מיצוי חלבונים ופרוטאוליזה: שיטה לקבלת חלבונים מדגימות רקמת גידול הערמונית והעיכול האנזימטי שלהם לפפטידים

התחל עם דגימת רקמת גידול בערמונית. השעו אותו במאגר ליזה מקורר כדי ליזום ליזה של תאים. השתמש בהומוגנייזר כדי לפרק עוד יותר את מבני הרקמה ולשחרר את המרכיבים התוך תאיים שלהם. סוניקציה של הדגימה על קרח כדי להבטיח ליזה מלאה של תאים וגזירה של ה-DNA כדי למנוע הפרעות במהלך עיבוד הפפטיד. מחממים את הליזאט כדי לשבש את המבנה השלישוני של החלבונים ולהיפתח.

חומרי ההפחתה במאגר מבקעים את קשרי הדיסולפיד בין שאריות ציסטאין. לאחר מכן, חומרי האלקילציה במאגר אלקילט חופשיים קבוצות תיול של ציסטאין מופחת כדי למנוע רפורמציה של קשר דיסולפיד. חומרי הדנטטורציה הנוספים במאגר מקלים על דנטורציה מבוקרת ועל התפתחות נוספת של חלבונים.

צנטריפוגה כדי לגלול את פסולת הרקמות וכל המזהמים. אספו את הסופרנטנט המכיל את תערובת החלבון בשפופרת טרייה. הוסף אנזים ליזיל אנדופפטידאז כדי לבקע את קשרי הפפטיד בחלבונים בקצה C של שאריות ליזין, וליצור פפטידים גדולים. יתר על כן, טפל עם האנזים טריפסין כדי לבקע את קשרי הפפטיד בקצה C של שאריות ליזין וארגינין וליצור פפטידים קטנים יותר. מעבירים את התערובת ליחידת פילטר צנטריפוגלית.

צנטריפוגה כדי לאפשר לפפטידים המעוכלים לחדור דרך נקבוביות קרום המסנן ולהיאסף כזרימה. כל שברים גדולים יותר נשארים כשמירה.

כדי לקצור רקמת גידול, שקלו את הגידול, ובתרבית, הוסיפו 2 מיליליטר של מאגר ליזה קר כקרח לכל 100 מילי