנת ליזטים של חלבון אורגנואיד, התחל בתרבית של אורגנואידים הגדלים במטריצת קרום בסיס רצויה. הסר את מדיה התרבות המושקעת מהצלחת. הוסף מדיה חמה המכילה פרוטאזות מעל המטריצה. פיפט שוב ושוב כדי לעקור את המטריצה מהצלחת.

דגרו את התערובת. האנזימים הפרוטאוליטיים במדיה מפרקים את המטריצה ומשחררים את האורגנואידים לתמיסה. צנטריפוגה את הדגימה כדי להפריד אורגנואידים מהסופרנטנט המכיל אנזים.

השעו מחדש את גלולת האורגנואיד במאגר ליזה חלבוני מתאים. דגירה של הדגימה. חומרי הניקוי במאגר משבשים את קרומי התאים של האורגנואידים, ומשחררים תוכן תוך-תאי לתמיסה. במקביל, מעכבי החלבון במאגר משביתים כל אנזימי פרוטאז ופוספטאז ששוחררו, ומונעים פירוק של חלבוני הסובסטרט שלהם.

יתר על כן, סוניקציה של התערובת כדי לשבש את התאים לחלוטין. המעטפת הגרעינית נקרעת ומשחררת חלבונים גרעיניים לתמיסה. הגלים הקוליים גם גוזזים את חומצות הגרעין המשתחררות, ומונעים מהן לזהם את החלבון ליזאט.

כדי לאסוף אורגנואידים, פוצצו שוב ושוב את ג'ל המטריצה על ידי פיפטינג של 1 מיליליטר של מדיה המכילה דיספאז מחוממת מראש ישירות על טבעת ג'ל המטריצה עד שהטבעת כולה נעקרת. העבירו את תערובת האורגנואידים של ג'ל מטריקס שנעקרה לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר עיכול מלא, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוסף תמיסת מלח עם חוצץ פוספט לכדור האורגנואיד והשהה מחדש על ידי תנועה עדינה.

גלולה את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר והסר את הסופרנטנט באמצעות מיקרופיפטה. השעו מחדש את כדורי האורגנואידים ב-100 מיקרוליטר של מאגר ליזה חלבוני לכל 10 מיקרוליטר של נפח תא ארוז. החלק כדי להשהות. כעת, סוניקציה של האורגנואידים על ידי טבילת צינורות בקרח רטוב ומריחה עדינה של קצה המפרק הקולי על החלק החיצוני של צינור המיקרו-צנטריפוגה. סוניקציה למשך 40 שניות ב-20 קילו-הרץ לפני שתמשיך לכתמים מערביים עם פרוטוקולים שנקבעו.