הדמיה אימונופלואורסצנטית בהרכבה מלאה: טכניקת תיקון וצביעה להערכת אורגנואידים שלמים

אורגנואידים של הערמונית מהווים בעיקר שכבה חיצונית של תאי אפיתל בסיסיים ושכבות פנימיות של תאי אפיתל לומינליים המסודרים סביב לומן מרכזי.

הדמיה שלמה מאפשרת מחקר של אורגנואידים תלת מימדיים שלמים תוך שמירה על המורפולוגיה וההטרוגניות שלהם. כדי להתחיל לצבוע, יש לטפל באורגנואידים עם קיבוע מתאים כדי לנעול את רכיביהם התאיים במקומם, ובכך לשמר אותם. שטפו את הדגימה כדי להסיר עודפי קיבוע.

דגירה עם קוקטייל של תמיסת חסימה וצבע מכתים DNA. חלבונים בתמיסה החוסמת נקשרים באופן פסיבי לאתרים לא ספציפיים של התאים ומפחיתים כל צביעת רקע. במקביל, הצבע הצבוע ב-DNA מכתים את גרעיני התאים.

הוסף שתי קבוצות של נוגדנים ראשוניים המכוונים לאנטיגנים ספציפיים המתבטאים על ידי שתי אוכלוסיות התאים המרכיבות. דגירה עם שני נוגדנים משניים שונים מצומדים בצבע פלואורסצנטי הנקשרים לנוגדנים הראשוניים. שטפו את הדגימה כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

טבלו את האורגנואידים המוכתמים ברצף בריכוזים הולכים וגדלים של תמיסות סוכר המכילות פעילי שטח כדי לשפר את שקיפות הרקמות מבלי לפגוע בארכיטקטורת האורגנואידים. טיפול זה משפר את עומק ההדמיה של הדגימה.

הרכיבו את האורגנואידים על מגלשת מיקרוסקופ הנושאת מרווחים כדי לשמר את המורפולוגיה התלת-ממדית שלהם בזמן ההדמיה. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לצפות בפליטות הקרינה מאוכלוסיות התאים הבסיסיות והלומינליות המסודרות סביב הלומן המרכזי.

כדי לבצע צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה של אורגנואידים בערמונית, ראשית, הוסף 500 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS. דגרו את האורגנואידים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. לאחר שטיפת הגלולה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הוסף 1 מיקרוגרם למיליליטר של כתם DAPI בתמיסת חסימה ודגירה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. הגן על הדגימה מפני אור במהלך הדגירה משלב זה ואילך. לאחר צנטריפוגה של האורגנואידים כמו קודם, יש להוסיף נוגדנים ראשוניים ותמיסת חסימה ולדגור למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בניעור עדין.

גלולה שוב את האורגנואידים ושטוף את הגלולה עם 1 מיליליטר PBS למשך 15 דקות בניעור עדין. חזור על הליך כביסה זה פעמיים. לאחר מכן, הוסיפו נוגדן משני ותמיסת חסימה ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין. לאחר הדגירה, גלולה את האורגנואידים ושטוף את הגלולה פעמיים נוספות. הוסף 1 מיליליטר של 30% סוכרוז ב-PBS עם 1% טריטון X-100 לאורגנואידים הגלולים. לאחר מכן, דגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.

לאחר כדור האורגנואידים שוב, הוסיפו 1 מיליליטר של 45% סוכרוז ב-PBS עם 1% טריטון X-100 ונערו בעדינות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חזור על ההליך למעט הוספת 1 מיליליטר של 60% סוכרוז ב-PBS עם 1% טריטון X-100. גלולה את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב-800 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר והסר 95% מהסופרנטנט. התבונן בכדור תחת אור UV כדי לוודא שהוא לא אבד במהלך הסרת הסופרנטנט. הכדור הופך רופף יותר ככל שריכוז הסוכרוז הופך גבוה יותר. העבירו 10 עד 20 מיקרוליטר מהמתלה הנותר לכיסוי תא והמשיכו למיקרוסקופיה קונפוקלית.