העשרת פוספופפטידים: טכניקת משקעים חיסוניים מבוססת נוגדנים להפרדת פפטידים זרחניים ספציפיים מתערובות פפטידים מורכבים

זרחון של שאריות חומצות אמינו ספציפיות, כמו טירוזין, מייצר פוספופפטידים הממלאים תפקידים קריטיים בוויסות מספר מסלולי איתות תאיים. חקירתם מאפשרת זיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לטיפול בסרטן.

כדי לבודד פוספופפטידים, התחל עם אבקה ליופילית של עיכול פפטידים מטוהרים המופקים מרקמת סרטן. השעו מחדש את האבקה במאגר מתאים להכנת תרחיף פפטיד אחיד. שמרו על pH ניטרלי כדי להבטיח יציבות פפטידים.

הכן תרחיץ המורכב מחרוזי הידרוג'ל מצומדים לנוגדנים אנטי-פוספופפטידים ספציפיים במאגר הרצוי. הוסף את תמיסת החרוזים לתרחיף הפפטיד. הנוגדנים המשותקים על החרוזים מזהים ונקשרים לשאריות חומצות האמינו הזרחניות הספציפיות שלהם בתוך הפוספופפטידים, ויוצרים קומפלקסים.

צנטריפוגה את התערובת כדי לאסוף את קומפלקסי הפוספופפטיד-חרוזים בגלולה. הסר את הסופרנטנט המכיל פפטידים לא קשורים או פוספופפטידים לא ספציפיים. הוסף מאגר פליטת pH נמוך מתאים למתחמים ודגירה. ה-pH הנמוך מחליש את האינטראקציה בין שאריות הפוספופפטידים לקומפלקסים של נוגדנים-חרוזים, ומשחרר את הפפטידים לתמיסה.

מעבירים את התערובת למחסנית פילטר שהורכבה מראש. צנטריפוגה כדי להוציא את הפוספופפטידים המשוחררים לתוך צינור האיסוף. רכז ואקום את הדגימה בטמפרטורה גבוהה כדי להסיר את המאגר ולקבל גלולה יבשה מרוכזת של פוספופפטידים טהורים.

השעו מחדש את האבקה הליופילית עם 0.5 מיליליטר של משקעים חיסוניים קרים כקרח, או IP, מאגר מחייב בכל שבר. העבירו את נפח ההשעיה של 0.5 מיליליטר מהשבר השני לצינור עם השבר הראשון ושמרו את קצה הפיפטה. השתמש בעוד 0.5 מיליליטר של מאגר IP כדי לשטוף כל צינור ליופיליזציה לפני העברת התוכן לצינור הקריאופיליזציה. לאחר מכן, חזור על השטיפה באמצעות 2 מיליליטר של מאגר IP.

לאחר שימוש ב-P200 עם קצה חתוך כדי להעביר את מלאי ה-0.5 מיליגרם למיליליטר של תמיסת חרוזי נוגדנים לצינור המיקרופוגה, הוסף 450 מיקרוליטר של מאגר קשירת IP קר כקרח כדי לשטוף 50 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי נוגדנים 4G10 ו-25 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי נוגדנים 27B10.4 בצינור מיקרופוגה. צנטריפוגה את הצינור בחום של 100 x גרם ו -4 מעלות צלזיוס למשך דקה. לאחר שאיבת הסופרנטנט, הוסף נפח שווה לתרחיץ המקורי של מאגר קשירת IP כדי להשעות מחדש את החרוזים. הוסף חרוזי pY שטופים מראש לתמיסת הדגימה המושעה בצינורות הקריו של מכסה הבורג. לאחר מכן, דגרו אותם ב-4 מעלות צלזיוס על מסובב מקצה לקצה למשך הלילה. לאחר סיבוב החרוזים, שמור את הסופרנטנט, שישמש להעשרת פפטידי pST.

לאחר מכן, השתמש ב-300 מיקרוליטר של מאגר קשירת IP כדי להשעות מחדש את החרוזים ולהעביר אותם לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מיליליטר. סובב את הדגימות ב-100 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. לאחר מכן, עם 500 מיקרוליטר של מאגר כריכת IP, שטפו את החרוזים שלוש פעמים. שוטפים את החרוזים ארבע פעמים עם 450 מיקרוליטר של 25 מ"מ אמוניום ביקרבונט, pH 7.5. טבלו קצה טעון ג'ל מעט מתחת לפני השטח של החרוז ושאבו לחלוטין את הסופרנטנט. הוסף פי ארבעה מנפח החרוזים של 0.1% TFA לחרוזים.

לאחר מכן, מערבבים אותם היטב ומדגרים את הצינור בתרמו-מיקסר ב-1,000 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. העבירו את המתלה למסנן סיבוב של 0.2 מיקרומטר, וצנטריפוגה את המסנן ב-850 x גרם למשך דקה אחת. לאחר העברת הפליטה לצינור מיקרוצנטריפוגה קושר חלבון נמוך, רכז בוואקום את הפליטה ליובש ב-40 מעלות צלזיוס עם זמן חום של 300 דקות למשך הלילה.