אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:21 דק׳ • April 30th, 2023
כדי לבודד ולטהר פפטידים, התחל בתרחיף של ליזט חלבון המכיל תערובת של פפטידים מעוכלים.
טפל בתערובת בחומצה טריפלואורואצטית או מגיב מבוסס TFA. מגיב אניוני או טעון שלילי זה יוצר קומפלקס זוג יונים עם שאריות בסיסיות או טעונות חיובית על פפטידים, ובכך מסווה את המטען שלהם ומשפר את ההידרופוביות של הפפטידים.
כעת, הרכיבו כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב הפוך, או RP-HPLC, עמודה המכילה פאזה נייחת נקבובית מבוססת סיליקה, משותקת עם ליגנדים הידרופוביים לא קוטביים. הוסף מאגר שיווי משקל תואם פפטיד לעמודה כדי להכין את השלב הנייח לפני יישום המדגם.
כעת, טען את הדגימה המחומצת לעמודה. בתוך העמודה, הפפטידים ההידרופוביים נספגים באופן סלקטיבי לליגנדים ההידרופוביים של השלב הנייח. הפעל מאגר כביסה דרך העמודה כדי לסלק חלקיקים לא קשורים או לא רצויים.
לאחר מכן, העבירו מאגר פליטה אורגני פחות קוטבי, עם הידרופוביות גבוהה, דרך העמודה. בשל זיקתם הסלקטיבית למאגר הפליטה, הפפטידים הקשורים נספגים ממטריצת העמודה.
אסוף את הפליטה המכילה פפטיד מהעמודה. ליופיליזציה של האלואט כדי להסיר את תכולת המים ולקבל אבקה יבשה של פפטידים טהורים ויציבים.
כדי להחמיץ את הדגימה, הוסף כ-20 מיקרוליטר של 5% חומצה טריפלואורואצטית, או TFA, למיליליטר ליזאט. מערבבים היטב את הצינור ומשתמשים ברצועת pH כדי למדוד את ה-pH. במידת הצורך, הוסף תוספת של 5% TFA כדי להתאים את ה-pH ל-2.5. לאחר מכן, חבר לקצה הקצר יותר של עמוד C18 לסעפת ואקום. לאחר הגדרת הוואקום בין 17 ל -34 kPa, השתמש ב -3 מיליליטר של 100% אצטוניטריל ופיפטה מזכוכית כדי להרטיב את העמוד.
אזנו את העמודה באמצעות פיפטת זכוכית והחלת שתי אליקוטים של 3 מיליליטר של 0.1% TFA. לאחר מכן, טען את הדגימה המחומצת על העמודה. השתמש בשלושה נפחים של 3 מיליליטר של 0.1% TFA כדי לשטוף את העמוד. לאחר מכן, יש למרוח 2 מיליליטר של 40% ACN, 0.1% TFA כדי לחסל את הדגימה ולאסוף שני שברים של 2 מיליליטר לתוך צינורות תרבית זכוכית. בעזרת פרפילם, כסו את צינורות הפליטה, והשתמשו במחט בגודל 20 כדי לנקב שלושה עד חמישה חורים לתוך המכסה לפני ליופיליזציה של הדגימות למשך הלילה.