JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:45 דק' • April 30th, 2023
אוטופגיה היא תהליך תוך-תאי המאפשר פירוק של רכיבים ואברונים ציטופלזמיים לא רצויים בתוך תאי עיכול מיוחדים הנקראים ליזוזומים. כדי להעריך אוטופגיה, התחל בתרבית דבקה של תאי סרטן הערמונית המבטאים חלבוני סמן אוטופאגי הנקראים LC3 בשילוב עם חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים.
מטבעם, לתאי סרטן הערמונית חסר האנזים ארגינינוסוקסינט סינתאז הדרוש לסינתזה של חומצות אמינו ארגינין. תאים אלה, אם כן, תלויים בתוספי ארגינין חיצוניים באמצעות מדיה להישרדות והתפשטות.
לאחר מכן, טפל בתאים באמצעות ארגינין דימינאז או ADI. ADI מבצע הידרוליזה של ארגינין חופשי במדיה, מה שמוביל לדלדול ארגינין. כתוצאה מכך, התאים עוברים לחץ מטבולי, ומתחילים תגובה אוטופאגית פנימית. במקביל, טפלו בתאים בצבע פלואורסצנטי אדום שמסמן ליזוזומים בתוך התאים.
במהלך אוטופגיה, מבנים קרומיים בצורת הנקראים פגופורים מתאספים סביב הרכיבים הציטופלזמיים הפגועים. בסופו של דבר, הם מתרחבים ואוטמים את המטען שלהם תוך כדי צימוד עם חלבוני סמן אוטופאגיים LC3 ליצירת שלפוחיות כפולות או אוטופאגוזומים. חלבוני LC3 מספקים גם תגים פלואורסצנטיים לאוטופאגוזומים. לאחר מכן השלפוחיות מתמזגות עם ליזוזומים ליצירת אוטוליזוזומים. פרוטאזות ליזוזומליות בתוך האוטוליזוזומים מפרקות את הרכיבים התאיים הנבלעים.
בזמן אמת, התבונן בפלואורסצנטיות הבהירה מאוטופאגוזומים וליזוזומים כדי לקבוע את התפלגותם בתוך התאים.
כדי להתחיל, גדל תאי סרטן ערמונית אנושיים המבטאים שרשרת אור ירוקה מצומדת חלבון פלואורסצנטי 3 על צלחות תרבית תחתית זכוכית מצופות פולי-D-ליזין בגודל 35 מילימטר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
התאים צריכים להיות מצופים בצפיפות מספקת כדי להקל על התפשטות מהירה, אך לא עד כדי כך שהתאים גדלים יתר על המידה ומתגבשים בזמן ההדמיה. טפל בדגימות תאים נבחרות עם ארגינין דאמינאז, או ADI, ב-PBS כדי לרוקן תאים של ארגינין חופשי ולגרום ללחץ מטבולי בתאי הסרטן.
כשעה לפני ההדמיה, יש לדלל 1.5 מיקרוליטר של LysoTracker Red ב-20 מיליליטר של RPMI המכיל 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה. הכן פתרונות עם ADI עבור הדגימות שנבחרו שטופלו.
לאחר חימום כל המדיה ל -37 מעלות צלזיוס, הוסף את המדיה המתאימה לכל מנת תרבות. דגרו תאים עם RPMI המכיל LysoTracker Red למשך 15 עד 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
כ-30 דקות לפני ההדמיה, הפעילו את המתחם הסביבתי של תחנת מזג האוויר ואפשרו שיווי משקל ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. שטפו תאים עם PBS והחליפו מדיה ב-RPMI סטנדרטי המכיל רק 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה.
הוסף ADI לדגימות כפי שמצוין. הרכיבו צלחות תרבות תחתית זכוכית בגודל 35 מילימטר במתאם מותאם אישית. השתמש בשמן טבילה בהגדלה של פי 60, עדשת אובייקטיבית עם צמצם מספרי של 1.42, ומקם את צלחת התרבות המותקנת על במת המיקרוסקופ.