העשרה על בסיס טיטניום דו-חמצני של פוספופפטידים: שיטה לבידוד סלקטיבי של פוספפטידים מספריית הפפטידים:

פוספופפטידים הם מחרוזות קצרות של חומצות אמינו המכילות שאריות סרין, תראונין או טירוזין זרחניות. כדי לבודד פוספופפטידים מתערובת פפטידים, התחל בלקיחת חרוזי טיטניום דו חמצני בשפופרת. שיווי משקל כדי לרכך את החרוזים באמצעות מאגר קשירה מחומצן מתאים המכיל חומר מרווה. הוסף את הריכוז הרצוי של תערובת הפפטידים לתמיסת החרוזים.

דגרו את התערובת בניעור מתמשך כדי למנוע מהחרוזים להתייצב. המצב החומצי מקדם את קבוצת הפוספט של פוספופפטידים ליצירת קשרי קואורדינטות עם חרוזי טיטניום. חומר המרווה במאגר מפחית כל קשירה לא ספציפית של פפטידים שאינם זרחניים לחרוזים, ומשאיר אותם בתרחיף.

צנטריפוגה כדי לגלול את החרוזים הקשורים לפוספופפטיד, בעוד שהפפטידים הלא זרחניים נשארים בסופרנטנט. השליכו את הסופרנטנט. העבירו את החרוזים הקשורים לפוספופפטיד לעמודת מסנן ספין שהורכבה מראש. צנטריפוגה להסרת מאגר הקישור ולכידת החרוזים המצומדים לפוספופפטיד.

העבירו את המסנן לצינור נקי והוסיפו תמיסה המכילה אמוניה. אמוניה הופכת את התרחיף לבסיסי, וגורמת לפוספופפטידים להתנתק מהחרוזים. צנטריפוגה את המכלול כדי לחסל ולאסוף את הפוספופפטידים הלא קשורים. חרוזי הטיטניום הדו חמצני נשארים במחסנית המסנן. יבש את הפוספופפטידים כדי להסיר עקבות אמוניה.

הכינו מראש את הטיטניום הדו-חמצני ב-500 מיקרוליטר של 100% ACN פעמיים. לאחר מכן, התנו את הטיטניום הדו-חמצני ב-500 מיקרוליטר של מאגר נתרן פוספט 0.2 M, pH 7, פעמיים. לבסוף, השתמש ב-300 מיקרוליטר של מאגר שיווי משקל כדי לשטוף את החרוזים שלוש פעמים. הוסף 400 מיקרוליטר של 50% ACN, 0.1% TFA לצינור קושר החלבון הנמוך. לאחר מכן, הוסיפו 84 מיקרוליטר חומצה לקטית.

העבירו את הפוספופפטידים המרחפים לתוך הצינור הנמוך הקושר חלבון ודגרו אותם בטמפרטורת החדר באמצעות מסובב קצה על קצה למשך שעה. לאחר גלולת החרוזים, השתמש ב -300 מיקרוליטר של מאגר שיווי משקל כדי לשטוף אותם פעמיים ולסובב אותם כלפי מטה. עם 300 מיקרוליטר של מאגר שטיפה, שטפו את החרוזים פעמיים. לאחר מכן, העבירו אותם למסנן ספין של 0.2 מיקרומטר.

לאחר הסיבוב, העבירו את יחידת המסנן לצינור נקי של 1.5 מיליליטר קושר חלבון נמוך, ועם 200 מיקרוליטר של 0.9% אמוניום במים, יש להוציא את התכולה פעמיים. לאחר בדיקת ה-pH, יש לרכז בוואקום את ה-eluate ליובש למשך הלילה כדי לאדות את האמוניה.

• Phosphopeptides - Short strings of amino acids that contain phosphorylated residues.
• Titanium Dioxide Beads - Used to isolate phosphopeptides from a peptide mix.
• Peptide Mix - A mixture of peptides used in protein analysis and research.
• Phosphopeptide Enrichment Kits - Toolkits developed for isolating and enriching phosphopeptides.
• TFA Buffer - A solution used to stabilize pH, often used in biochemistry and molecular biology.

• Introduction to Phosphopeptides - Essential constituents in protein analysis and research (e.g., phosphopeptides).
• Usage of Titanium Dioxide Beads - They isolate phosphopeptides from a peptide mix (e.g., titanium phosphate).
• Role of Phosphopeptide Enrichment Kits - Helps isolate and enrich phosphopeptides (e.g., massprep phosphopeptide enrichment kits).
• Connection to Experiment – The process of isolating and enriching phosphopeptides is central to this study.

• What is the role of phosphopeptides in a peptide mixture?
• How do titanium dioxide beads help in isolating phosphopeptides?
• What is the purpose of phosphopeptide enrichment kits in this experiment?

• Description of Practical Applications – Isolating phosphopeptides has broad applications in protein analysis and research (e.g., peptide mix).
• Identification of Industry Impact – This process is beneficial in various sectors that heavily rely on biochemistry and molecular biology (e.g., healthcare).
• Highlighting Societal Importance – Having a deeper understanding of protein analysis and research paves the way for biological advancements (e.g., sustainability).
• Link to Scientific Advancements – The innovative techniques used to isolate phosphopeptides helps advance our understanding of proteins.